馬瑟蘭葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)變化的轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：【目的】探究釀酒葡萄品種馬瑟蘭果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的品質(zhì)變化，挖掘關(guān)鍵的生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)品質(zhì)調(diào)控基因，為馬瑟蘭葡萄栽培措施的精準(zhǔn)制定和果實(shí)品質(zhì)提高提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳再R蘭山東麓馬瑟蘭葡萄為試驗(yàn)材料，采集花后20 d、花后45 d、花后75 d及花后100 d不同發(fā)育階段的葡萄果實(shí)，測(cè)量果粒橫徑和縱徑，測(cè)定果實(shí)可溶性固形物、總糖、可滴定酸和總酚含量，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析?！窘Y(jié)果】隨著馬瑟蘭葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果實(shí)色澤加深、果粒體積增大，果實(shí)可溶性固形物和總糖含量逐漸上升，可滴定酸含量逐漸下降，總酚含量在花后20 d至花后75 d期間逐漸下降而在花后75 d至花后100 d期間略有上升。從不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)間共篩選到33517個(gè)DEGs，花后45 d與花后20 d比較組、花后75 d與花后45 d比較組、花后100 d與花后75 d比較組共有的DEGs為3976個(gè)。GO功能注釋分析結(jié)果表明，各比較組DEGs主要注釋到細(xì)胞器、細(xì)胞膜、含蛋白復(fù)合物、細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程等功能條目。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果表明，氨基酸的生物合成、糖酵解/糖異生及類黃酮生物合成等是馬瑟蘭葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的重要信號(hào)通路。從富集在類黃酮生物合成信號(hào)通路的DEGs中，發(fā)現(xiàn)查耳酮合成酶基因（CHS）和黃烷酮-3-羥化酶基因（F3H）均在花后45 d至75 d期間上調(diào)表達(dá)，F(xiàn)3H在花后75 d至花后100 d期間下調(diào)表達(dá)，表明CHS與F3H基因在馬瑟蘭葡萄果皮著色中起重要調(diào)控作用。【結(jié)論】馬瑟蘭葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中伴隨著果實(shí)色澤加深、果粒體積增大和生化成分的動(dòng)態(tài)變化。類黃酮生物合成信號(hào)通路在葡萄轉(zhuǎn)色過(guò)程中起重要作用，CHS和F3H基因影響馬瑟蘭葡萄果實(shí)著色及品質(zhì)形成。

關(guān)鍵詞：馬瑟蘭；釀酒葡萄；果實(shí)品質(zhì)；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

中圖分類號(hào)：S663.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）08-2310-10

Transcriptome analysis of growth，development，and quality changes in Marselan grape berries

FU Guang-qing LIU Jia-ning YANG Yu-xian WANG Bo REN Yan-hua SHANGGUAN Ling-fei FANG Jing-gui ZHANG Jun-xiang3*，WANG Xi-cheng1*

（1Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014，China；2College of Horticulture，NanjingAgricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China；3College of Enology and Horticulture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 75002 China）

Abstract：【Objective】The study aimed to study the quality changes during the berry growth and development of wine grape variety Marselan，and to identify key genes regulating growth，development，and berry quality，providing theoreti-cal basis for the precise formulation of cultivation practices and the improvement of berry quality.【Method】Marselan grapes from the eastern foothills of Helan Mountain were used as experimental materials.Grape berries were collelddplbVYT8wxK9Rgvxo3Fm3ABqUaULeMQa6tFwO3d3A=cted at 20，45，75 and 100 d after flowering at different developmental stages.The transverse and longitudinal diameters of the berries were measured，and the contents of soluble solids，total sugar，titratable acid and total phenolics were determined.Transcriptome sequencing analysis was also conducted.【Result】As the Marselan grape berries developed，their color deepened and berry size increased.The berry soluble solid content and total sugar content gradually rose，while the titrata-ble acid content gradually decreased.The total phenolic content decreased from 20 d to 75 d after flowering，but slightly increased between 75 d and 100 d after flowering.A total of 33517 DEGs were identified among grape berries at different developmental stages，with 3976 DEGs shared between the comparison groups of 45 d after flowering versus 20 d after flowering，75 d after flowering versus 45 dafter flowering，and 100 d after flowering versus 75 d after flowering.The re-sults of GO functional annotation analysis showed that the DEGs in each comparison group were mainly annotated to func-tional categories such as organelles，cell membranes，protein-containing complexes，cellular processes and metabolic pro-cesses.The results of KEGG signaling pathway enrichment analysis showed that amino acid biosynthesis，glycolysis/glu-coneogenesis and flavonoid biosynthesis were important signaling pathways during the development of Marselan grape berries.Among the DEGs enriched in the flavonoid biosynthesis signaling pathway，it was found that the chalcone syn-thase gene（CHS）and flavanone-3-hydroxylase gene（F3H）were up-regulated from 45 d to 75 d after flowering and down-regulated from 75 d to 100 d after flowering，suggesting that the CHS and F3H genes played important regulatory roles in the coloration of Marselan grape skin.【Conclusion】The growth and development of Marselan grapes are accom-panied by the deepening of fruit color，enlargement of berry size，and dynamic changes in biochemical components.The flavonoid biosynthesis signaling pathway plays an important role in the color transition process of grapes，and the CHS and F3H genes have influence on the coloration and quality formation of Marselan grape berries.

Key words：Marselan；wine grape；berry quality；transcriptome sequencing

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2019YFD1002500）；Ningxia Key Research and Development Project（2023BCF01001）

0引言

【研究意義】賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的環(huán)境氣候條件十分有利于釀酒葡萄品質(zhì)的形成（宋希賢等，2019），是最適宜種植釀酒葡萄和釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的產(chǎn)區(qū)之一。馬瑟蘭葡萄（Vitis vinifera cv.Marselan）原產(chǎn)于法國(guó)，是世界知名釀酒葡萄品種，有抗菌、耐旱、糖度高等特點(diǎn)，因獨(dú)特的品質(zhì)深受消費(fèi)者青睞（郭志君等，2023）。目前，寧夏的馬瑟蘭葡萄種植面積近2800 ha，占全國(guó)馬瑟蘭葡萄種植總面積的65%以上；寧夏釀酒葡萄種植面積3.5萬(wàn)ha，約占全國(guó)釀酒葡萄種植總面積的35%（陳光宇，2023）。因此，開(kāi)展賀蘭山東麓馬瑟蘭釀酒葡萄品質(zhì)特征分析，對(duì)提高該產(chǎn)區(qū)葡萄與葡萄酒辨識(shí)度、促進(jìn)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄的適應(yīng)性較強(qiáng)，但在不同生態(tài)區(qū)域的發(fā)育特點(diǎn)存在差異，果實(shí)品質(zhì)也有一定差異，這些差異是影響各產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)格的主要因素（Ilieva et al.，2016；許澤華等，2023）。葡萄果實(shí)在收獲時(shí)的生化組成，包括在成熟過(guò)程中積累的初級(jí)和次級(jí)代謝物對(duì)葡萄酒的特性有深遠(yuǎn)影響（杜遠(yuǎn)鵬等，2022）。研究各葡萄酒產(chǎn)區(qū)的葡萄果實(shí)發(fā)育特點(diǎn)及品質(zhì)形成規(guī)律，有助于制定科學(xué)高效的釀酒葡萄栽培管理措施（魏世超，2021）。葡萄果實(shí)品質(zhì)中，糖、酸、香氣等性狀被重點(diǎn)關(guān)注，了解果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的品質(zhì)性狀動(dòng)態(tài)變化對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)栽培有重要意義（王夢(mèng)婷，2022）。葡萄果實(shí)發(fā)育的特點(diǎn)是初始階段果實(shí)小、堅(jiān)硬且呈酸性，隨后為轉(zhuǎn)色期停滯階段，最后階段果實(shí)變大、變軟、變甜并積累一系列感官化合物（Sweetman et al.，2012）。果實(shí)發(fā)育的實(shí)際過(guò)程還受大量基因調(diào)控，釀酒葡萄設(shè)拉子和霞多麗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中黃酮醇的合成和黃酮醇合酶基因的表達(dá)影響其品質(zhì)（Downeyetal.，2003）；MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因如VvmybA1在調(diào)節(jié)葡萄果皮花青素生物合成及控制果色方面發(fā)揮重要作用（Azuma et al.，2008）；遮蔭處理可下調(diào)馬瑟蘭葡萄花青素合成酶基因（CHS、CHI、DFR、F3H、LDOX、F3'5'H）的表達(dá)和下調(diào)光誘導(dǎo)型花青苷合成調(diào)控基因（VvMYB30、VvbHLH79、VvbHLH121）的表達(dá)，從而降低花青素含量（Ma etal.，2019）；VviRTIC1和VviRTIC2基因控制黑比諾家族2個(gè)葡萄品種漿果發(fā)育時(shí)間（Theine et al.，2021）。深度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及日漸準(zhǔn)確的葡萄可用性基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為進(jìn)行葡萄果實(shí)不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組分析提供了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是當(dāng)今果樹(shù)學(xué)領(lǐng)域基因表達(dá)研究及功能分析的重要技術(shù)（賈昌路等，2015），對(duì)深入了解果樹(shù)發(fā)育機(jī)理及解析相關(guān)性狀形成的分子機(jī)制有重要作用。孫紅等（2017）研究長(zhǎng)期低鹽處理對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)及轉(zhuǎn)錄組的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低鹽處理顯著降低果皮花青素含量，輕微降低果肉可溶性固形物含量，顯著降低葡萄糖和果糖含量；劉帥等（2021）基于轉(zhuǎn)錄組研究光質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)色期紅地球葡萄果實(shí)著色及品質(zhì)的影響，分析影響葡萄著色及品質(zhì)的因素并挖掘出關(guān)鍵的光調(diào)控基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在葡萄果實(shí)品質(zhì)形成相關(guān)研究的應(yīng)用已較成熟，而有關(guān)賀蘭山東麓馬瑟蘭葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表型和品質(zhì)變化及轉(zhuǎn)錄組分析尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以賀蘭山東麓馬瑟蘭葡萄為試驗(yàn)材料，采集不同發(fā)育階段的果實(shí)，測(cè)定其生理生化指標(biāo)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探究馬瑟蘭葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的品質(zhì)變化，挖掘關(guān)鍵的生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)品質(zhì)調(diào)控基因，為馬瑟蘭葡萄栽培措施的精準(zhǔn)制定和果實(shí)品質(zhì)提高提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

采樣地點(diǎn)為寧夏銀川賀蘭山東麓國(guó)家葡萄酒地理標(biāo)志保護(hù)區(qū)西夏王葡萄種植基地（38°24′N，106°03′E），選取樹(shù)齡12年左右、長(zhǎng)勢(shì)相近的馬瑟蘭葡萄植株，均采用“廠”字形栽培架勢(shì)種植，株行距1.5 m×2.0 m，按酒莊標(biāo)準(zhǔn)管理。于2021年6—9月分別采集花后20 d（幼果期，標(biāo)記為F）、花后45 d（綠果期，標(biāo)記為E）、花后75 d（轉(zhuǎn)色期，標(biāo)記為V）和花后100 d（成熟期，標(biāo)記為M）的葡萄果實(shí)，每個(gè)階段選取9株樹(shù)勢(shì)中等、生長(zhǎng)情況相對(duì)一致的葡萄植株，每3株為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，從每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的試驗(yàn)植株上隨機(jī)選取5穗葡萄，從每穗葡萄的不同部位隨機(jī)選取20粒漿果，每個(gè)樣品共100粒漿果。葡萄漿果采摘后立即在液氮中冷凍并迅速送至實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)樣品隨機(jī)選取60粒漿果，其中30粒漿果用于測(cè)定生理指標(biāo)，另外30粒漿果用于提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2生理指標(biāo)測(cè)定

使用游標(biāo)卡尺測(cè)量葡萄不同發(fā)育階段的果粒橫徑和縱徑，利用分析天平測(cè)定單果重，采用手持糖度計(jì)（PAL- 日本ATAGO公司）測(cè)定果實(shí)可溶性固形物含量，采用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定液測(cè)定可滴定酸含量，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的費(fèi)林試劑熱滴定法測(cè)定總糖含量。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葡萄不同發(fā)育階段的果實(shí)總酚含量（Kennedy and Jones，2001）及花后100 d成熟果實(shí)中的糖組分和酸組分，使用1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行分析。

1.3總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

各發(fā)育階段葡萄樣品分別取80 mg組織置于液氮中研磨，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將樣品粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL的65℃預(yù)熱CTAB-pBIOZOL試劑中，65℃水浴恒溫處理15 min，4℃下12000×g離心5 min；取上清液加入400μL氯仿，4℃下12000×g離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的2.0 mL離心管，加入700μL酸酚和200μL氯仿，4℃下12000×g離心10 min；加入等體積的氯仿，4℃下12000×g離心10 min；取上清液加入等體積的異丙醇，-20℃靜置2 h進(jìn)行沉淀；4℃下12000×g離心20 min，棄上清；最后用1 mL 75%乙醇清洗沉淀，置于生物安全柜中風(fēng)干后加入50μL DEPC水溶解。提取的總RNA使用NanoDrop Eight分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）和Agilent 2100生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行檢測(cè)。RNA檢測(cè)合格后，按照CloneMinerTM II cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（美國(guó)Ther-moFisher Scientific公司）說(shuō)明構(gòu)建cDNA文庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)合格后，委托深圳華大基因科技有限公司采用DNBSEQ平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序獲得的原始序列（Raw reads）進(jìn)行質(zhì)量控制，獲得有效序列（Clean reads），利用HISAT2將Clean reads與參考基因組序列（http：//plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/Index）進(jìn)行比對(duì)。通過(guò)FPKM（Fragments per kilobases per millionreads）計(jì)算基因表達(dá)水平，利用DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析，以|log2 Fold Change|≥1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出不同發(fā)育階段樣品間的差異表達(dá)基因（DEGs）。根據(jù)DEGs在染色體上的位置，使用Circos繪制DEGs染色體定位圖。采用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，采用Excel 2021繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)生理生化指標(biāo)變化

隨著葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，果穗表型及果粒橫徑、果粒縱徑、單果重等生理指標(biāo)均發(fā)生明顯變化。花后20 d至花后100d的各階段果穗表型變化如圖1-A所示，隨著發(fā)育階段的推移，果實(shí)色澤加深、果粒體積增大。隨著葡萄果實(shí)發(fā)育，單果重在花后20 d至花后75 d迅速增加，花后75 d至花后100 d增速放緩，總體呈S形曲線（圖1-B）。隨著發(fā)育階段的推移，花后45 d與花后75 d的果粒橫徑、果粒縱徑均較前一階段顯著增加（r<0.05，下同）（圖1-C和圖1-D）。

葡萄果實(shí)可溶性固形物含量隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸上升，花后75 d至花后100d期間增幅較大，與花后45 d相比，花后100 d的果實(shí)可溶性固形物含量顯著增加4.36倍（圖1-E）。

葡萄果實(shí)的可滴定酸含量隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸下降（圖2-A）。果實(shí)的總糖含量從花后45d開(kāi)始大量積累（圖2-B），與可溶性固形物含量的變化趨勢(shì)一致。果實(shí)總酚含量在花后20 d至花后75d期間逐漸下降，而在花后75 d至花后100d期間略有上升（圖2-C），這可能與果實(shí)發(fā)育后期，種子發(fā)育成熟有關(guān)。

花后100 d是葡萄果實(shí)成熟階段，此時(shí)馬瑟蘭葡萄果實(shí)中的果糖和葡萄糖含量分別為1.60和1.66 mg/mL，二者比例約為1∶1（圖3-A）。果實(shí)中有機(jī)酸組分主要有酒石酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸；其中酒石酸含量為0.25 mg/g，比例最大；蘋(píng)果酸和檸檬酸含量分別為0.09和0.15 mg/g，比例較小（圖3-B）。

2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果

使用DNBSEQ平臺(tái)對(duì)花后20 d（F）、花后45 d（E）、花后75 d（V）和花后100 d（M）的馬瑟蘭葡萄果實(shí)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，各樣品有效堿基為6.61～6.71 Gb，Q30為92.63%～94.32%。將各樣品的Cleanreads與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，其中86.64%～89.57%比對(duì)到參考基因組，83.16%～87.24%比對(duì)到唯一位置。綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

2.3不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)間DEGs分析結(jié)果

對(duì)葡萄果實(shí)不同發(fā)育階段基因差異表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示，共檢測(cè)到33517個(gè)DEGs，其中花后45 d與花后20 d比較組（E vs F）有13028個(gè)DEGs，包括6469個(gè)上調(diào)DEGs及6559個(gè)下調(diào)DEGs；花后75 d與花后45 d比較組（V vs E）有5035個(gè)上調(diào)DEGs，5180個(gè)下調(diào)DEGs，共10215個(gè)DEGs；花后100 d與花后75 d比較組（M vs V）的DEGs數(shù)量為10274個(gè)，其中5028個(gè)上調(diào)，5246個(gè)下調(diào)。結(jié)果表明，花后45 d與花后20 d比較組的DEGs數(shù)量最多，該時(shí)期葡萄果實(shí)發(fā)育可能受大量DEGs調(diào)控，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的逐步穩(wěn)定，花后75 d與花后45 d比較組、花后100 d與花后75d比較組的DEGs數(shù)量減少。

不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)間DEGs韋恩圖如圖5所示，3個(gè)比較組的共有DEGs為3976個(gè)，花后45d與花后20d比較組的特有DEGs為3362個(gè)，花后75d與花后45 d比較組的特有DEGs為1607個(gè)，花后100 d與花后75 d比較組的特有DEGs為1702個(gè)。這些DEGs可能在葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步明確各染色體上DEGs的分布信息，繪制DEGs染色體定位圖，圖6顯示了馬瑟蘭葡萄果實(shí)不同發(fā)育階段DEGs的分布模式，從外到內(nèi)的6個(gè)同心圓分別代表了不同發(fā)育階段比較組的DEGs定位，花后45 d與花后20d比較組分布在各染色體上的DEGs數(shù)量較多，共12017個(gè)，花后100 d與花后75 d比較組分布在各染色體上的DEGs較少，共11705個(gè)。

DEGs在馬瑟蘭葡萄19條染色體上均有分布，其中分布在18號(hào)染色體上的DEGs數(shù)量最多，3個(gè)比較組分別有945、941和935個(gè)；分布在8號(hào)和14號(hào)染色體上的DEGs數(shù)量較多，3個(gè)比較組的數(shù)量范圍在806～899個(gè)。分布在19號(hào)染色體上的DEGs數(shù)量較少，花后100 d與花后75 d比較組有383個(gè)，其余2個(gè)比較組分別為548和544個(gè)；分布在10號(hào)和15號(hào)染色體上的DEGs數(shù)量較少，3個(gè)比較組的數(shù)量范圍在395～429個(gè)。

2.4 DEGs的GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

對(duì)各比較組間DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析，結(jié)果如圖7所示，DEGs注釋到生物學(xué)過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3個(gè)一級(jí)條目。在細(xì)胞組分中，多數(shù)DEGs注釋到細(xì)胞器（Organelle）、細(xì)胞膜（Mem-brane）、含蛋白復(fù)合物（Protein-containing complex）等功能條目，這些細(xì)胞區(qū)域與果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)；在生物學(xué)過(guò)程中，DEGs主要注釋到細(xì)胞過(guò)程（Cellular process）和代謝過(guò)程（Metabolic process）功能條目；在分子功能中，涉及結(jié)合（Binding）和催化活性（Cata-lytic activity）功能條目，主要與果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

為了解DEGs參與的代謝途徑及生物學(xué)功能，對(duì)各比較組DEGs涉及的KEGG信號(hào)通路進(jìn)行分析。KEGG信號(hào)通路分類如圖8所示，多數(shù)DEGs注釋到的信號(hào)通路與細(xì)胞過(guò)程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、新陳代謝（Metabolism）和有機(jī)系統(tǒng)（Organismal systems）等緊密相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果（圖9）顯示，在花后45d與花后20d比較組中，DEGs顯著富集在氨基酸的生物合成（Bio-synthesis of amino acids）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/gluconeogenesis）、脂肪酸代謝（Fatty acid metabo-lism）、嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）及蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工過(guò)程（Protein processing in the endoplasmic reticu-lum）等信號(hào)通路，表明在花后20 d至花后45d期間，葡萄果實(shí)充分積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供給生長(zhǎng)發(fā)育。在花后75 d與花后45d比較組中，DEGs在類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）信號(hào)通路顯著富集，這與轉(zhuǎn)色這一生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，此外，DEGs還在丙酮酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成（Flavone and flavonol biosynthesis）及脂肪酸代謝等信號(hào)通路顯著富集，這與轉(zhuǎn)色過(guò)程中的果實(shí)品質(zhì)形成相吻合。

葡萄果皮著色與類黃酮這一重要的次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。由KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果可知，花后75 d與花后45 d比較組、花后100 d與花后75 d比較組的DEGs均在類黃酮生物XSSxVNK8sBXm6AI5Wjd3Mg==合成信號(hào)通路顯著富集（圖9）。查耳酮合酶（Chalcone synthase，CHS）由CHS基因編碼，在類黃酮合成途徑中發(fā)揮重要作用。從富集在類黃酮生物合成信號(hào)通路的DEGs中篩選出2個(gè)與馬瑟蘭葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程有關(guān)的CHS基因。分別為CHS1（LOC100263443）和CHS2（LOC 100232843），均在花后45 d至花后75 d期間上調(diào)表達(dá)（圖10），推測(cè)可導(dǎo)致類黃酮合成增多。黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）也是類黃酮合成途徑中重要的合成酶，其調(diào)控基因F3H（LOC 100233079）也在花后45 d至花后75 d期間上調(diào)表達(dá)，在花后75 d至花后100d期間下調(diào)表達(dá)，結(jié)果表明CHS和F3H基因在馬瑟蘭葡萄果皮著色過(guò)程中起重要的調(diào)控作用。

3討論

本研究中，隨著發(fā)育階段的推移，馬瑟蘭葡萄果實(shí)可溶性固形物含量等品質(zhì)變化十分明顯，了解其果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)制對(duì)提高馬瑟蘭葡萄果實(shí)品質(zhì)有重要意義。目前，已有不少有關(guān)葡萄果實(shí)發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析的研究（da Silva et al.，2005；Ma etal.，2020）。Sweetman等（2012）對(duì)花后3周（幼果期）、花后10周和花后11周（相當(dāng)于轉(zhuǎn)色期早期和晚期）及花后17周（成熟期）的設(shè)拉子葡萄進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4185個(gè)在單個(gè)發(fā)育階段上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本，包括161個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄模式對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸、芪類化合物和萜類化合物代謝等代謝途徑具有協(xié)調(diào)性，在苯丙烷/芪類化合物生物合成途徑中，與轉(zhuǎn)色期和未成熟漿果相比，成熟漿果中至少有46種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上調(diào)，并在單個(gè)樣品中檢測(cè)到12種萜烯合酶。本研究從不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中篩選出33517個(gè)DEGs，各比較組共有的DEGs為3976個(gè)；多數(shù)DEGs顯著富集在與果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)的信號(hào)通路，如氨基酸的生物合成、糖酵解/糖異生、脂肪酸代謝、類黃酮生物合成等。類黃酮生物合成是重要的次生代謝產(chǎn)物形成途徑，查耳酮、黃酮醇、花青素等次生代謝產(chǎn)物是葡萄品質(zhì)形成的基礎(chǔ)（Petrussaetal.，2013）。色澤也是評(píng)價(jià)葡萄果實(shí)成熟度的重要依據(jù)，有研究報(bào)道糖類可誘導(dǎo)葡萄漿果中花青素的積累和F3H基因的表達(dá)，F(xiàn)3H基因在花青素的生物合成中起關(guān)鍵作用，糖類還可增加其他植物中花青素的積累和F3H基因的表達(dá)（Zhenget al.，2009）；本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，馬瑟蘭葡萄果實(shí)的可溶性固形物含量隨著發(fā)育階段的推移呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)3H基因在花后45 d至花后75 d期間上調(diào)表達(dá)。CHS催化花青素生物合成，花青素也是影響葡萄酒品質(zhì)的重要因素（Goto-Yamamoto et al.，2002），Harris等（2013）研究發(fā)現(xiàn)葡萄3個(gè)VvCHS基因的轉(zhuǎn)錄水平與漿果皮中花青素含量的增加相關(guān)，表明其在花青素合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究從不同發(fā)育階段葡萄果實(shí)間DEGs中篩選出2個(gè)參與馬瑟蘭葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程的CHS基因，且2個(gè)CHS基因均在花后45 d至花后75 d期間上調(diào)表達(dá)，推測(cè)可導(dǎo)致類黃酮合成增多。本研究結(jié)果表明F3H和CHS基因在馬瑟蘭葡萄果實(shí)著色方面發(fā)揮重要作用。綜上所述，馬瑟蘭葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程伴隨著一系列生理生化指標(biāo)及基因表達(dá)的變化，更具體的基因功能分析仍待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

馬瑟蘭葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中伴隨著果實(shí)色澤加深、果粒體積增大和生化成分的動(dòng)態(tài)變化。類黃酮生物合成信號(hào)通路在葡萄轉(zhuǎn)色過(guò)程中起重要作用，CHS和F3H基因影響馬瑟蘭葡萄果實(shí)著色及品質(zhì)形成。

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（責(zé)任編輯劉可丹）