基于YTHDF2 介導(dǎo)凋亡相關(guān)因子降解途徑研究牙齦卟啉單胞菌協(xié)助食管癌免疫逃逸

摘要：目的 探討牙齦卟啉單胞菌（Pg）感染食管癌細胞后對YTHDF2 及凋亡相關(guān)因子（Fas）的影響，闡明其促進免疫逃逸可能的調(diào)控機制。方法 運用免疫組織化學(xué)法及Western blot法檢測Pg感染食管癌與YTHDF2及Fas表達變化；運用免疫共沉淀驗證YTHDF2和Fas蛋白間的相互作用；將體外培養(yǎng)的Pg感染后的KYSE150細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染分為對照組（轉(zhuǎn)染si-NC）和實驗組（轉(zhuǎn)染si-YTHDF2），Western blotting 檢測兩組細胞中YTHDF2、組織蛋白酶B（CTSB）及Fas、FasL蛋白的表達水平；對Pg感染的KYSE150細胞用組織蛋白酶抑制劑（E64）進行處理，Western blotting分別檢測抑制劑處理前后YTHDF2、CTSB、Fas及FasL蛋白的表達變化情況；Pg感染前后及E64處理的KYSE150細胞與人外周血單個核細胞（PBMC）共培養(yǎng)，運用流式細胞術(shù)檢測T細胞相關(guān)效應(yīng)分子的表達情況。結(jié)果 免疫組化法及Western blotting 結(jié)果顯示，Pg 感染后的組織或細胞中YTHDF2 的表達增強，而Fas 表達減弱（Plt;0.001）；免疫共沉淀結(jié)果顯示，YTHDF2 和Fas 之間可直接相互作用；Western blotting 結(jié)果顯示，si-YTHDF2組細胞中CTSB表達量減低，而Fas及FasL的表達量高于si-NC組（Plt;0.001）；用E64處理細胞后，CTSB表達減弱，YTHDF2表達無影響，而Fas及FasL的表達增強；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與PBMC共培養(yǎng)的細胞中，GranzymeB及Ki67表達由強到弱分別為Pg 陰性、Pg 陽性+E64、Pg 陽性，而PD-1 表達情況相反（Plt;0.001）。結(jié)論 Pg 感染依賴YTHDF2 調(diào)節(jié)Fas的表達，協(xié)助食管癌免疫逃逸，從而促進食管癌發(fā)生發(fā)展，表明YTHDF2可能是一個新的調(diào)控食管癌免疫逃逸的關(guān)鍵分子。

關(guān)鍵詞：食管鱗狀細胞癌；牙齦卟啉單胞菌；m6A甲基化閱讀蛋白YTHDF2；凋亡相關(guān)因子；腫瘤免疫

食管癌是最常見且最致命的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第6大原因［1］。食管癌早期缺乏特異性癥狀或體征，因此總體預(yù)后極差，5 年總生存率僅15%左右。食管癌按照組織學(xué)類型主要分為鱗狀細胞癌（ESCC）和腺癌，其中ESCC約占80%以上［2］。食管癌的病因和發(fā)病機制可能與飲食、地域、遺傳、感染等多種因素相關(guān)［3， 4］，我國ESCC的發(fā)生發(fā)展可能具有其獨特的高危因素及分子機制［5， 6］，但目前尚未被完全闡明。因此，需要進一步對食管癌相關(guān)的分子機制進行深入研究，探索可能存在的新型特異性生物標(biāo)志物，為食管癌的診治提供新策略。

人體消化道存在多種微生物定植，以細菌為主，維持消化道微生物菌群平衡對消化道健康有重要作用。牙齦卟啉單胞菌（Pg）作為牙周炎的標(biāo)志性病原微生物，其特性包括：破壞口腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細胞增殖或凋亡、激活上皮細胞的轉(zhuǎn)化、促進血管生成、抑制宿主免疫系統(tǒng)以及產(chǎn)生致癌代謝物等［7］。有研究表明，Pg在食管中定植并且Pg感染與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；Pg感染能夠通過FimA等毒力因子通過多種途徑協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸，進一步促進食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力［8， 9］。

N6-甲基腺苷（m6A）為真核生物mRNA最常見、最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾，參與RNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解等各種代謝過程［10］。研究表明，異常的m6A甲基化及其關(guān)鍵蛋白的表達與多種惡性腫瘤發(fā)生和進展過程密切相關(guān)［11］。YTHDF為甲基閱讀器蛋白，可與m6A特異性結(jié)合選擇性調(diào)節(jié)RNA的代謝［12］。YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）是m6A修飾的關(guān)鍵性蛋白，已在多種惡性腫瘤的文獻中報道［13］。研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化閱讀蛋白YTHDF2能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞的抗腫瘤免疫，且在CD8+T細胞的參與下，YTHDF2顯著降低了腫瘤細胞的先天性和適應(yīng)性免疫［14］。有研究表明，Pg能夠通過RNA甲基化等表觀遺傳修飾途徑促進多種口腔炎癥性疾病的進展［15］。本團隊前期研究表明，Pg感染可促進食管癌細胞逃避宿主的免疫監(jiān)視［9］，然而Pg感染后腫瘤細胞逃避免疫的能力是否與m6A甲基化閱讀蛋白相關(guān)目前相關(guān)尚未有報道。因此Pg感染通過m6A甲基化閱讀蛋白YTHDF2途徑影響腫瘤免疫的相關(guān)機制有待進一步闡明。

凋亡相關(guān)因子（Fas）屬于腫瘤壞死因子受體超家族，是一種死亡受體，與配體FasL結(jié)合后能夠介導(dǎo)細胞的凋亡，在維持免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮重要作用［16］。Fas的異常表達與多種免疫相關(guān)性腫瘤和疾病的發(fā)病機制存在密切聯(lián)系，有研究發(fā)現(xiàn)抑制癌癥細胞中Fas的表達能夠誘導(dǎo)CD8+T細胞凋亡，降低腫瘤細胞對獲得性免疫反應(yīng)的敏感性［17］。FasL高表達的腫瘤細胞可以通過Fas/FasL相互作用來傳遞凋亡信號，促進腫瘤浸潤淋巴細胞的凋亡，最終導(dǎo)致抗腫瘤免疫逃逸［18］。推測在Pg感染的食管癌中可能也存在這種情況。

本研究通過檢測Pg 感染食管癌后對YTHDF2 的影響，以及YTHDF2與Fas之間的相互作用，闡明Pg感染對CD8+T細胞免疫功能的抑制作用，初步探索Pg感染與甲基化閱讀蛋白YTHDF2的相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要試劑

1.1.1 組織樣本

納入2022 年9 月～2023 年5 月在我院被診斷為食管鱗癌并進行手術(shù)的患者病理組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理審批編號：2021-0165），患者均簽署知情同意書。術(shù)中切除的腫瘤組織用多聚甲醛固定后蠟塊包埋以備用。

1.1.2 實驗主要試劑

ATCC 33277 來源于本實驗室；KYSE150細胞系（上海博古生物細胞所）；細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青-鏈霉素、免疫組織化學(xué)染色試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；PAGE凝膠制備試劑盒（10%）、e-ECL顯影液（雅酶公司）；Anti-YTHDF2 抗體、Anti-CTSB 抗體（ThermoFisher Scientific）；Anti-Fas 抗體、Anti-FasL 抗體（Abcam）；Pg 抗體diatheva（上海玉博生物科技有限公司）；PVDF膜（milipore Milipore）；倒置顯微鏡（Nikon）；全自動酶標(biāo)儀、細胞培養(yǎng)箱（Thermo）；凝膠成像分析儀（Bio-Rad）；熒光共聚焦顯微鏡（ZEISS）；厭氧培養(yǎng)箱（Shellab）；流式細胞儀（CyTek）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及Pg培養(yǎng)

KYSE150細胞培養(yǎng)：含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，放置于含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，必要時進行傳代或凍存處理。Pg標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33277于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)，每次感染細胞前，采用革蘭染色后進行形態(tài)學(xué)檢測及16S rDNA特異擴增檢查確定菌株未發(fā)生變異及其它細菌污染。

1.2.2 Pg感染細胞

待被感染細胞生長至80%以上時，PBS清洗細胞2次，加入1 mL胰蛋白酶置于恒溫培養(yǎng)箱中消化5 min，加入2 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基終止消化。消化后的細胞懸液離心、棄上清、重懸細胞。在細胞計數(shù)后向新的培養(yǎng)皿內(nèi)加入（1～10）×106 KYSE150細胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞至完全貼壁，棄去原細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)基。取生長期細菌感染細胞，培養(yǎng)Pg使其OD值達1.0～1.5，將Pg懸液以12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min 后用RPMI 1640 重懸。按照預(yù)定的感染復(fù)數(shù)值在細胞培養(yǎng)基中加入相應(yīng)數(shù)量的Pg，隨后于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。3 d后收集細胞培養(yǎng)液并于4000 r /min條件下離心20 min，留取上清進一步使用0.22 μm孔徑的濾器過濾，濾液置于-20 ℃冰箱保存。將體外培養(yǎng)的Pg 感染后的KYSE150 細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染分為對照組（轉(zhuǎn)染si-NC）和實驗組（轉(zhuǎn)染si-YTHDF2）。

1.2.3 免疫組織化學(xué) （IHC）

將包埋好的蠟塊切片、烤片。依次將載玻片放入二甲苯、梯度酒精中各3 min脫蠟，3% H2O2中浸泡10 min，在清水中洗2 次，再置入檸檬酸緩沖液中，放入微波爐煮至沸騰，取出載玻片冷卻至室溫。滴加血清封閉液孵育30 min，加入適量一抗4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗。加顯色劑，用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色。載玻片依次放入梯度酒精、二甲苯中脫水，晾干后中性樹膠封片。

1.2.4 Western blotting

配制細胞裂解液裂解后提取蛋白，取少量樣品用BCA法測蛋白濃度，其余蛋白按照測定濃度加入Loading Buffer，95 ℃煮10 min。制備濃縮膠，等質(zhì)量蛋白上樣后進行電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜。根據(jù)實驗需要一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜。ECL方法進行曝光顯影。

1.2.5 免疫共沉淀 （Co-IP）

在293T 細胞中，用Myc-YTHDF2 和編碼HA-Fas 的表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。細胞加入適量RIPA細胞裂解緩沖液，置于冰上30 min，4 ℃最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清。取少量裂解液以備分析（Input），剩余裂解液分別使用Myc和HA抗體與磁珠結(jié)合后共同孵育得到免疫沉淀復(fù)合物。剩余裂解液中加入1 μg 相應(yīng)抗體制成混合液，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜，混合液中再加入10 μL 預(yù)處理（裂解緩沖液洗3次，每次3000 r/min，離心3 min）過的protein A 瓊脂糖珠，搖晃孵育2 h。4 ℃ 3000 r/min離心3 min，吸去上清，裂解緩沖液洗3次，加入SDS加樣緩沖液，煮沸5 min。最終所得樣品和Input均用Western blotting檢測。

1.2.6 流式細胞術(shù)

人外周血和1640培養(yǎng)基按照1∶1的比例加入離心管內(nèi)，分層加入適量淋巴細胞分離培養(yǎng)基（FicollPaque），500 g 離心25 min，吸取中間的白色薄膜層，即為PBMC。PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度至1×106/mL。與KYSE150細胞按2∶1的比例共培養(yǎng)48 h后再次提取PBMC。加入適量細胞染色緩沖液重懸細胞并轉(zhuǎn)移至流式管，加入流式抗體，4 ℃避光孵育30 min，細胞染色緩沖液洗滌，離心棄上清，再加入適量細胞染色緩沖液重懸細胞，上機進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 7軟件繪圖。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌中Pg感染與YTHDF2和Fas蛋白表達變化的相關(guān)性

牙齦卟啉單胞菌感染ESCC組織的免疫組化結(jié)果顯示Pg 在腫瘤細胞的胞漿染色（圖1A、B）。免疫組化結(jié)果顯示，與Pg 陰性的ESCC的組織相比，Pg 陽性的組織中YTHDF2 的表達量增強，而Fas 的表達量減弱（圖1C～F，Plt;0.001）。Western blot結(jié)果顯示，Pg陽性的KYSE150細胞內(nèi)YTHDF2的表達量增加，相反的，F(xiàn)as的表達量減弱（圖1G～I，Plt;0.001）。

2.2 YTHDF2可與Fas相互作用

Co-IP實驗結(jié)果顯示，外源性YTHDF2能夠與外源性Fas相互結(jié)合形成復(fù)合物（圖2）。

2.3 YTHDF2介導(dǎo)Fas蛋白通過組織蛋白酶途徑降解

Western blotting結(jié)果顯示，相比對照組，實驗組中YTHDF2 蛋白的表達量減少，CTSB的表達量也減少，而Fas、FasL 的表達量增加（圖3A、B，Plt;0.001）。Western blot結(jié)果顯示，在E64處理后，YTHDF2表達量不變，CTSB 表達量減弱，而Fas 和FasL 表達量增強（圖3C、D，Plt;0.001）。

2.4 Pg 依賴YTHDF2-Fas 途徑抑制食管癌中T細胞的免疫效應(yīng)

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，Pg 感染組的Granzyme B，Ki-67 的表達減弱，PD-1 表達增強（Plt;0.001），但是經(jīng)E64 處理可部分恢復(fù)Granzyme B和Ki-67 的表達水平（圖4）。

3 討論

病原微生物具有復(fù)雜多樣的生物功能，是腫瘤內(nèi)在微環(huán)境的重要組成部分［19］。大多數(shù)病原微生物并不能直接導(dǎo)致癌癥，但它們通常會影響宿主正常的免疫功能，協(xié)助參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程［20］。牙齦卟啉單胞菌被認(rèn)為是慢性牙周炎的關(guān)鍵病原體，可導(dǎo)致微環(huán)境失調(diào)和異常的免疫反應(yīng)［21］。有研究表明，牙齦卟啉單胞菌能夠通過PGN誘導(dǎo)PD-L1 上調(diào)，改變腫瘤免疫微環(huán)境來促進前列腺癌的發(fā)展和進展［22］；而在結(jié)直腸癌中，牙齦卟啉單胞菌能夠侵入腫瘤細胞并激活MAPK/ERK信號通路，從而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖［23］。Pg感染可導(dǎo)致多種惡性腫瘤腫瘤進展，但目前沒有研究闡述牙齦卟啉單胞菌與m6A甲基化的相關(guān)機制。本研究主要從Pg感染通過m6A 甲基化閱讀蛋白YTHDF2 途徑協(xié)助ESCC細胞免疫逃避，進而促進食管癌進展這一角度闡明相關(guān)機制。

雖然已有研究表明，牙齦卟啉單胞菌可能通過miR-194/GRHL3/PTEN/Akt 信號軸促進ESCC的增殖和遷移［24］；也可能通過促進IFNGR1在122位點的棕櫚?；抡{(diào)IFNGR1的蛋白表達，從而增強ESCC細胞增殖、遷移和侵襲［25］ ；或者通過GSK3β 介導(dǎo)的mtOXPHOS促進ESCC的進展［26］。研究表明YTHDF2作為m6A甲基化的關(guān)鍵閱讀蛋白，通過調(diào)控mRNA的翻譯及降解等導(dǎo)致m6A甲基化水平發(fā)生改變，從而影響下游分子的表達水平［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，Pg 陽性的ESCC腫瘤組織或細胞中，YTHDF2表達增高。這表明Pg可能通過上調(diào)YTHDF2介導(dǎo)其依賴m6A甲基化修飾途徑來促進ESCC的進展，需要進一步研究Pg 感染能否通過甲基化閱讀蛋白影響m6A甲基化水平的變化。

多種腫瘤細胞表面的Fas 表達水平減低，通過與配體間的相互作用，誘導(dǎo)細胞凋亡，進一步逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，但其潛在的機制尚不明確［28］。本研究發(fā)現(xiàn)YTHDF2與Fas能直接相互作用，并且YTHDF2高表達能夠誘導(dǎo)Fas 降解。我們發(fā)現(xiàn)Pg 感染ESCC 后YTHDF2高表達，而Fas低表達。CTSB是一種定位于溶酶體的半胱氨酸蛋白酶，CTSB與細胞中溶酶體和自噬相關(guān)蛋白的表達密切相關(guān)［29］。因此，我們猜測這二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的原因可能是YTHDF2 誘導(dǎo)自噬途徑增強。自噬途徑是將各種細胞代謝產(chǎn)物輸送到溶酶體進行降解或再循環(huán)的主要機制［30］。有研究顯示，YTHDF2通過調(diào)控體細胞重編程介導(dǎo)mRNA降解，促進體細胞相關(guān)基因的自噬清除［31］，證明了YTHDF2 能夠調(diào)控mRNA代謝過程，促進細胞代謝分子通過自噬途徑降解。本研究通過實驗進一步證明了Pg 感染高表達YTHDF2能夠介導(dǎo)Fas通過自噬途徑降解。此外，我們還利用腫瘤細胞和PBMC共培養(yǎng)，通過流式細胞術(shù)檢測證明Pg感染ESCC后可以顯著減弱T細胞的增殖和殺傷作用，促進食管癌免疫逃避。

牙齦卟啉單胞菌可釋放多種毒力因子，包括菌毛、莢膜、蛋白酶和外膜囊泡等，這些毒力因子的產(chǎn)生能夠使細菌更好地在宿主體內(nèi)存活、繁殖，并且其致病性在很大程度上與干擾宿主的免疫功能有關(guān)［32， 33］。菌毛蛋白FimA是牙齦卟啉單胞菌的重要毒力因子，在促進細菌黏附和入侵宿主細胞、參與生物膜形成以及引起宿主細胞的免疫炎癥反應(yīng)等多種過程中發(fā)揮重要作用［34］。有研究表明，Pg感染后其毒力因子FimA的基因表達在上消化道腫瘤中呈現(xiàn)上高下低的分布特征［35］。有研究顯示，F(xiàn)imA缺失可能降低菌體間黏附，使侵入細胞內(nèi)的細菌數(shù)目減少，刺激腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力降低；這進一步證明可能存在FimA 介導(dǎo)Pg 從而促進ESCC進展的相關(guān)機制，是Pg促腫瘤作用的潛在分子靶點［36］。因此，我們推測Pg在調(diào)控YTHDF2高表達的過程中，可能通過FimA等致病毒力因子，這需要進一步研究證實。

綜上所述，本研究初步提出Pg感染可能通過m6A甲基化閱讀蛋白YTHDF2途徑介導(dǎo)Fas降解，并進一步抑制T細胞殺傷能力，協(xié)助食管癌產(chǎn)生免疫逃逸。

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（編輯：林 萍）

基金項目：河南省科學(xué)技術(shù)廳-優(yōu)秀青年科學(xué)基金（222300420041）；河南省教育廳-河南省科技攻關(guān)項目（242102310146）