基于廣泛靶向代謝組學(xué)解析不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄類黃酮差異

摘要：【目的】基于廣泛靶向代謝組學(xué)分析不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄類黃酮差異代謝物情況，為提升葡萄及葡萄酒品質(zhì)提供理論參考依據(jù)?！痉椒ā恳圆煌瑯潺g及栽培條件（地域和架式）的野釀2號腺枝毛葡萄為試材，測定粒重、pH、可溶性固形物、可滴定酸含量及亮度值（L*）、紅—綠色度值（a*）、黃—藍(lán)色度值（b*），并利用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀對其成熟期葡萄果實(shí)進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)分析?！窘Y(jié)果】不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄理化指標(biāo)之間存在不同程度的差異，栽培地域?qū)ζ咸压麑?shí)理化指標(biāo)影響較大，栽種于相思湖葡萄示范基地的果實(shí)成熟度更好，但果粒較小、果皮顏色較淺；栽培架式及樹齡對葡萄果實(shí)的粒重影響較小，對糖酸含量影響較大；同一地域采用籬架栽培的葡萄果實(shí)較棚架栽培成熟度更好，且樹齡越大，果實(shí)成熟度越好。從不同樹齡及栽培條件的成熟期葡萄果實(shí)中共鑒定出11類789種代謝物，其中黃酮類最多，為187種。12個樣品中共存在271個差異代謝物，共聚為7個類群，黃酮類化合物在各亞類中占比最高，特別是第Ⅱ類群，占比高達(dá)59%，其次是第Ⅰ類群，占比為49%。利用差異代謝物能明確區(qū)分來自不同地域、架式和樹齡的葡萄果實(shí)樣品，其中地域樣品間的差異最大，且黃酮類化合物是造成差異的最主要化合物。明陽雙季葡萄示范基地栽培較相思湖葡萄示范基地栽培更利于楊梅素、槲皮素、表兒茶素及甲基花翠素等類黃酮化合物的積累，5年樹齡較8年樹齡更有利于促進(jìn)山柰酚、兒茶素和花青素的積累，而棚架栽培較籬架栽培更利于黃烷-3-醇、花青素雙糖苷和花葵素雙糖苷的積累?？扇苄怨绦挝锖颗c黃酮醇中的槲皮素和楊梅素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，L*和a*均與楊梅素呈顯著負(fù)相關(guān)。【結(jié)論】不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)類黃酮代謝物含量存在差異，其中地域影響最明顯。

關(guān)鍵詞：腺枝毛葡萄；野釀2號；廣泛靶向代謝組學(xué)；樹齡；栽培條件；差異代謝物；類黃酮化合物

中圖分類號：S663.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）08-2262-15

Analysis of flavonoids differences in Vitis heyneanaRoem.etSchult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grape atdifferent vine ages and under different cultivation conditionsbased on widely targeted metabolome

XIE Lin-jun ZHANG Jin ZHOU Yong-mei WEI Rong-fu PANG Li-ting WU Dai-dong LI Hong-yan LIU Jin-biao ZHOU Si-hong2*，CHENG Guo1*

（1Grape and Wine Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China；2College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】Based on widely targeted metabolome，the differential metabolites of flavonoids in Vitisheyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grape at different vine ages and under different cultivation conditions were studied，providing theoretical reference for improving grape and wine quality.【Method】Yeniang No.2 grapes at different vine ages and under different cultivation conditions（regions and trellis systems）were used as test materials to measure berry weight，pH，soluble solids，titratable acid content，brightness value（L*），red-green color value（a*），yellow-blue color value（b*）.Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spec-trometer was used for widely targeted metabolome of grape berries at maturity stage.【Result】There were varying degrees of differences in the physicochemical indicators of Yeniang No.2 grapes with diffe-rent vine ages and cultivation condi-tions.The regions had greater impact on the physicochemical indicators of grape fruits，and the fruits planted in the Xiang-sihu demonstration vineyard had better maturity，but with smaller berries and lighter skin color.The trellis systems and vine ages had slight impact on the berry weight of grapes，but had great impact on the sugar and acid content.Grapes grown on shed frame in the same region had better fruit maturity than those grown on hedgerow frame，and the older the vines，the better the berry maturity of the plants.A total of 789 metabolites belonging to 11 ca-tegories were identified from mature grape berries of different vine ages and cultivation conditions，among which flavonoids were the most abun-dant，accounting for 187 species.There were a total of 271 differential metabolites among 12 samples，which were clus-tered into 7 groups.Flavonoids compounds had the highest proportion among all subtypes，especially groupⅡ，which ac-counted for 59%，followed by groupⅠ，which accounted for 49%.Differential metabolites could be used to clearly distin-guish grape samples from different regions，trellis systems and vine ages，with the greatest diffe-rences between regional samples，and flavonoids were the main compounds that causing the differences.The cultivation of Mingyangdemonstra-tion vineyard was more conducive to the accumulation of flavonoids such as myricetin，quercetin，epicatechin and petuni-din than the cultivation of Xiangsihu demonstration vineyard.Compared with the 8-year-old vine，the 5-year-old vine pro-moted the accumulation of kaempferol，catechins and cyaniding，while the shed frame was more conducive to the accu-mulation offlavan-3-ol，cyanidin-3，5-O-diglucoside and pelargonidin-3，5-O-diglucoside than hedgerow frame.Thecorrela-tion analysis results showed that the content of soluble solids was significantly negatively correlated with the content of quercetin and myricetin in flavonols，and L*and a*were significantly negatively correlated with myricetin.【Conclusion】The contents of flavonoid metabolites of V.heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2 grapes are different at different vine ages and under different cultivation conditions，and the influence of region is the most obvious.

Key words：Vitisheyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）；Yeniang No.2；widely targeted me-tabolome；vine ages；cultivation conditions；differential metabolites；flavonoids compound

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32360720）；Guangxi Natural Science Foundation（2024GXNSFAA010474）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021 YT125）；Science and Technology Development Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（2022JM76）

0引言

【研究意義】腺枝毛葡萄［Vitis heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）］屬真葡萄亞屬東亞種群，被認(rèn)為是毛葡萄（V.heyneana Roem.et Schult.）的一個變種，是喀斯特山區(qū)推廣種植的致富果（劉崇懷等，2014；謝文遠(yuǎn)等，2021；郝俊光等，2024）。2022年廣西境內(nèi)毛葡萄栽培面積約6720ha，產(chǎn)值5.47億元，毛葡萄栽培與加工產(chǎn)業(yè)對當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富發(fā)揮了重要作用。廣西毛葡萄種植面積位居世界首位，其中野釀2號的栽培面積最大，該品種具有獨(dú)特的香氣，氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，同時花色苷及有機(jī)酸含量較高，是釀造毛葡萄酒的主要原料（趙明等，2018；管敬喜等，2020）。大量研究及生產(chǎn)實(shí)踐表明，毛葡萄果實(shí)存在低糖高酸、單寧含量低等突出問題，導(dǎo)致加工成的葡萄酒存在酒體酸澀、粗硬、顏色不穩(wěn)定等缺陷，成為產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的瓶頸問題（李記明和賀普超，2003）。類黃酮化合物是葡萄和葡萄酒中重要的次生代謝物，包括黃酮醇、黃烷醇和花色苷，經(jīng)由苯丙烷—類黃酮路徑合成，這些化合物不僅能保護(hù)葡萄減輕病蟲害傷害，還對葡萄果實(shí)的色澤、風(fēng)味及營養(yǎng)價值起著決定性作用（Flamini et al.，2013；Gouotetal.，2019；任小丹等，2022）。在發(fā)酵過程中，類黃酮物質(zhì)通過浸漬從葡萄果皮、種子進(jìn)入葡萄酒，賦予紅葡萄酒收斂性、色澤和風(fēng)味，對提高酒體醇厚感與結(jié)構(gòu)感，保持酒體顏色的穩(wěn)定具有決定性作用（Bindon et al.，2017）。葡萄果實(shí)中類黃酮化合物越豐富，釀造的葡萄酒酒體越飽滿、骨架感越強(qiáng)，增加葡萄果實(shí)中類黃酮化合物含量是提高葡萄酒品質(zhì)及保健作用的關(guān)鍵（張付春，2022）。葡萄中類黃酮的形成與積累具有明顯的品種、組織和時空特異性，且類黃酮的種類和含量也存在較大的差異（盧素文等，2021）。葡萄品種是決定果實(shí)特征和品質(zhì)的重要因素，栽培地域、架式及樹齡等均會對果實(shí)生長發(fā)育、風(fēng)味物質(zhì)代謝和品質(zhì)特征形成產(chǎn)生影響（Longoetal.，2018；金宇寧，2023；王曉玥等，2023）。生產(chǎn)中，不同釀酒葡萄品種的栽培管理方式不同，研究不同品種的最佳栽培管理方式對提升果實(shí)和酒的品質(zhì)具有重要意義。利用廣泛靶向代謝組學(xué)（Widely targeted metabo-lome）技術(shù)分析不同樹齡及栽培條件下野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)代謝物的差異，重點(diǎn)分析類黃酮化合物在各處理間差異化合物的代謝特征，為改進(jìn)栽培措施和提升葡萄品質(zhì)提供參考，對生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)毛葡萄酒、增加毛葡萄產(chǎn)業(yè)附加值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄果實(shí)中黃酮類化合物種類和含量由遺傳因素決定，同時還受光照、溫度、水分和栽培管理措施等條件的影響，這些因素共同調(diào)節(jié)果實(shí)中黃酮類化合物的代謝（Rienthetal.，2021）。眾多學(xué)者圍繞架式、生態(tài)條件及產(chǎn)地等開展了不同栽培方式對葡萄果實(shí)品質(zhì)相關(guān)代謝物影響的研究，李舒婷等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，相比露地栽培，避雨栽培赤霞珠葡萄果皮中類黃酮物質(zhì)的種類無改變，總體上有利于黃酮醇類物質(zhì)的積累，并促進(jìn)了黃酮醇和黃烷醇甲基化比例提高。姚瑤（2020）研究了新疆4個不同產(chǎn)區(qū)的葡萄酒揮發(fā)性香氣成分、非花色苷酚類物質(zhì)、花色苷類物質(zhì)及其在瓶儲期內(nèi)的品質(zhì)變化，闡明不同產(chǎn)區(qū)的葡萄酒各有特色。Wang等（2021）研究表明，采用黑色土工布行間地膜覆蓋降低了葡萄中花青素的含量，并抑制黃酮醇的積累，反映了小氣候參數(shù)對黃酮類化合物積累的重要性。大量代謝產(chǎn)物在不同栽培方式之間的變化可通過代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行建立和表征。近年來，廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)在葡萄果實(shí)代謝產(chǎn)物檢測領(lǐng)域應(yīng)用較廣（Koyama et al.，2012；金宇寧，2023），如丁亭亭等（2023）通過廣泛靶向代謝組學(xué)分析了品麗珠葡萄轉(zhuǎn)色中果皮代謝物，共檢測出29類416種代謝物；朱羿博等（2024）研究發(fā)現(xiàn)不同刺葡萄品種果皮的代謝物質(zhì)有較大差異，主要表現(xiàn)為類黃酮化合物含量的差異。本課題組前期利用廣泛靶向代謝組技術(shù)研究了一年兩收栽培模式下巨峰葡萄夏果和冬果代謝產(chǎn)物差異情況，兩季果實(shí)中有551種代謝物存在差異，黃酮類化合物是兩季果實(shí)生長發(fā)育階段最重要的差異化合物，大部分黃酮類化合物在冬季葡萄中含量較高，尤其是黃酮醇和黃烷-3-醇（Cheng et al.，2023b）。另一方面，將廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)與其他組學(xué)或檢測技術(shù)相結(jié)合，能深入挖掘葡萄果實(shí)風(fēng)味化合物代謝調(diào)控機(jī)理。Ju等（2020）將廣泛靶向代謝組學(xué)方法與實(shí)時熒光定量PCR檢測相結(jié)合，深入挖掘刺葡萄品質(zhì)相關(guān)化合物的代謝特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺葡萄富含糖苷結(jié)合揮發(fā)物（GBV），使葡萄酒具有更多的香氣類型，如花香、果香等；高山4號和白玉葡萄的GBV濃度最高，揭示了葡萄中代謝產(chǎn)物與基因表達(dá)之間的密切關(guān)系。Cheng等（2023a）利用全基因組、廣泛靶向代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合解析腺枝葡萄酚類化合物代謝及調(diào)控特點(diǎn)，與同一地域種植的歐亞種相比，腺枝葡萄的阿魏酸和芪類物質(zhì)的含量更高，這與腺枝葡萄中編碼苯丙烷代謝途徑上游酶的基因COMT和STSs高表達(dá)相關(guān)。Zhang等（2024）利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序分析2種化學(xué)保鮮劑對陽光玫瑰葡萄酚類化合物代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比SO2處理，1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理明顯降低了貯藏后期的芪類化合物、槲皮素、山柰酚和黃烷-3-醇的積累，且1-MCP能有效地抑制漿果脫落、乙烯/脫落酸（ABA）合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)。戶金鴿等（2024）采用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析的方法研究不同地面覆蓋方式下新郁葡萄果皮黃酮類化合物的代謝特征，園藝地布覆蓋與黃酮合成相關(guān)富集途徑主要集中在類黃酮生物合成，生草覆蓋栽培則主要集中在次級代謝物和類黃酮生物合成，兩者的總黃酮含量高于對照?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】野釀2號是兩性花腺枝毛葡萄優(yōu)良品種，具有耐旱、耐瘠、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，同時能很好適應(yīng)南方高溫高濕的氣候。目前關(guān)于野釀2號的研究主要集中于釀造工藝、香氣分析及功能性成分挖掘等方面，未見利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)開展不同樹齡及栽培條件野釀2號腺枝毛葡萄黃酮類代謝物差異分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄為試材，研究地域、架式及樹齡對葡萄果實(shí)類黃酮代謝物的影響，以期了解野釀2號腺枝毛葡萄適宜的樹齡及栽培條件，為生產(chǎn)上選擇適合的栽培方式提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種為野釀2號［V.heyneana Roem.et Schult.var.adenoclada（Hand.-Mazz.）Yeniang No.2］，種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所試驗(yàn)基地，包括相思湖葡萄示范基地（22°50′59″N，108°14′35″E）和明陽雙季葡萄示范基地（22°36'39″N，108°13′51″E）。相思湖葡萄示范基地采用棚架栽培（圖1-A），樹齡8年，材料編號XS-PJ-8Y。明陽雙季葡萄示范基地采用籬架栽培（圖1-B），樹齡5年，材料編號MY-LJ-5Y；棚架栽培，樹齡5年，材料編號MY-PJ-5Y；棚架栽培，樹齡8年，材料編號MY-PJ-8Y。樹勢中等，管理水平良好，田間土肥水管理與病蟲害防治等同常規(guī)。

1.2采收期果實(shí)理化指標(biāo)測定

在采收期選擇樹體生長狀況相對一致的9株葡萄樹作為采樣株，每3株為1個生物學(xué)重復(fù)。每個生物學(xué)重復(fù)從9個葡萄植株中隨機(jī)選取至少30穗上的300粒果。轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，取150粒果（每個生物學(xué)重復(fù)的50粒）用于測定果粒重、pH、可溶性固形物含量、可滴定酸含量及色度值?？扇苄怨绦挝锖渴褂帽銛y式手持折光儀（Atago PAL- 日本Atago公司）測定。pH采用pH計（INESA PHS-3C，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測定。色度值采用手持色彩色差計（Konica Minolta CR-10，日本Konica Minolta公司）測定，用L*表示顏色的亮度值，a*表示紅—綠色度值；b*表示黃—藍(lán)色度值?？傻味ㄋ岷坎捎脷溲趸c酸堿滴定法測定，以酒石酸計。剩余果實(shí)在液氮中快速冷凍，于-80°C保存，用于廣泛靶向代謝組學(xué)分析。

1.3廣泛靶向代謝組學(xué)分析

1.3.1樣品提取采用真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-100F，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司）對冷凍葡萄樣品進(jìn)行凍干。干燥樣品用研磨儀（MM400，德國萊馳公司）在30 Hz下研磨1.5 min。樣品的提取過程參照Yang等（2020）的方法，稱量每個樣品的粉末100 mg，于1.2 mL 70%甲醇提取液中溶解，每30min渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，提取時間為4℃，24 h。轉(zhuǎn)速12000 r/min離心10 min，分離上清液，用0.22μm孔徑濾膜過濾樣品，用于超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2色譜質(zhì)譜采集條件樣品提取物使用UPLC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測分析，其中UPLC為SHIMADZU Nexera X2；MS為Applied Biosystems 4500 QTRAP。1.3.2.1液相條件液相條件參考Yu等（2022）的報道。色譜柱：Agilent SB-C18（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A相為0.1%甲酸—水溶液，B相為0.1%甲酸—乙腈溶液；洗脫梯度：0～10 min，5%～95%B相；10～14 min，95%～5%B相；流速：0.35 mL/min；柱溫：40℃，進(jìn)樣量4μL。

1.3.2.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件參考Yang等（2020）的報道。電噴霧離子源（ESI）溫度設(shè)為550℃，離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)為50、60和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）和LIT模式下分別用10和100μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描采用MRM模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)為中等。通過進(jìn)一步的去族電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行掃描檢測。

1.4統(tǒng)計分析

1.4.1主成分分析（PCA）和層次聚類分析（HCA）利用R中的統(tǒng)計函數(shù)prcomp進(jìn)行PCA，初步了解12個葡萄樣本之間的總體代謝差異。數(shù)據(jù)在無監(jiān)督PCA前進(jìn)行單位方差縮放。HCA結(jié)果以帶樹狀圖的熱圖形式顯示。PCA和HCA均使用R軟件Complex-Heatmap包繪制熱圖。

1.4.2差異代謝物分析對兩兩比較得到的差異顯著代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選，篩選條件為差異貢獻(xiàn)度（VIP）≥ |log2 Fold Change|≥1。利用R包Metabo-AnalystR從正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）結(jié)果中提取VIP值，OPLS-DA結(jié)果還包含評分圖和排列圖。在OPLS-DA前對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換（log2）和均值處理。為了避免過擬合，對200個排列進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.4.3差異代謝物KEGG代謝通路富集分析使用KEGG Compound數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/kegg/compound/）對鑒定的代謝物進(jìn)行注釋，將所有注釋的代謝物映射到KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）。具有顯著調(diào)節(jié)代謝物的途徑被輸入到MSEA中進(jìn)行代謝物集富集分析，并使用超地理檢驗(yàn)的P值確定顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1采收期果實(shí)理化指標(biāo)分析

由表1可知，不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄理化指標(biāo)之間存在不同程度的差異，與MY-PJ-5Y相比，MY-LJ-5Y中可溶性固形物和可滴定酸含量存在顯著差異（P<0.05，下同），MY-LJ-5Y的可溶性固形物含量較高，為12.53%，可滴定酸含量較低，為9.83 g/L；與MY-PJ-5Y相比，MY-PJ-8Y除可滴定酸含量存在顯著性差異外，其他理化指標(biāo)之間無顯著性差異（P>0.05，下同）。XS-PJ-8Y的粒重最低，為0.98 g，可滴定酸含量最低，為9.64 g/L，可溶性固形物含量最高，為16.17%；L*較高，a*、b*值均與MY-PJ-8Y無顯著差異，表明XS-PJ-8Y果實(shí)果粒較小，顏色較淺，果實(shí)成熟度較好。綜上所述，栽培地域?qū)ζ咸压麑?shí)理化指標(biāo)影響較大，栽種于相思湖葡萄示范基地的果實(shí)成熟度更好，但果粒較小、果皮顏色較淺。栽培架式及樹齡對葡萄果實(shí)的粒重影響較小，對糖酸含量影響較大。同一地域采用籬架栽培的葡萄果實(shí)較棚架栽培成熟度更好，且樹齡越大植株果實(shí)成熟度更好。

2.2代謝產(chǎn)物分析結(jié)果

野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)代謝產(chǎn)物分析結(jié)果如圖2所示。共鑒定出11類789種代謝物，包括黃酮類187種、酚酸119種、脂類81種、氨基酸及其衍生物76種、有機(jī)酸49種、生物堿48種、核苷酸及其衍生物48種、萜類38種、鞣質(zhì)20種、木脂素和香豆素17種，以及其他類106種，其中黃酮類化合物最多（圖2-A）。為了分析不同樹齡及栽培條件對野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)差異代謝產(chǎn)物的影響，分別對不同架式（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）、不同樹齡（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）、不同地域（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）樣品進(jìn)行代謝物差異分析（圖2-B）。不同地域間的差異代謝物數(shù)量明顯多于不同栽培架式間或不同樹齡間的差異代謝物數(shù)量，而不同栽培架式與不同樹齡的差異代謝物數(shù)量相近。棚架栽培與籬架栽培（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）相比，上調(diào)的差異代謝物數(shù)量與下調(diào)的差異代謝物數(shù)量較相近；5年樹齡與8年樹齡（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）相比，上調(diào)數(shù)量明顯多于下調(diào)代謝物數(shù)量；相思湖葡萄示范基地與明陽雙季葡萄示范基地（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）相比，下調(diào)數(shù)量明顯多于上調(diào)代謝物數(shù)量。

2.3差異代謝物比較分析結(jié)果

野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)差異代謝物比較分析結(jié)果（圖3-A）顯示，不同樣本中所有代謝物的比較結(jié)果表明各處理間的代謝物存在一定差異。PCA結(jié)果（圖3-B）顯示，主成分1（PC1）可將XS-PJ-8Y與其他樣本區(qū)分開來，說明不同栽培地域葡萄果實(shí)代謝物的差異大于不同樹齡和架式（圖3-B）。HCA結(jié)果（圖3-C）顯示，差異代謝物在第1層級分為2組，第1組為XS-PJ-8Y，第2組為MY-PJ-5Y、MY-LJ-5Y和MY-PJ-8Y；在第2層級，同一地域的處理間又明顯區(qū)分為2組，MY-PJ-5Y為一組，MY-LJ-5Y與MY-PJ-8Y為另一組，與PCA結(jié)果較一致。

2.4差異代謝物K-means聚類分析結(jié)果

為了更清楚地分析不同樹齡及栽培條件的葡萄果實(shí)代謝產(chǎn)物積累特征，對12個樣品的271個差異代謝物進(jìn)行K-means聚類分析，結(jié)果如圖4所示。271個差異代謝物共聚為七大類群，Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ類群的133個代謝物含量在MY-PJ-5Y樣本中較高（圖4-A、圖4-D和圖4-G）。Ⅱ類群的32個代謝物含量在MY-PJ-8Y樣本中較高（圖4-B）。Ⅲ類群的34個代謝物含量在MY-LJ-5Y樣本中較高（圖4-C）。Ⅴ和Ⅵ類群的72個代謝物含量在XS-PJ-8Y樣本中較高（圖4-E和圖4-F）。K-means聚類分析中每個子類的代謝物占比如圖5所示。黃酮類化合物在各類群中占比最高，特別是在Ⅱ類群，占比高達(dá)59%，其次是Ⅰ類群，為49%。

2.5差異代謝物韋恩圖分析結(jié)果

為了鑒定不同樣本之間共有的和特有的差異代謝物，對不同樣本的差異代謝物進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果如圖6-A所示。MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y、MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y和XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y對比組分別檢測到36、31和142種特異性差異代謝物。不同地域樣本間存在的差異代謝物最多，與上述2.3中分析結(jié)果一致。3個對比組共有的差異性代謝物為11種，共5類，每一類型化合物占比如圖6-B所示。黃酮類化合物的占比最高，為54.55%，其次是其他類，為18.18%，酚酸類、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物占比相同，均為9.09%。由此可知，黃酮類化合物是不同樹齡及栽培條件野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)中最主要的差異代謝物。

2.6核心差異代謝物分析結(jié)果

為了找出不同樹齡及栽培條件比較組間的核心差異代謝物，對|log2 Fold Change|的前10種差異代謝物進(jìn)行排名，結(jié)果如圖7所示。不同栽培架式（MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y）與不同樹齡（MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y）具有相似的比較結(jié)果，上調(diào)和下調(diào)最明顯的差異代謝物分別是順丁烯二?；Х弱？鼘幩?、L-γ-谷氨酰胺-L-亮氨酸，分別屬于酚酸類、氨基酸及其衍生物。不同地域（XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y）比較組中上調(diào)最明顯的差異代謝物是順丁烯二?；Х弱？鼘幩?，其次是甘露三糖；下調(diào)最明顯的差異代謝物是羅漢松脂酚-4'-O-葡萄糖苷（羅漢松樹脂酚苷），屬于木脂素和香豆素。MY-PJ-5Y vs MY-LJ-5Y上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物還包括天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、喬松素-7-O-葡萄糖苷（喬松苷）和山柰酚-3-O-鼠李糖基（1→2）葡萄糖苷，均為黃酮類。MY-PJ-5Y vs MY-PJ-8Y中上調(diào)的前10種差異代謝物中有4種屬于黃酮類，分別為飛燕草素-葡萄糖-阿拉伯糖、檸檬素-3，7-O-二葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、檸檬素-7-O-葡萄糖苷，下調(diào)的前10種差異代謝物中亦有4種屬于黃酮類，分別是木犀草素-7-O-新橘皮糖苷（忍冬苷）、喬松素-7-O-葡萄糖苷（喬松苷）、山柰酚-3-O-鼠李糖基（1→2）葡萄糖苷和胡桃苷。XS-PJ-8Y vs MY-PJ-8Y中上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物還包括牽?；ㄋ?3-O-（6''-O-咖啡酰）葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷（蘆?。?、異鼠李素-3-O-沒食子酸酯和根皮素-4'-O-葡萄糖苷，均為黃酮類。

由上述可知，黃酮類化合物是造成處理組差異的主要原因，故對樣本中65種差異代謝黃酮類化合物進(jìn)行重點(diǎn)分析，結(jié)果如圖8所示。65種差異代謝黃酮類化合物包括45種黃酮醇、9種黃烷-3-醇和11種花青素。MY-PJ-5Y中山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、西伯利亞落葉松黃酮-3-O-木糖苷、扁蓄苷（廣寄生苷）、楊梅素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異金絲桃苷、胡桃苷、桑色素等山柰酚、槲皮素的含量較高，同時兒茶素、表兒茶素等大多數(shù)黃烷-3-醇含量也較高，花翠素-3-O-（6''-O-阿魏酰）葡萄糖苷、花葵素-3，5-O-二葡萄糖苷、花青素-3，5-二-O-葡萄糖苷等花翠素單糖苷、花葵素雙糖苷和花青素雙糖苷的含量也有所增加。MY-LJ-5Y中花翠素-3-O-（6''-O-對香豆酰）葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-（6''-O-乙酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷等花翠素的積累增加。MY-PJ-8Y中楊梅素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮萬壽菊素-7-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-鼠李糖苷等楊梅素、槲皮素及異鼠李素的含量較高。同時表兒茶素、二甲花翠素-3-O-（6''-O-對香豆酰）葡萄糖苷、花翠素-葡萄糖-阿拉伯糖、甲基花翠素-3-O-（6''-O-咖啡酰）葡萄糖苷等花翠素、二甲花翠素、甲基花翠素的含量也較高。XS-PJ-8Y中沒食子酰異鼠李素、異鼠李素-3-O-沒食子酸酯、（+）-表兒茶素4'-O-β-D-葡萄糖苷、（+）-表兒茶素3'-O-B-D-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-（6''-O-對香豆酰）葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-（6''-O-乙酰）葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷等異鼠李素、表兒茶素、花翠素、二甲花翠素糖苷的含量較高。

2.7類黃酮化合物分類比較分析

類黃酮化合物是影響葡萄和葡萄酒品質(zhì)的重要化合物，主要包括黃酮醇類、黃烷-3-醇和花色苷類（張付春，2022）。本研究選取了葡萄果實(shí)中10種具有代表性的類黃酮化合物，對不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)進(jìn)行了分析。對于黃酮醇類，槲皮素（圖9-A）、山柰酚（圖9-B）和楊梅素（圖9-C）3類黃酮醇含量在MY-PJ-5Y和MY-LJ-5Y之間無顯著差異，MY-PJ-5Y與MY-PJ-8Y相比，山柰酚含量顯著升高；XS-PJ-8Y與MY-PJ-8Y相比，楊梅素含量顯著降低。對于黃烷-3-醇類，MY-PJ-5Y與MY-LJ-5Y相比，兒茶素（圖9-E）和表兒茶素沒食子酸酯（圖9-G）含量顯著升高，表兒茶素（圖9-D）和表沒食子兒茶素（圖9-F）含量在二者間無顯著差異。MY-PJ-5Y與MY-PJ-8Y相比，兒茶素含量顯著升高。MY-PJ-8Y與XS-PJ-8Y相比，4種黃烷-3-醇類物質(zhì)均無顯著差異。對于花色苷類，僅MY-PJ-5Y與MY-PJ-8Y相比，花青素含量顯著升高。綜上所述，不同栽培架式腺枝毛葡萄果實(shí)主要是兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯含量存在顯著差異，不同樹齡主要是山柰酚、兒茶素和花青素含量存在顯著差異，不同栽培地域主要是楊梅素含量存在顯著差異。具體來說，相思湖葡萄示范基地種植的腺枝毛葡萄果實(shí)中楊梅素含量更低，5年樹齡更有利于山柰酚、兒茶素和花青素的積累，而棚架栽培促進(jìn)了兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的積累。

2.8類黃酮物質(zhì)含量與理化指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果

為了明確不同樹齡及栽培條件野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)類黃酮物質(zhì)含量與理化指標(biāo)的相關(guān)性，對10種類黃酮與7個理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如圖10所示。粒重與可溶性固形物含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05，下同），與a*呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與楊梅素含量呈顯著正相關(guān)?？扇苄怨绦挝锖颗cL*呈顯著正相關(guān)，與槲皮素和楊梅素含量呈顯著負(fù)相關(guān)?？傻味ㄋ岷颗cpH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與表沒食子兒茶素含量呈顯著正相關(guān)。L*、a*與楊梅素含量呈顯著負(fù)相關(guān)。槲皮素和山柰酚含量均與花青素含量呈顯著正相關(guān)。兒茶素含量與表沒食子兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.0 P<0.001）。表沒食子兒茶素含量與表兒茶素沒食子酸酯含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

3討論

廣泛靶向代謝組學(xué)可實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏、覆蓋廣、定性準(zhǔn)的代謝物檢測及解析。相比傳統(tǒng)的液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)可比較不同樣本間代謝物的種類與豐度差異，且篩選出在不同組間具有重要生物學(xué)意義的顯著差異代謝物，并可定性定量檢測低豐度痕量級化合物（pM級別）（Chen et al.，2013）。近年來，廣泛靶向代謝組學(xué)已應(yīng)用于葡萄研究領(lǐng)域，如Lu等（2021）通過廣泛靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在不同著色類型的葡萄果皮和果肉中類黃酮代謝存在較大差異，花青素與其他分支類黃酮化合物的相對含量呈正相關(guān)。Yu等（2022）利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)從桂葡6號和馬瑟蘭2個釀酒葡萄品種中共檢測到774種差異代謝物，其中57種差異代謝產(chǎn)物被鑒定為感染白粉菌后積累的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，葡萄果實(shí)的防御機(jī)制主要與苯丙烷類黃酮的代謝有關(guān)。Cheng等（2023b）利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)從冬夏兩季的巨峰葡萄中檢測到1062種差異代謝物，其中黃酮類化合物285種。本研究利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)從不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)中共檢測出11類789種差異代謝物，其中黃酮類化合物最多，為187種；所有樣品中共有271種差異代謝物，K-means聚類分析顯示黃酮類化合物在各類群中占比最高，韋恩圖結(jié)果顯示3個對比組共有的差異性代謝物有5類共11種，其中黃酮類化合物的占比最高，為54.55%。上調(diào)幅度最大的物質(zhì)為酚酸類的順丁烯二?；?咖啡?？鼘幩?，3個對比組中Fold Change較大的代謝物多為黃酮類。由此可見，黃酮類化合物是利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測到的最主要的次生代謝物，也是不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)中最主要的差異代謝物。黃酮是葡萄中含量最為豐富的一類次生代謝物，這些化合物不僅能保護(hù)葡萄免受紫外線、病蟲害等傷害，還對葡萄的風(fēng)味品質(zhì)及營養(yǎng)價值起決定性作用（Vianello et al.，2013；Gouotetal.，2019）。

黃酮種類和含量除受遺傳因素影響外，栽培條件包含栽培架式、樹齡、氣候及生長調(diào)節(jié)劑等均會影響葡萄果實(shí)中黃酮類化合物的生物合成（Rienth et al.，2021）。金宇寧（2021）以不同樹齡的北冰紅葡萄為材料，研究發(fā)現(xiàn)秋季和冬季采收的11年生北冰紅葡萄果實(shí)中可溶性固形物和總糖含量均顯著高于其他樹齡，樹齡較小的2年生和6年生北冰紅葡萄果實(shí)中總酸含量較高。白世踐等（2024）研究發(fā)現(xiàn)，低‘廠’字形栽培比高‘廠’字形栽培更有利于果實(shí)發(fā)育及提高果實(shí)品質(zhì)，果皮總黃烷醇含量和總花色苷含量分別提高23.83%和5.80%。Zhang等（2024）對我國5個產(chǎn)地的葡萄和葡萄酒中94種花青素類化合物和78種非花青素類酚類化合物進(jìn)行定性和定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的代謝物多樣性主要體現(xiàn)在類黃酮生物的合成途徑上。由此可見，不同地域、架式和樹齡會對葡萄果實(shí)的品質(zhì)及黃酮類物質(zhì)的代謝產(chǎn)生不同影響。本研究發(fā)現(xiàn)，不同樹齡及栽培條件野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)理化指標(biāo)存在差異，栽種于相思湖葡萄示范基地的果實(shí)果粒較小、顏色較淺，成熟度更好；同一地域內(nèi)籬架栽培的葡萄果實(shí)較棚架栽培成熟度更好，而8年樹齡較5年樹齡植株果實(shí)成熟度更好。不同架式、樹齡和地域果實(shí)樣本對比組分別檢測到36、31和142種特異性差異代謝物。王張鈺等（2024）研究表明，風(fēng)土因子對不同釀酒品種葡萄的影響存在差異，例如馬瑟蘭比赤霞珠更易在濕度高、降水量大的風(fēng)土條件下積累黃烷醇類物質(zhì)。由此可見，不同地域的土壤條件、氣候環(huán)境是造成成熟期果實(shí)中代謝產(chǎn)物差異化積累的主要原因，且這種差異大于不同架式或樹齡的比較結(jié)果。

在葡萄和葡萄酒中，類黃酮化合物主要包括三大類：黃酮醇、黃烷醇和花色苷。黃酮醇類和酚酸類作為輔色物質(zhì)，對葡萄和葡萄酒的顏色和陳釀潛力產(chǎn)生重要影響；黃烷醇類在塑造葡萄酒體的風(fēng)味結(jié)構(gòu)上具有重要作用；花色苷類特性及含量對葡萄及葡萄酒的顏色至關(guān)重要（盧浩成等，2021）。劉笑宏（2017）研究不同架式對摩爾多瓦葡萄果實(shí)花色苷代謝的影響，結(jié)果表明，棚架果實(shí)果皮中13種花色苷單體含量顯著高于籬架。本研究通過對不同架式野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)類黃酮化合物進(jìn)行熱圖剖面分析，結(jié)果顯示棚架較籬架更有利于花青素雙糖苷和花葵素雙糖苷的積累?？梢?，不同架式對葡萄果實(shí)代謝物含量有明顯影響。姜文廣等（2015）研究不同樹齡對蛇龍珠葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，3年樹齡促進(jìn)了果實(shí)酚類物質(zhì)積累；6年樹齡果實(shí)酸度更低。本研究發(fā)現(xiàn)，5年樹齡較8年樹齡更利于山柰酚、兒茶素和花青素的積累，而8年樹齡中果實(shí)可滴定酸含量較低。Koyama（2012）研究表明，較好的光照條件能保證黃烷醇類和黃酮醇物質(zhì)的合成。本研究也發(fā)現(xiàn)，棚架較籬架栽培更有利于兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯等黃烷-3-醇的積累，這可能是由于棚架栽培具備更好的光照條件，與劉曉偉等（2021）研究結(jié)論相似。

紅葡萄果實(shí)主要有二甲花翠素、甲基花翠素、甲基花青素、花翠素和花青素類花色苷，花色苷的穩(wěn)定性與其成分組成有較強(qiáng)的相關(guān)性（趙旭等，2019）。研究表明，葡萄和葡萄酒的著色程度與甲基化花色苷占比具有正相關(guān)性，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在葡萄果皮成色中發(fā)揮重要作用（楊曉慧等，2017；李雨陶等，2024）。李雨陶等（2024）研究發(fā)現(xiàn)，富含豐富花翠素類花色苷，尤其是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的馬瑟蘭、赤霞珠和西拉葡萄果皮顏色較深，其作為原料的葡萄酒顏色也較深。本研究通過分析不同栽培地域野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)類黃酮化合物含量差異，發(fā)現(xiàn)MY-PJ-8Y的花翠素、二甲花翠素和甲基花翠素含量明顯較高，XS-PJ-8Y的花翠素和二甲花翠素含量較高，二者相比可知，MY-PJ-8Y葡萄果實(shí)易著色，顏色較深，與MY-PJ-8Y葡萄果實(shí)的L*值較XS-PJ-8Y顯著較低相互印證，表明明陽雙季葡萄示范基地的野釀2號腺枝毛葡萄果實(shí)顏色較深?；A(chǔ)理化指標(biāo)與各類黃酮物質(zhì)含量等指標(biāo)存在相關(guān)性，可溶性固形物含量與黃酮醇中的槲皮素和楊梅素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，推測其與葡萄果實(shí)成熟過程中初生和次生代謝產(chǎn)物積累的時段不同有關(guān)。黃酮醇和黃烷醇等酚類物質(zhì)作為常見的輔色素，其含量和輔色效應(yīng)呈正相關(guān)（Gordillo etal.，2012）。楊梅素作為葡萄果實(shí)中主要的黃酮醇，對保證葡萄酒顏色穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用（趙旭等，2019）。本研究中L*、a*與楊梅素呈顯著負(fù)相關(guān)，表明楊梅素含量低的果實(shí)色度淺，但紅色色調(diào)強(qiáng)。XS-PJ-8Y葡萄中楊梅素含量最低，L*和a*值均較大。

野釀2號是廣西重要的釀酒葡萄品種，通過栽培架式、樹齡及地域的選擇能改變葡萄果實(shí)黃酮類化合物的組成和含量，進(jìn)而提升葡萄漿果品質(zhì)，但對其釀造的葡萄酒品質(zhì)的影響尚不明確，在今后的研究中，將開展不同栽培模式對野釀2號葡萄酒品質(zhì)方面的研究，為提升廣西原生葡萄酒品質(zhì)，促進(jìn)廣西葡萄酒產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供理論參考。

4結(jié)論

黃酮類化合物對葡萄品質(zhì)的形成具有重要的作用，通過合理選擇架式、樹齡及地域可獲得高品質(zhì)的野釀2號葡萄果實(shí)。不同樹齡及栽培條件的野釀2號腺枝毛葡萄類黃酮化合物種類一致，但含量存在差異。相思湖葡萄示范基地籬架栽培和選擇較大樹齡有利于葡萄果實(shí)成熟度的提升，明陽雙季葡萄示范基地栽培更利于楊梅素、槲皮素、表兒茶素及甲基花翠素的積累。棚架栽培較籬架栽培更有利于花青素雙糖苷、花葵素雙糖苷和黃烷-3-醇的積累。低樹齡更有助于山柰酚、兒茶素和花青素的合成。

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（責(zé)任編輯陳燕）