重組日本血吸蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

摘要：目的 探討重組日本血吸蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 將72 只雄性C57BL/6J 小鼠（6～8 周齡）隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS/D-GaIN模型組、LPS/D-GaIN+rSj-Cys 治療組和rSj-Cys 對(duì)照組（n=18）。LPS/D-GaIN 組和LPS/D-GaIN+rSj-Cys 組小鼠均腹腔注射LPS（10 μg/kg）和D-GaIN（700 mg/kg）造模；造模后30 min，LPS/D-GaIN+rSj-Cys 組及rSj-Cys 對(duì)照組小鼠均腹腔注射rSj-Cys（1.25 mg/kg），正常對(duì)照組小鼠注射等體積PBS。造模6 h后，每組隨機(jī)挑選8只小鼠處死，收集小鼠血清及肝組織，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，每組剩余10只分別在3、6、12、24 h觀察其生存情況，并計(jì)算生存率。檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組小鼠肝臟組織病理形態(tài)，采用ELISA檢測(cè)小鼠血清炎性因子腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL-6）表達(dá)，采用免疫組化法檢測(cè)肝組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68表達(dá)水平，采用免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)肝組織Bax、Bcl-2蛋白水平，采用TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況，采用免疫印跡法檢測(cè)肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 模型組小鼠12 h生存率為30%，rSj-Cys治療組小鼠12 h生存率為80%。模型組小鼠24 h生存率為10%，rSj-Cys治療組小鼠24 h生存率為60%；與正常對(duì)照組相比，LPS/D-GaIN模型組小鼠血清中AST、ALT、IL-6、TNF-α 含量均顯著上升（Plt;0.01），病理結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肝臟巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68 表達(dá)明顯增強(qiáng)（Plt;0.01），促凋亡蛋白Bax 表達(dá)顯著增加（Plt;0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著降低（Plt;0.01），肝細(xì)胞凋亡水平顯著增加，肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路GRP78、CHOP、NF-κB p-p65 的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.05 或Plt;0.01）；而LPS/D-GaIN+rSj-Cys治療組小鼠轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT和炎癥因子IL-6、TNF-α水平顯著下降（Plt;0.01），肝臟病理?yè)p傷程度減輕，肝臟巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表達(dá)明顯降低（Plt;0.01），Bax表達(dá)顯著降低（Plt;0.01），Bcl-2表達(dá)顯著增強(qiáng)（Plt;0.01），肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路GRP78、CHOP、NF-κB p-p65的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（Plt;0.05或Plt;0.01）；rSj-Cys對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）。結(jié)論 rSj-Cys通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕炎癥和肝細(xì)胞凋亡緩解LPS/D-GalN引起的小鼠急性肝損傷。

關(guān)鍵詞：急性肝損傷；日本血吸蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；炎癥；凋亡

肝臟是人體重要的代謝器官，在機(jī)體的免疫防御、物質(zhì)代謝以及清除體內(nèi)毒物和藥物等方面起到至關(guān)重要的作用。然而，由于病毒感染、用藥不當(dāng)、過(guò)量攝入食品添加劑、乙醇、攝入有毒食物和輻射損傷等原因，急性肝損傷（ALI）的發(fā)生率逐漸增加［1］。ALI是一種突發(fā)性肝細(xì)胞功能喪失或異常的疾病綜合征，以過(guò)度炎癥，肝細(xì)胞凋亡和壞死為主要病理特征，該病發(fā)展迅速，若不加以控制，可進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭甚至多器官功能障礙等并發(fā)癥并導(dǎo)致死亡［2］。因此，開(kāi)發(fā)有效的藥物對(duì)于早期干預(yù)或治療ALI具有重大意義。脂多糖（LPS）和D-半乳糖胺（D-GalN）的組合常用于誘導(dǎo)ALI 模型，該模型可以模擬臨床ALI，并廣泛用于研究治療ALI的藥物［3］。

目前研究認(rèn)為ALI的機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)［4］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）［5］等多個(gè)方面，可通過(guò)抑制這些機(jī)制來(lái)改善急性肝損傷。關(guān)于LPS 聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)病機(jī)制ERS也參與其中，抑制ERS的激活可以減輕疾病損傷程度，這與抑制炎癥，改善細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種重要的細(xì)胞器，參與多種生物活動(dòng)，包括蛋白質(zhì)合成、折疊和分泌，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂會(huì)導(dǎo)致ERS，進(jìn)而引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），UPR主要包括活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求蛋白1（IRE1）3 條經(jīng)典信號(hào)通路［7］。生理情況下，3個(gè)跨膜蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）結(jié)合處于失活狀態(tài)，ERS時(shí)，與GRP78分離的3個(gè)跨膜蛋白可以通過(guò)不同信號(hào)通路最終激活下游信號(hào)分子核因子κB（NF?κB）［8］和C/EBP-同源蛋白（CHOP）［9］，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。因此，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是治療急性肝損傷的一種策略。

自“衛(wèi)生假說(shuō)”提出以來(lái)，大量流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)性研究表明，蠕蟲(chóng)入侵宿主后，可以激活宿主體內(nèi)巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，通過(guò)一系列細(xì)胞分子機(jī)制調(diào)控宿主體內(nèi)免疫應(yīng)答，進(jìn)而對(duì)多種過(guò)敏性疾病和炎癥性疾病具有改善作用［10-12］。然而，使用蠕蟲(chóng)蟲(chóng)體感染或口服蟲(chóng)卵具有一定風(fēng)險(xiǎn)，且患者心理上難以接受；研究表明，源自蠕蟲(chóng)體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是半胱氨酸蛋白酶的高效抑制劑，其在蠕蟲(chóng)體內(nèi)分布廣泛，具有抑制蛋白酶活性，可通過(guò)上調(diào)抗炎細(xì)胞因子，下調(diào)促炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)及促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化來(lái)調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)，成為研究熱點(diǎn)。從日本血吸蟲(chóng)中克隆Cystatin，并將其純化重組，得到重組日本血吸蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑（rSj-Cys），其通過(guò)參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等來(lái)調(diào)控膿毒癥［13］、動(dòng)脈粥樣硬化性腎損傷［14］、結(jié)腸炎［15］等疾病的進(jìn)展。另外，有研究表明日本血吸蟲(chóng)可通過(guò)減輕ERS來(lái)減輕右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎［12］，但關(guān)于日本血吸蟲(chóng)的衍生物rSj-Cys在ERS作用上暫無(wú)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)建立LPS/D-GalN誘導(dǎo)的ALI模型，探討rSj-Cys對(duì)ALI 的保護(hù)作用及其潛在作用機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)防治LPS/D-GalN誘導(dǎo)的ALI的藥物提供可能的候選藥物和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72 只SPF級(jí)C57BL/6J 小鼠，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究獲山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理批號(hào)：2022-202）。

1.2 主要試劑及儀器

LPS、D-GaIN（Sigma-Aldrich）；重組日本血吸蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑，由蚌埠醫(yī)科大學(xué)楊小迪教授惠贈(zèng)，相對(duì)分子質(zhì)量為11 000，基因結(jié)構(gòu)為306 bp（堿基對(duì)），編碼101 個(gè)氨基酸；PBS、HE染色試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶/AST/GOT測(cè)試盒）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶/ALT/GPT測(cè)試盒）（南京建成生物科技有限公司）；Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；抗核因子κB（NF-κB）p65抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）；抗NF-κB p-p65抗體、抗GRP78、和抗DDIT3（CHOP）抗體（abcam）；β-actin 抗體（湖南艾方生物技術(shù)有限公司）；SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物公司）；SDS-PAGE系統(tǒng)（Bio-Rad）；顯微鏡（Nikon）；化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad）。

1.3 動(dòng)物造模、分組及給藥

72 只雄性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS/D-GaIN組和LPS/D-GaIN+rSj-Cys組、rSj-Cys組，18只/組，隔夜禁食不禁水12 h。LPS/D-GaIN組和LPS/D-GaIN+rSj-Cys 組小鼠均腹腔注射LPS（10 μg/kg）和D-GaIN（700 mg/kg）造模，LPS/D-GaIN+rSj-Cys 組小鼠于造模后30 min 腹腔注射rSj-Cys（1.25 mg/kg）；rSj-Cys組小鼠注射rSj-Cys（1.25 mg/kg），正常對(duì)照組小鼠注射等體積PBS。造模6 h 后，每組各隨機(jī)取8 只小鼠麻醉，采集小鼠血液和肝臟組織以備后續(xù)相關(guān)檢測(cè)。每組剩余10 只在造模后3、6、12、24 h 各時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠存活情況，并計(jì)算其生存率。

1.4 各組小鼠血清AST、ALT檢測(cè)

全血室溫靜置2 h后，3000 r/min離心10 min，分離得到血清，分裝并保存于-80 ℃。采集肝臟組織，并在無(wú)菌生理鹽水中快速?zèng)_洗，采取肝臟左側(cè)小葉放入4%甲醛中固定，剩余肝臟置于-80 ℃保存，以備后用。取分裝好的血清進(jìn)行AST、ALT酶活性檢測(cè)具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 HE染色

取各組小鼠肝臟組織，固定包埋切片后，經(jīng)二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟脫水，分別用蘇木素和伊紅染液染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。蒸餾水沖洗后，脫水透明、中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。

1.6 血清TNF-α和IL-6水平測(cè)定

取分裝好的血清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，將待測(cè)品或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體、酶結(jié)合工作液和顯色底物依次加至反應(yīng)孔中，37 ℃避光孵育，最后加入終止液，利用酶標(biāo)儀測(cè)量A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中TNF-α和IL-6水平。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

冰上稱(chēng)取各組小鼠肝臟組織，裂解研磨，離心后取上清，測(cè)定蛋白濃度后，95 ℃變性10 min。蛋白上樣后，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按照抗體說(shuō)明書(shū)配制合適比例的一抗，Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000）、GRP78（1∶3000）、CHOP（1∶1000）、NF-κB p65（1∶1000）、NF-κB p-p65（1∶1000）、β-actin（1∶1000）。4 ℃搖床過(guò)夜孵育，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，使用ECL曝光液顯影曝光，保存條帶并對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

各組小鼠肝組織石蠟切片烘烤脫蠟，在梯度酒精中進(jìn)行復(fù)水；使用EDTA抗原修復(fù)緩沖溶液（pH=9.0）加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水溶液避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；BSA封閉、CD68、Bax、Bcl-2 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，并用PBS 洗滌3 次（每次5 min），二抗孵育50 min（SABC標(biāo)記）；DAB顯色、蘇木素復(fù)染胞核3 min、自來(lái)水反藍(lán)，封片，于顯微鏡下觀察拍照，呈棕色或深棕色的為陽(yáng)性細(xì)胞，用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。采用陽(yáng)性細(xì)胞率來(lái)反映肝臟組織CD68 表達(dá)水平（陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)×100%），采用相對(duì)陽(yáng)性表達(dá)面積來(lái)反映肝臟組織Bax、Bcl-2 表達(dá)水平（相對(duì)陽(yáng)性表達(dá)面積=陽(yáng)性表達(dá)面積/整個(gè)場(chǎng)面積）。

1.9 TUNEL染色

小鼠肝組織石蠟切片充分脫蠟和水化，利用蛋白酶K進(jìn)行細(xì)胞通透10～30 min，加入TUNEL反應(yīng)液37 ℃反應(yīng)2 h，加入1×DAPI反應(yīng)10 min，PBS充分清洗5次，封片在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，每張切片隨機(jī)選3 個(gè)不重疊的視野，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間分析采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠生存率的影響

造模后3 h各組小鼠均存活。造模后6 h模型組的小鼠存活率為90%，其余3組的小鼠均存活（圖1）。模型組小鼠12 h生存率為30%，rSj-Cys治療組小鼠12 h生存率為80%。正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys對(duì)照組小鼠24 h生存率均為100%，模型組小鼠24 h生存率為10%，rSj-Cys治療組小鼠24 h生存率為60%，是模型組的6倍。

2.2 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠肝功能的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性水平顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，rSj-Cys治療組小鼠血清中ALT、AST 活性水平明顯降低（Plt;0.01，圖2）。而單獨(dú)給予rSj-Cys 與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）。

2.3 rSj-Cys 對(duì)急性肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α的影響

與正常對(duì)照組相比，LPS/D-GalN 組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著增高（Plt;0.01）；與模型組相比，治療組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著下降（Plt;0.01，圖3）；而單獨(dú)給予rSj-Cys 與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）。

2.4 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys 組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，肝血竇之間無(wú)腫脹，肝細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核呈圓形位于中央，胞漿完整（圖4A、D）；LPS/D-GalN組肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝小葉消失，出現(xiàn)大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅細(xì)胞布滿(mǎn)整個(gè)肝臟，中央靜脈消失，可見(jiàn)顏色較淺的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖4B）；與模型組相比，治療組肝組織結(jié)構(gòu)明顯改善，中央靜脈和匯管區(qū)紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖4C）。

2.5 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68的影響

正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys組中僅可見(jiàn)少量巨噬細(xì)胞（圖5A、D）；與正常對(duì)照組相比，LPS/D-GalN組小鼠肝組織中CD68 陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)顯著增多（Plt;0.01，圖5B）；與模型組相比，治療組中rSj-Cys顯著減少小鼠肝組織中CD68陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)（Plt;0.01，圖5C）。

2.6 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織凋亡因子Bcl-2、Bax的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys組中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織促凋亡標(biāo)志物Bax 蛋白表達(dá)增加（Plt;0.01），抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著下降（Plt;0.01）；與模型組相比，治療組中小鼠肝組織促凋亡標(biāo)志物Bax 蛋白在加入rSj-Cys 后表達(dá)降低（Plt;0.01），抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2 蛋白表達(dá)水平增高（Plt;0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織促凋亡標(biāo)志物Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著增高（Plt;0.05）；抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著下降（Plt;0.01）；與模型組組比較，LPS/D-GalN+rSj-Cys 治療組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降（Plt;0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.01）。正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys組中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.7 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

正常對(duì)照組和單獨(dú)給予rSj-Cys組中僅可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞；與正常對(duì)照組相比，LPS/D-GalN組小鼠肝組織切片中，陽(yáng)性凋亡著色細(xì)胞數(shù)顯著增多（Plt;0.01）；與模型組相比，治療組中rSj-Cys顯著減少小鼠肝組織切片中陽(yáng)性凋亡著色細(xì)胞數(shù)（Plt;0.01，圖7）。

2.8 rSj-Cys對(duì)急性肝損傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路相關(guān)分子GRP78、CHOP、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織ERS信號(hào)通路相關(guān)分子GRP78、CHOP、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯增高（Plt;0.05 或Plt;0.01）；與模型組組比較，LPS/D-GalN+rSj-Cys 治療組GRP78、CHOP、NF-κB pp65蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降（Plt;0.05 或Plt;0.01，圖8）。單獨(dú)給予rSj-Cys與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

3 討論

ALI是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，通常由敗血癥、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酗酒或藥物濫用引起，具有起病隱匿、病死率高、發(fā)展快等特點(diǎn)，已經(jīng)成為了不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題［16］。目前ALI常見(jiàn)的治療藥物有甘草酸制劑、糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物、抗氧化劑、多烯磷脂酰膽堿甘草。甘草酸制劑會(huì)引起水腫、血壓升高、頭暈、心悸等副作用［17］；激素藥物會(huì)引起眾多全身不良反應(yīng)；某些患者對(duì)抗氧化劑藥物和多烯磷脂酰膽堿藥物過(guò)敏，而且多種保肝降酶藥停藥后易出現(xiàn)ALT“反跳”。以上藥物或多或少都存在一定的副作用且療效有限，因此我們需要探尋一種安全、高效的治療ALI 的藥物。LPS/DGalN引起的ALI與臨床上的急性肝損傷在病理改變和功能損傷上極為相似，所以是目前研究急性肝損傷及其作用機(jī)制經(jīng)典的動(dòng)物模型。其中LPS 是革蘭陰性菌外膜的重要組成部分，可激活巨噬細(xì)胞，釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子，從而引起肝細(xì)胞凋亡和壞死。D-GalN通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制消耗尿苷磷酸鹽，從而抑制核酸和蛋白質(zhì)的合成，并引起肝細(xì)胞損傷［18］。

現(xiàn)有研究表明，血吸蟲(chóng)衍生物rSj-Cys可改善小鼠心肌梗死的炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌具有保護(hù)作用［19］，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)TLR2/Myd88信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1到M2 的極化，顯著改善了動(dòng)脈粥樣性腎損傷的腎功能［14］。此外，rSj-Cys 已被用于治療DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎和LPS 誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用rSj-Cys以研究其對(duì)ALI的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。本研究結(jié)果表明，rSj-Cys 可以提高ALI 小鼠的24 h 生存率，具有潛在治療作用。

ERS已被證明參與多種肝臟疾病的進(jìn)展，包括非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷、病毒性肝炎、肝癌等［21-23］。GRP78被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性蛋白，正常情況下，IRE-1、PERK、ATF6 與GRP78 結(jié)合，呈無(wú)活性狀態(tài)；ERS狀態(tài)下，未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)大量積聚，使得GRP78與三種感應(yīng)蛋白解離，IRE-1、PERK、ATF6被激活，通過(guò)不同信號(hào)通路最終激活下游信號(hào)分子CHOP和NF-κB，參與急性肝損傷的發(fā)生。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的持續(xù)過(guò)度激活與炎癥反應(yīng)存在相互聯(lián)系。首先，LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，LPS可通過(guò)TLR4結(jié)合激活NF-κB，從而引起IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，同時(shí)募集大量枯否細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集活化，進(jìn)而加重肝損傷［24］。除此之外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致IRE1α-XBP1信號(hào)通路被激活，IRE1α磷酸化并與腫瘤壞死因子受體結(jié)合因子2 和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 形成復(fù)合物，誘導(dǎo)NF-κB核移位，引起炎癥因子的大量分泌［25］。PERK還通過(guò)抑制NF-κB的抑制蛋白的翻譯來(lái)激活NF-κB［26］。研究發(fā)現(xiàn)重組旋毛蟲(chóng)Cystatin和rSj-Cys通過(guò)抑制TLR/MyD 88信號(hào)通路減輕機(jī)體炎癥［13， 27］。此外還有研究證實(shí)rSj-Cys對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6的分泌也有明顯的抑制作用［28］，充分證明了rSj-Cys可以抑制炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示模型組肝臟組織GRP78、CHOP、NF-κB p-p65 蛋白水平表達(dá)增加，巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68的表達(dá)增高，并且血清炎癥因子TNF-α、IL-6含量明顯增加，肝臟病理結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p害，表明LPS/D-GalN誘導(dǎo)強(qiáng)烈的ERS反應(yīng)和嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。給予rSj-Cys 后顯著下調(diào)了ERS 生物標(biāo)志物GRP78、CHOP 蛋白水平的表達(dá)，并抑制了NF-κB p65的磷酸化，顯著降低了巨噬細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)程度和小鼠血清促炎性因子IL-6、TNF-α的水平，病理結(jié)構(gòu)改善，表明rSj-Cys抑制急性肝損傷小鼠的ERS和肝臟炎癥損害。

ERS可通過(guò)激活CHOP來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。磷酸化的IRE1α促進(jìn)c-Jun氨基末端激酶和p38分裂原激活蛋白激酶的激活，進(jìn)而激活其下游信號(hào)通路分子CHOP、促凋亡蛋白Bax，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［29］，同樣激活后的PERK、ATF6也上調(diào)CHOP的表達(dá)［30］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴的小鼠可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［31］。我們的研究表明，LPS/D-GalN在誘導(dǎo)ERS 的同時(shí)，誘導(dǎo)小鼠肝組織內(nèi)促凋亡因子Bax表達(dá)，抑制抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，肝細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加；給予Sj-Cys治療后顯著下調(diào)了ERS標(biāo)志物GRP78、CHOP、NF-κBp-p65蛋白水平的表達(dá)，顯著抑制促凋亡因子Bax表達(dá)，增加抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯下降，表明rSj-Cys抑制ALI小鼠的ERS和肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，rSj-Cys 可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERS，減輕肝細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，改善LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠ALI。

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（編輯：吳錦雅）

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