基于宏基因組分析雞爪熟肉制品中微生物污染與基因信息

摘 要：采集10 種雞爪熟肉制品，用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和宏基因組學(xué)方法分析雞爪熟肉制品中微生物污染水平、群落組成及相關(guān)遺傳信息。結(jié)果表明：7號(hào)樣品菌落總數(shù)為1.3×105 CFU/g，不符合GB 2726—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》限量要求，其他樣品菌落總數(shù)結(jié)果均＜10 CFU/g，微生物DNA濃度檢測(cè)結(jié)果與菌落總數(shù)結(jié)果基本一致，可有效評(píng)估樣品中微生物污染水平；1～6號(hào)和8～10號(hào)樣品主要污染微生物為流產(chǎn)衣原體、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鸚鵡衣原體，相對(duì)豐度分別為60.87%～75.49%、13.20%～18.41%、8.29%～16.41%和1.67%～3.67%，7號(hào)樣品主要污染微生物為短乳桿菌、流產(chǎn)衣原體，相對(duì)豐度分別約為63%和8%，所有樣品共檢測(cè)到7 種病毒，主要污染病毒為禽白血病病毒；共鑒定出12 種抗生素耐藥基因、10 種BactMet基因，對(duì)四環(huán)素和吖啶橙等多種抗生素與化合物存在抗性；共鑒定出30 種毒力因子基因，編碼外膜受體、磷脂酶C等毒力因子；鮑氏不動(dòng)桿菌攜帶7 種抗生素耐藥基因、5 種BactMet基因及28 種毒力因子基因，是超級(jí)耐藥與致病菌。

關(guān)鍵詞：宏基因組；雞爪熟肉制品；毒力因子；抗生素耐藥基因

Metagenomic Analysis of Microbial Contamination and Genetic Information in Cooked Chicken Feet Products

SONG Sheng1， GUO Kunpeng1， HAO Qin2， WANG Fang1， YAN Li1， LI Zheng1， ZHANG Jihong1，*

（1. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning，

Hunan Provincial Institute of Product and Goods Quality Inspection， Changsha 410000， China;

2. Miluo City Food and Drug Inspection Institute， Yueyang 414400， China）

Abstract： A traditional culture method and metagenomic analysis were used to determine the level of microbial contamination， community composition and related genetic information in 10 samples of cooked chicken feet products. The results showed that the total bacterial count of sample 7 was 1.3 × 105 CFU/g， which did not meet the requirements of the

GB 2726-2016 National Food Safety Standard for Cooked Meat Products. The total bacterial counts of the other samples were all less than 10 CFU/g. The results of microbial DNA concentration and total bacterial count were basically consistent， thus being valid to assess the level of microbial contamination in the samples. The main contaminant bacteria in samples 1–6 and 8–10 were Chlamydia abortus， Escherichia coli， Klebsiella pneumoniae， and Chlamydia psittaci， with relative abundances of 60.87%–75.49%， 13.20%–18.41%， 8.29%–16.41%， and 1.67%–3.67%， respectively. The main contaminant bacteria in sample 7 were Lactobacillus brevis and C. abortus， with relative abundances of about 63% and 8%， respectively. A total of 7 viruses were detected in all samples， the main one being Avian leukemia virus. A total of 12 antibiotic resistance genes and 10 BactMet genes were identified， indicating resistance to various antibiotics and compounds such as tetracycline and acridine orange. A total of 30 virulence factor genes were identified， encoding outer membrane receptor， phospholipase C， and other virulence factors. Acinetobacter baumannii was found to carry 7 antibiotic resistance genes， 5 BactMet genes， and 28 virulence factor genes， being a super antibiotic-resistant and pathogenic bacterium.

Keywords： metagenome; cooked chicken feet products; virulence factors; antibiotic resistance genes

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-183

中圖分類號(hào)：TS251.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）11-0001-11

引文格式：

宋晟， 郭焜鵬， 郝琴， 等. 基于宏基因組分析雞爪熟肉制品中微生物污染與基因信息[J]. 肉類研究， 2024， 38（11）： 1-11. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-183. http：//www.rlyj.net.cn

SONG Sheng， GUO Kunpeng， HAO Qin， et al. Metagenomic analysis of microbial contamination and genetic information in cooked chicken feet products[J]. Meat Research， 2024， 38（11）： 1-11. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-183. http：//www.rlyj.net.cn

近年來(lái)，隨著食品工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，雞爪等禽副產(chǎn)品生產(chǎn)逐漸規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化[1-2]，但仍存在雞爪糜爛變質(zhì)、微生物污染嚴(yán)重等報(bào)道[3]。熟肉制品中微生物污染檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和分子生物學(xué)方法。Korkeala等[4]采用微生物培養(yǎng)法證明乳桿菌是熟肉制品中的主要腐敗菌；Syne等[5]對(duì)肉類加工廠中即食雞肉和培根進(jìn)行取樣分析，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌是樣品中最常見的食源性致病菌；Yost等[6]采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定出肉品中主要腐敗菌為乳酸菌。宏基因組學(xué)是近年來(lái)興起的研究微生物多樣性的新方法，即從樣品中提取所有微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與生物信息學(xué)研究，分析樣品中所有微生物的遺傳組成和功能[7-8]，較傳統(tǒng)微生物研究方法能更準(zhǔn)確反映樣品中微生物組成[9-10]。

Cauchie等[11]對(duì)288 個(gè)豬肉樣品進(jìn)行嗜冷菌、乳酸桿菌計(jì)數(shù)及高通量測(cè)序，證實(shí)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法與宏基因組學(xué)方法能相互驗(yàn)證與互補(bǔ)；Liu Jie等[12]采用宏基因組測(cè)序技術(shù)研究肥瘦雞盲腸微生物群差異，揭示不同脂肪沉積能力的雞品種之間肝臟和血漿代謝物的差異；Fang Shaoming等[13]利用16S rRNA和宏基因測(cè)序方法揭示兔斷奶至育肥期間腸道微生物群落與平均日增體質(zhì)量間的關(guān)系。目前，結(jié)合傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)與宏基因組學(xué)方法研究雞爪熟肉制品微生物污染的研究報(bào)道較少[14]。

為深入研究雞爪熟肉制品中微生物污染情況及來(lái)源，本研究收集10 種雞爪熟肉制品，包括泡椒鳳爪、泡椒檸檬鳳爪和鹵鳳爪等，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)樣品中菌落總數(shù)，光密度（optical density，OD）法檢測(cè)樣品中微生物DNA，綜合評(píng)價(jià)微生物污染程度；基于宏基因組學(xué)方法分析微生物組成，進(jìn)行主要污染微生物鑒定，分析其可能來(lái)源，通過(guò)解讀遺傳物質(zhì)信息，對(duì)抗性和毒力基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期為雞鴨養(yǎng)殖、屠宰和生產(chǎn)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)微生物可追溯、可控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞爪熟肉制品（10 個(gè)）購(gòu)自京東，均為銷量榜排名靠前的具有代表性的產(chǎn)品，其中輻照殺菌技術(shù)生產(chǎn)的泡椒鳳爪8 個(gè)、高溫高壓殺菌技術(shù)生產(chǎn)的五香鹵鳳爪2 個(gè)（表1）。

每種樣品約1.2 kg，一部分用于檢測(cè)菌落總數(shù)，約1 kg，－20 ℃保存，另一部分用于DNA提取和測(cè)序，約0.2 kg，－80 ℃保存[15]。

平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind磁珠DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Masticator Silver拍擊式均質(zhì)器 西班牙IUL公司；MIR-254L-PC低溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；Qubit? 3.0熒光計(jì) 美國(guó)Invitrogen公司；ETC 811 PCR儀 北京

東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數(shù)測(cè)定

將樣品切成小于1 cm3小塊，無(wú)菌混合均勻，稱取25.0 g樣品，放入均質(zhì)袋中。倒入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液并均質(zhì)1 min。梯度稀釋后，將1 mL溶液移入培養(yǎng)皿中，倒入約15 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂。平板旋轉(zhuǎn)混合均勻，待瓊脂完全固化后，翻轉(zhuǎn)，（36±1）℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)[16]。

1.3.2 微生物基因組DNA提取與濃度測(cè)定

采用E.Z.N.A? Mag-Bind磁珠DNA提取試劑盒提取樣品中微生物基因組DNA，檢測(cè)DNA完整性與濃度。

1.3.3 宏基因組測(cè)序

將第2代測(cè)序原始圖像數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為原始測(cè)序序

列[17]，經(jīng)質(zhì)量評(píng)估和過(guò)濾獲得潔凈數(shù)據(jù)[18-19]。開放閱讀框（open reading frame，ORF）預(yù)測(cè)后生成候選基因集，并對(duì)樣品中所有預(yù)測(cè)基因序列進(jìn)行聚類，以每類中最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因目錄。對(duì)基因數(shù)和基因長(zhǎng)度進(jìn)行分析，得到基因豐度信息[20]。

1.3.4 物種分類和基因功能注釋

使用德國(guó)波恩大學(xué)Crystal Impact GbR公司開發(fā)的DIAMOND V0.8.20軟件對(duì)基因集的蛋白質(zhì)序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）非冗余蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，篩選條件：可靠性評(píng)價(jià)值（E值）＜1.0×10－5，得分＞60。獲得基因的物種分類注釋信息后，計(jì)算界、門、綱、目、科、屬和種等不同分類級(jí)別的物種相對(duì)豐度[21-23]。將基因集的蛋白質(zhì)序列與抗菌殺菌劑和金屬抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)（antibacterial biocide and metal resistance genes database，BacMet）、毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（virulence factor database，VFDB）和抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)（antibiotic resistance genes database，ARDB）進(jìn)行比較，獲得功能基因的相對(duì)豐度[24-27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)和DNA質(zhì)量濃度

由表2可知，7號(hào)樣品菌落總數(shù)為1.3×105 CFU/g，超過(guò)GB 2726—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》限量要求，屬不合格產(chǎn)品，存在嚴(yán)重的微生物污染。其他9 個(gè)樣品菌落總數(shù)均小于10 CFU/g。由此可知，熟制雞爪食品安全風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，與Lewis[28]、Benedito[29]等研究結(jié)果一致。DNA濃度檢測(cè)結(jié)果與菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，其中除6號(hào)ad7e4fd3cca8d755990dade80a5fd9f9樣品外，其余樣品的生產(chǎn)原料均存在一定程度的微生物污染，但經(jīng)過(guò)殺菌，微生物已被有效滅活。

2.2 樣品污染微生物組成

在種水平上，所有樣品中共檢出368 種微生物，7、8號(hào)樣品檢出210多種微生物；4～6號(hào)樣品檢出約190 種微生物；3號(hào)樣品檢出115 種微生物；2、9號(hào)樣品檢出約80 種微生物，1、10號(hào)樣品檢出約50 種微生物。在所有樣品中，相對(duì)豐度≥1%的微生物數(shù)量在4～6 種之間。如圖1及表3～5所示，1～6、8～10號(hào)樣品主要污染微生物為流產(chǎn)衣原體（Chlamydia abortus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci），相對(duì)豐度分別為60.87%～75.49%、13.20%～18.41%、8.29%～16.41%和1.67%～3.67%；7號(hào)樣品主要污染微生物為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、流產(chǎn)衣原體、unclassified Lactobacillaceae species、植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）、unclassified Levilactobacillus species和大腸桿菌，其相對(duì)豐度分別約為63%、8%、6%、4%、1%和1%，與已有研究[30-32]結(jié)果相似。在種水平上，所有樣品共檢出7 種病毒，2、4、8號(hào)樣品檢出7 種病毒；1、3、5、7、9、10號(hào)樣品檢出6 種病毒，6號(hào)樣品檢出5 種病毒。主要污染病毒為禽白血病病毒（Avian leukosis virus），1、3、4號(hào)樣品禽白血病病毒相對(duì)豐度分別為0.130 0%、0.100 0%、0.120 0%，樣品2、5、6、8、10中禽白血病病毒相對(duì)豐度分別為0.035 0%、0.014 0%、0.018 0%、0.037 0%、0.026 0%，與Fadly[33]、Sung[34]等研究結(jié)果相似。

僅統(tǒng)計(jì)相對(duì)豐度前10 位微生物。

采用Venn圖分析不同樣品中共有或特有微生物種類，將微生物種類組成相似性和重疊性信息可視化。由圖2可知，10 個(gè)樣品均存在共有和特有的微生物種類，按門、綱、目、科、屬和種水平分析，分別有7、14、24、31、31、38 種共有微生物。包括常見于畜禽肉及其制品中的腸道沙門氏菌、大腸桿菌、空腸彎曲桿菌等多種致病菌[35-37]，詳見表6。

在種水平基于相似性結(jié)果繪制聚類樹，由圖3可知，

7號(hào)樣品微生物組成與其他樣品完全不同。其主要由短乳桿菌組成，而1～6、8～10號(hào)樣品主要由流產(chǎn)衣原體組成。

11#樣品本實(shí)驗(yàn)不作分析。

2.3 抗生素耐藥基因分析

如圖4、表7所示，10 個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)12 種抗生素耐藥基因，涉及13 種抗生素耐藥性。根據(jù)基因功能注釋，tet（H）、tet（39）、adeF、adeH和adeJ的耐藥機(jī)制為抗菌外排；OXA-69、CARB-16、APH（3’’）-Ib、

APH（6）-Id、lnuA和mphE的耐藥機(jī)制為抗生素失活；msrE的耐藥機(jī)制為抗生素靶點(diǎn)保護(hù)。鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是攜帶抗生素耐藥基因最多的細(xì)菌，包括adeF、adeH、adeJ、OXA-69和APH（3’’）-Ib，

對(duì)多種藥物具有耐藥性，如氨基糖苷類抗生素、碳青霉烯類抗生素和四環(huán)素類抗生素等[38-39]。肺炎克雷伯氏菌攜帶adeH、adeJ、OXA-69和msrE 4 種抗生素耐藥基因，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和鏈陽(yáng)性菌素類抗生素等多種藥物具有耐藥性[40]。unclassified Pseudomonadota species攜帶adeJ、APH（3”）-Ib和mphE 3 種抗生素耐藥基因，對(duì)多種藥物具有耐藥性，如青霉烷和大環(huán)內(nèi)酯類抗生

素等[41]。腸沙門氏菌（Salmonella enterica）攜帶adeJ和msrE，對(duì)林可胺類抗生素等具有耐藥性。睡眠嗜組織菌（Histophilus somni）攜帶tet（H）和adeJ，對(duì)四環(huán)素類抗生素等具有耐藥性[27，42]。除1、10號(hào)樣品外，其余樣品均檢出抗生素耐藥基因。其中，4、8號(hào)樣品檢出9 種抗生素耐藥基因，6號(hào)樣品檢出7 種抗生素耐藥基因，

5號(hào)樣品檢出6 種抗生素耐藥基因，7號(hào)樣品檢出3 種抗生素耐藥基因，2、3、9號(hào)樣品檢出2 種抗生素耐藥基因。

A.基因家族；B.藥物類別；C.耐藥機(jī)制。RND.耐藥-結(jié)節(jié)-細(xì)胞分化（resistance-nodulation-cell division）；LNU.林可酰胺核苷酸轉(zhuǎn)移酶（lincosamide nucleotidyltransferase）；MPH.大環(huán)內(nèi)酯磷酸轉(zhuǎn)移酶（macrolide phosphotransferase）。

2.4 BactMet基因分析結(jié)果

如圖5、表8所示，10 個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)10 種BactMet基因，涉及3 種類型的抗生素耐藥機(jī)制，包括抗生素外排、抗微生物失活和抗微生物靶標(biāo)保護(hù)。10 個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn)21 種類型的化合物抗性。鮑氏不動(dòng)桿菌是攜帶最多BactMet基因的細(xì)菌，包括abuO、adeG、adeH、adeJ和adeT1，對(duì)多種化合物具有抗性，如吖啶等；

瓊氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii）攜帶chrA，對(duì)Cr具有抗性；短乳桿菌攜帶arsC，對(duì)As具有抗性；叢毛單孢菌（Comamonadaceae）攜帶golT，對(duì)Cu和Au具有抗性；克氏假單胞菌（Pseudomonas knackmussii）攜帶ruvB，

對(duì)Cr、Te和Se具有抗性[25，43]。養(yǎng)料嗜冷桿菌（Psychrobacter cibarius）攜帶mtrF，對(duì)Triton X-100具有抗性。4～8號(hào)樣品中

檢測(cè)到BactMet基因。其中，4號(hào)樣品檢出7 種BactMet基因，8號(hào)樣品檢出3 種BactMet基因，5、6號(hào)樣品檢出2 種BactMat基因，7號(hào)樣品檢出1 種BactMeta基因。

A.基因；B.化合物。SDS.十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）。

2.5 毒力因子分析結(jié)果

VFDB包括2 個(gè)子數(shù)據(jù)庫(kù)：setA數(shù)據(jù)庫(kù)和setB數(shù)據(jù)庫(kù)，其中setA數(shù)據(jù)庫(kù)是核心庫(kù)，包含已驗(yàn)證的毒力基因，setB是全數(shù)據(jù)庫(kù)，在setA的基礎(chǔ)上增加了預(yù)測(cè)的毒力基因。

根據(jù)VFDB（setA數(shù)據(jù)庫(kù)）的同源性比較結(jié)果，

在4號(hào)樣品中鑒定出7 種毒力因子基因，而在其余樣品中未發(fā)現(xiàn)毒力因子基因。鮑氏不動(dòng)桿菌ACICU是攜帶毒力因子基因最多的細(xì)菌，其攜帶的毒力因子基因包括bauA、barA、csuE、basB、bfmS和plc，與Harding等[39]結(jié)果一致。bauA、barA和basB編碼的蛋白質(zhì)有外膜受體、多藥ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP酶、滲透酶及非核糖體肽合成酶模塊，與不動(dòng)桿菌素有關(guān)，其功能是高親和力兒茶酚-羥肟酸鐵載體與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)鐵；bfmS編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組氨酸激酶，其功能是控制生物膜的形成和細(xì)胞形態(tài)，參與細(xì)胞黏附、抗血清殺傷和抗生素敏感性；csuE編碼的蛋白質(zhì)為假定蛋白，與Csu菌毛有關(guān)，其功能是在生物膜形成的最初步驟中發(fā)揮作用，使細(xì)菌細(xì)胞黏附在非生物表面，并在生物膜結(jié)構(gòu)完全發(fā)育之前開始形成微菌落；plc編碼的蛋白質(zhì)是磷脂酶C，其功能是通過(guò)裂解宿主細(xì)胞膜中的磷脂及降解黏膜屏障中的磷脂促進(jìn)細(xì)菌入侵，有助于宿主細(xì)胞的裂解，從而促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。嗜肺軍團(tuán)菌

亞種攜帶katB，其編碼的蛋白質(zhì)為過(guò)氧化物酶katB，其表達(dá)在指數(shù)期后達(dá)到最高，對(duì)細(xì)胞內(nèi)存活和傳播很重要，如圖6、表9所示。

A.基因；B.毒力因子。PNAG.多糖聚-N-乙?；咸前罚╬olysaccharide poly-N-acetylglucosamine）；LPS.脂多糖（lipopolysaccharide）。

根據(jù)VFDB（setB數(shù)據(jù)庫(kù)）的同源性比較結(jié)果，共鑒定出30 種毒力因子基因，除1、9、10號(hào)樣品外，其余樣品均鑒定出毒力因子基因。在4號(hào)樣品中鑒定出28 種毒力因子基因，在8號(hào)樣品中鑒定出4 種毒力因子基因，在2、3、6、7號(hào)樣品中鑒定出2 種毒力因子基因，而在5號(hào)樣品中鑒定出1 種毒力因子基因。在鮑氏不動(dòng)桿菌ATCC 17978中鑒定出8 種毒力因子基因，包括plc、bauB、pgaA、pgaB、pgaC、adeG、adeH和bfmR，它們相應(yīng)的功能蛋白分別為磷脂酶C、鐵不動(dòng)桿菌素結(jié)合蛋白、假定蛋白、血紅素儲(chǔ)存信號(hào)肽蛋白、血紅素儲(chǔ)存系統(tǒng)HmsR蛋白、陽(yáng)離子/多藥外排泵、RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和NarL系列雙組分反應(yīng)調(diào)節(jié)器。在鮑氏不動(dòng)桿菌AB0057中鑒定出5 種毒力因子基因，包括barA、basD、bauC、AB57_0984和csuE，相應(yīng)功能蛋白分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、非核糖體肽合成酶BasD、鐵不動(dòng)桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)滲透酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、LysR蛋白家族和CsuE蛋白。在鮑氏不動(dòng)桿菌TYTH-1中鑒定出3 種毒力因子基因adeH、M3Q_282和M3Q_283，相應(yīng)的功能蛋白分別為NodT家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)體外膜脂蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶和假定蛋白。鮑氏不動(dòng)桿菌D1279779中鑒定出2 種毒力因子基因basB和basA，相應(yīng)的功能蛋白分別為非核糖體肽合酶和不動(dòng)桿菌素生物合成蛋白。在鮑氏不動(dòng)桿菌MDR-ZJ06中鑒定出2 種毒力因子基因ABZJ_00085和ABZJ_00086，其相應(yīng)的功能蛋白分別為IS4家族轉(zhuǎn)座酶ORF1和IS4家族轉(zhuǎn)座酶ORF2。鮑氏不動(dòng)桿菌AYE中鑒定出1 種毒力因子基因bauA，其相應(yīng)的功能蛋白為鐵不動(dòng)桿菌素受體BauA，鮑曼不動(dòng)菌BJAB0715中鑒定出1 種毒力因子基因barB，其相應(yīng)功能蛋白為ABC型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、ATP酶和滲透酶組分，鮑氏不動(dòng)桿菌MDR-TJ中鑒定出1 種毒力因子基因ABTJ_03743，其相應(yīng)作用蛋白為磷酸甘露聚糖突變酶，斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501中鑒定出1 種毒力因子基因pilU，其相應(yīng)功能蛋白為抽動(dòng)運(yùn)動(dòng)蛋白PilU[26]，如圖6、表10所示。

3 討 論

10 種雞爪熟肉制品經(jīng)菌落總數(shù)檢測(cè)與宏基因組分析可知，1～6號(hào)和8～9號(hào)樣品主要污染微生物是流產(chǎn)衣原體、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鸚鵡衣原體，這些微生物已在雞鴨養(yǎng)殖場(chǎng)、雞鴨肉、雞鴨腸或糞便中檢測(cè)到，說(shuō)明產(chǎn)品中的污染微生物主要來(lái)自凍雞爪，因清洗過(guò)程未完全去除，導(dǎo)致終產(chǎn)品中檢測(cè)到相關(guān)基因，建議相關(guān)企業(yè)加強(qiáng)原料的驗(yàn)收工作，確保購(gòu)入的凍雞爪符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)，并在加工過(guò)程中加強(qiáng)清洗工作，以有效去除微生物污染。7號(hào)樣品菌落總數(shù)不符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，主要污染微生物為短乳桿菌、流產(chǎn)衣原體、unclassified Lactobacillus species、植物乳桿菌和大腸桿菌，表明污染源可能是泡椒等發(fā)酵蔬菜，主要增殖階段為浸泡過(guò)程，建議相關(guān)企業(yè)加強(qiáng)泡椒等原料的微生物檢測(cè)與控制，確保原料符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，應(yīng)高度重視泡椒泡制過(guò)程，將其視為危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)中的重要環(huán)節(jié)，嚴(yán)格監(jiān)控衛(wèi)生條件，防止微生物的污染和增殖。所有樣品均檢出禽白血病病毒，表明該病毒在家禽養(yǎng)殖中廣泛存在，存在潛在危害。禽白血病病毒對(duì)家禽健康和生產(chǎn)性能構(gòu)成威脅，可能導(dǎo)致生產(chǎn)損失和經(jīng)濟(jì)影響。因此，家禽養(yǎng)殖工作者需要高度重視該病毒的防治工作。

通過(guò)對(duì)污染微生物遺傳信息分析可知，樣品中共鑒定出12 種抗生素耐藥基因，對(duì)13 種抗生素具有耐藥性，涉及3 種類型的抗生素耐藥機(jī)制。這表明多種抗生素在家禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)廣泛使用，導(dǎo)致不同來(lái)源的雞爪原料存在多種耐藥基因，其中鮑氏不動(dòng)桿菌攜帶7 種抗生素耐藥基因，對(duì)7 種抗生素具有耐藥性，屬于超級(jí)耐藥菌；共鑒定出10 種BactMet基因，對(duì)21 種化合物具有抗性，鮑氏不動(dòng)桿菌攜帶最多的BactMet基因，對(duì)吖啶、溴化乙錠等多種化合物存在抗性；共鑒定出30 種毒力因子基因，鮑氏不動(dòng)桿菌中鑒定出28 種毒力因子基因，毒力因子包括磷脂酶C等。鮑氏不動(dòng)桿菌是本研究中鑒定出的超級(jí)致病菌與超級(jí)耐藥菌，且多個(gè)樣品中均有檢出，說(shuō)明禽肉中普便存在鮑曼超級(jí)致病菌與超級(jí)耐藥菌，具有極大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于普通消費(fèi)者而言，購(gòu)買和食用禽肉及其制品時(shí)，應(yīng)高度關(guān)注交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于禽肉加工企業(yè)而言，應(yīng)建立完善的微生物控制體系，包括原料驗(yàn)收、加工過(guò)程衛(wèi)生控制、產(chǎn)品檢測(cè)等，以確保最終產(chǎn)品的微生物指標(biāo)符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，食品安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)雞爪熟肉制品等禽肉產(chǎn)品的抽檢力度，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并排除食品安全風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)加強(qiáng)監(jiān)管和抽檢，促使企業(yè)更加重視產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全，從而保障消費(fèi)者的健康權(quán)益。

通過(guò)本研究可知，雞爪中的膠原蛋白、油、鹽等不會(huì)顯著干擾微生物DNA提取，與Cauchie等[11]對(duì)豬肉樣品分析情況相似，證明傳統(tǒng)微生物分析方法與宏基因組分析方法可結(jié)合用于肉制品中的微生物污染研究。下一步，將在確保樣品的代表性、時(shí)間的連貫性、養(yǎng)殖到消費(fèi)的完整性前提下，收集禽用飼料、養(yǎng)殖用水、養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境樣品、雞鴨糞便、屠宰環(huán)境樣品、屠宰樣品、禽肉生產(chǎn)環(huán)境樣品、禽肉生產(chǎn)過(guò)程樣品及終產(chǎn)品，采用現(xiàn)有技術(shù)解析微生物群落結(jié)構(gòu)，捕捉微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，追蹤污染微生物來(lái)源，為污染防控提供建設(shè)性建議。

4 結(jié) 論

7號(hào)樣品菌落總數(shù)為1.3×105 CFU/g，不符合GB 2726—2016限量要求，其他樣品菌落總數(shù)結(jié)果

均＜10 CFU/g；1～6號(hào)和8～10號(hào)樣品主要污染微生物為流產(chǎn)衣原體、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鸚鵡衣原體，7號(hào)樣品主要污染微生物為短乳桿菌、流產(chǎn)衣原體，所有樣品共檢測(cè)到7 種病毒，主要污染病毒為禽白血病病毒；共鑒定出12 種抗生素耐藥基因、10 種BactMet基因、30 種毒力因子基因。其中鮑氏不動(dòng)桿菌攜帶7 種抗生素耐藥基因、5 種BactMet基因及28 種毒力因子基因，是超級(jí)耐藥與致病菌?；谥饾u補(bǔ)充、完善的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的第2代測(cè)序宏基因組研究方法在食品微生物研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于各類食品中污染微生物研究，以及包括發(fā)酵豆制品、醬類等發(fā)酵食品中功能微生物組成研究，各類基因的鑒定、統(tǒng)計(jì)與分析對(duì)基因功能及可能存在的代謝物研究具有重要的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] KALOGEROPOULOS N， CHIOU A， IOANNOU M， et al. Nutritional evaluation and bioactive microconstituents （phytosterols， tocopherols， polyphenols， triterpenic acids） in cooked dry legumes usually consumed in the Mediterranean countries[J]. Food Research International， 2010， 43（8）： 2006-2013. DOI：10.1016/j.foodchem.2010.01.005.

[2] SANTOS F F， AQUINO M H C， NASCIMENTO E R， et al. Chicken feet bacteriological quality at 4 steps of technological processing[J]. Poultry Science， 2011， 90： 2864-2868. DOI：10.3382/ps.2011-01588.

[3] CHEN M H， WANG S W， WANG W Z， et al. Contamination of Salmonella Schwarzengrund cells in chicken meat from traditional marketplaces in Taiwan and comparison of their antibiograms with those of the human isolates[J]. Poultry Science， 2010， 89： 359-365. DOI：10.3382/ps.2009-00001.

[4] KORKEALA H J， BJRKROTH K J. Microbiological spoilage and contamination of vacuum-packaged cooked sausages[J]. Journal of Food Protection， 1997， 60： 724-731. DOI：10.4315/0362-028X-60.6.724.

[5] SYNE S M， RAMSUBHAG A， ADESIYUN A A. Microbiological hazard analysis of ready-to-eat meats processed at a food plant in Trinidad， West Indies[J]. Infection Ecology & Epidemiology， 2013， 3（1）： 20450-20459. DOI：10.3402/iee.v3i0.20450.

[6] YOST C K， NATTRESS FM. The use of multiplex PCR reactions to characterize populations of lactic acid bacteria associated with meat spoilage[J]. Letters in Applied Microbiology， 2000， 31： 129-133. DOI：10.1046/j.1365-2672.2000.00776.x.

[7] HANDELSMAN J， RONDON MR， BRADY SF， et al. Goodman molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes： a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology， 1998， 5（10）： R245-R249. DOI：10.1016/S1074-5521（98）90108-9.

[8] THOMAS T， GILBERT J， MEYER F. Metagenomics： a guide from sampling to data analysis[J]. Microbial Informatics and Experimentation， 2012， 2（1）： 3. DOI：10.1186/2042-5783-2-3.

[9] TRINGE S G， RUBIN E M. Metagenomics： DNA sequencing of environmental samples[J]. Nature Reviews Genetics， 2005， 6（11）： 805-814. DOI：10.1038/nrg1709.

[10] CHEN K， PACHTER L. Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities[J]. PLoS Computational Biology， 2005， 1（2）： 106-112. DOI：10.1371/journal.pcbi.0010024.

[11] CAUCHIE E， DELHALLE L， TAMINIAU B， et al. Assessment of spoilage bacterial communities in food wrap and modified atmospheres-packed minced pork meat samples by 16S rDNA metagenetic analysis[J]. Frontiers in Microbiology， 2020， 10： 3074. DOI：10.3389/fmicb.2019.03074.

[12] LIU J， WANG J， ZHOU Y， et al. Integrated omics analysis reveals differences in gut microbiota and gut-host metabolite profiles between obese and lean chickens[J]. Poultry Science， 2022， 101（11）： 102165. DOI：10.1016/j.psj.2022.102165.

[13] FANG S M， CHEN X， PAN J H， et al. Dynamic distribution of gut microbiota in meat rabbits at different growth stages and relationship with average daily gain （ADG）[J]. BMC Microbiology， 2020， 20（1）： 116-119. DOI：10.1186/s12866-020-01797-5.

[14] 楊昌林， 劉燦燦. 四川省近年來(lái)食品安全狀況分析[J]. 食品工程， 2022（2）： 23-27. DOI：10.3969/j.issn.1673-6044.2022.02.007.

[15] 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)， 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 肉與肉制品采樣和檢樣處理： GB 4789.17—2024[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2024.

[16] 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)， 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局. 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定： GB 4789.2—2022[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2022.

[17] CHEN S F， ZHOU Y Q， CHEN Y， et al. Fastp： an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor[J]. Bioinformatics， 2018， 34（17）： i884-i890. DOI：10.1093/bioinformatics/bty560.

[18] PENG Y， LEUNG H C M， YIU S M， et al. IDBA-UD： a de novo assembler for single-cell and metagenomic sequencing data with highly uneven depth[J]. Bioinformatics， 2012， 28（11）： 1420-1428. DOI：10.1093/bioinformatics/bts174.

[19] LANGMEAD B， SALZBERG S L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J]. Nature Methods， 2012， 9（4）： 357-359. DOI：10.1038/nmeth.1923.

[20] LIU Y C， GUO J T， HU G Q， et al. Gene prediction in metagenomic fragments based on the SVM algorithm[J]. BMC Bioinformatics， 2013， 14（Suppl 5）： S12. DOI：10.1186/1471-2105-14-S5-S12.

[21] LI W Z， GODZIK A. Cd-hit： a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences[J]. Bioinformatics， 2006， 2（13）： 1658-1659. DOI：10.1093/bioinformatics/btl158.

[22] ALTSCHUL S F， MADDEN T L， ZHANG J， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402. DOI：10.1093/nar/25.17.3389.

[23] LI H， HANDSAKER B， WYSOKER A， et al. The sequence alignment/map format and SAMtools[J]. Bioinformatics， 2009， 25（16）： 2078-2079. DOI：10.1093/bioinformatics/btp352.

[24] EDDY S R. A new generation of homology search tools based on probabilistic inference[J]. Genome Informatics， 2009， 23（1）： 205-211. DOI：10.1142/9781848165632_0019.

[25] PAL C， BENGTSSON-PALME J， RRENSING C， et al. BacMet： antibacterial biocide and metal resistance genes database[J]. Nucleic Acids Research， 2014， 42： D737-D743. DOI：10.1093/nar/gkt1252.

[26] CHEN L H， YANG J， YU J， et al. VFDB： a reference database for bacterial virulence factors[J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33： 325-328. DOI：10.1093/nar/gki008.

[27] LIU B， POP M. ARDB： antibiotic resistance genes database[J]. Nucleic Acids Research， 2009， 37： D443-D447. DOI：10.1093/nar/gkn656.

[28] LEWIS S J， VELASQUEZ A， CUPPETT S L. Effect of electron beam irradiation on poultry meat safety and quality[J]. Poultry Science， 2002， 81（6）： 896-903. DOI：10.1093/ps/81.6.896.

[29] BENEDITO J， CAMBERO M I， ORTUNO C. Modeling and optimization of sensory changes and shelf-life in vacuum-packaged cooked ham treated by E-beam irradiation[J]. Radiation Physics and Chemistry， 2011， 80（3）： 505-513. DOI：10.1016/j.radphyschem.2010.11.001.

[30] STURDEVANT G L， GARDNER D L， KARI L， et al. Frameshift mutations in a single novel virulence factor alter the in vivo pathogenicity of Chlamydia trachomatis for the female murine genital tract[J]. Infection and Immunity， 2010， 78： 3660-3668. DOI：10.1128/IAI.00386-10.

[31] ROSSI F， RIZZOTTI L， FELIS G E， et al. Horizontal gene transfer among microorganisms in food： current knowledge and future perspective[J]. Food Microbiology， 2014， 42（1）： 232-243. DOI：10.1016/j.fm.2014.04.004.

[32] KIM H E， LEE J J， LEE M J， et al. Analysis of microbiome in raw chicken meat from butcher shops and packaged products in South Korea to detect the potential risk of foodborne illness[J]. Food Research International， 2019， 122： 517-527. DOI：10.1016/j.foodres.2019.05.032.

[33] FADLY A M， SMITH E J. Isolation and some characteristics of a subgroup J-like Avian leukosis virus associated with myeloid leukosis in meat-type chickens in the United States[J]. Avian Diseases， 1999， 43（3）： 391-400. DOI：10.2307/1592636.

[34] SUNG H W， KIM J H， REDDY S， et al. Isolation of subgroup J Avian leukosis virus in Korea[J]. Journal of Veterinary Science， 2002， 3： 71-74. DOI：10.1093/chromsci/45.1.38.

[35] FOLEY S L， JOHNSON T J， RICHE S C， et al. Salmonella pathogenicity and host adaptation in chicken-associated serovars[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2013， 77（4）： 582-607. DOI：10.1128/MMBR.00015-13.

[36] HERMANS D， VAN DEUN K， MESSENS W， et al. Campylobacter control in poultry by current intervention measures ineffective： urgent need for intensified fundamental research[J]. Veterinary Microbiology， 2011， 152： 3-4. DOI：10.1016/j.vetmic.2011.03.010.

[37] KIM J J， SEO K W， MO I P， et al. Genetic characterization of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica Serovar Gallinarum isolates from Chicken in Korea[J]. Avian Diseases， 2019， 63（4）： 584-590. DOI：10.1637/aviandiseases-D-19-00095.

[38] RAMIREZ M S， BONOMO R A， TOLMASKY M E. Carbapenemases： transforming Acinetobacter baumannii into a yet more dangerous menace[J]. Biomolecules， 2020， 10（5）： 720. DOI：10.3390/biom10050720.

[39] HARDING C M， HENNON S W， FELDMAN M F. Uncovering the mechanisms of Acinetobacter baumannii virulence[J]. Nature Reviews Microbiology， 2018， 16（2）： 91-102. DOI：10.1038/nrmicro.2017.148.

[40] WANG G Y， ZHAO G， CHAO X Y， et al. The characteristic of virulence， biofilm and antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health， 2020， 17（17）： 6278. DOI：10.3390/ijerph17176278.

[41] KHAMIS F， AL-ZAKWANI I， MOLAI M， et al. Demographic， clinical， and outcome characteristics of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae over a 10-year period （2010—2020） in Oman[J]. International Journal of Infectious Diseases， 2022， 4： 165-170. DOI：10.1016/j.ijregi.2022.08.001.

[42] POSSEBON F S， TIBA CASAS M R， NERO L A， et al. Prevalence， antibiotic resistance， PFGE and MLST characterization of Salmonella in swine mesenteric lymph nodes[J]. Preventive Veterinary Medicine， 2020， 179： 105024. DOI：10.1016/j.prevetmed.2020.105024.

[43] MORADALI M F， GHODS S， REHM B H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle： a paradigm for adaptation， survival， and persistence[J]. Frontiers in Cellular & Infection Microbiology， 2017， 7： 39. DOI：10.3389/fcimb.2017.00039.

收稿日期：2024-07-13

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ90028）

第一作者簡(jiǎn)介：宋晟（1979—）（ORCID： 0009-0002-1349-572X），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品

微生物學(xué)。E-mail： 55074740@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：張繼紅（1967—）（ORCID： 0000-0003-3162-2235），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。E-mail： 383302005@qq.com