棘孢木霉TspyrG基因選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系的建立

摘 要 旨在從棘孢木霉Ts93中克隆獲得尿嘧啶合成關(guān)鍵酶乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因（TspyrG），該基因無內(nèi)含子，開放式閱讀框大小為1 140 bp，編碼1個(gè)379氨基酸的蛋白。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)，獲得棘孢木霉Ts93 TspyrG基因缺失突變株ΔTspyrG，突變株在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)。同時(shí)，以PCAMBIA1300質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體1300pyrG。以ΔTspyrG突變株為受體菌，成功構(gòu)建以尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷為選擇標(biāo)記的木霉菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。對(duì)綠色熒光蛋白（eGFP）的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率與抗生素選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)無明顯差異。

關(guān)鍵詞 棘孢木霉；營(yíng)養(yǎng)缺陷型；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

木霉是土壤中廣泛分布的一種絲狀真菌，經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類菌株在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抑制病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等方面都具有明顯效果，是一種應(yīng)用廣泛的生防菌[1-2]。同時(shí)，木霉菌具有生長(zhǎng)迅速、基因組小、分生孢子為單倍體、分子遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，有利于分子操作[3]。目前對(duì)木霉菌的分子操作主要選擇抗生素作為篩選標(biāo)記，如潮霉素、G418[4]等?？股剡x擇標(biāo)記由于成本高、環(huán)境污染大等缺點(diǎn)，不適于大規(guī)模突變株庫(kù)的構(gòu)建[5]。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記是較好的代替方案[6-8]，在酵母中已報(bào)道多種編碼營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)酶的基因，特別是氨基酸合成（如L-組氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸等）相關(guān)酶[9]。其中乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶（EC：4.1.1.23）基因（pyrG）是常用的篩選標(biāo)記。乳清苷-5′-磷酸脫羧酶是尿嘧啶核苷酸合成途徑中一種關(guān)鍵酶，缺失該酶的突變株無法合成尿嘧啶，需要外源補(bǔ)充；同時(shí)，該酶可以將5-氟乳清酸（5-FOA）催化為5-氟乳清苷酸（5-FUMP），5-氟乳清苷酸具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致含有pyrG基因的野生株不能在含有5-FOA的培養(yǎng)基中存活。因此5′-氟乳清酸（5-FOA）和尿嘧啶可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的正向反向篩選標(biāo)記[10]。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)在基因功能預(yù)測(cè)方面展示明顯優(yōu)勢(shì)，功能基因的篩選已經(jīng)有很強(qiáng)的預(yù)見性。但是，對(duì)于新功能基因的篩選，或者某些已知功能基因的新功能開發(fā)方面，突變株庫(kù)構(gòu)建及篩選仍具有明顯優(yōu)勢(shì)。目前，絲狀真菌中最常用的轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium-mediated transformation，ATMT）[11]。經(jīng)過20多年的完善，ATMT已成功應(yīng)用于50多種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化[12]。而木霉菌的ATMT轉(zhuǎn)化具有效率高、單拷貝插入概念高等優(yōu)勢(shì)。另外，突變株庫(kù)的構(gòu)建需要廉價(jià)、高效、安全的選擇標(biāo)記。本研究在前期以潮霉、G418作為篩選標(biāo)記的木霉菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建以TspyrG基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，以棘孢木霉（Trichoderma asperellum）為受體，探討無抗生素篩選標(biāo)記的突變株庫(kù)構(gòu)建的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

棘孢木霉Ts93，南昌師范學(xué)院生科院真菌分子遺傳實(shí)驗(yàn)室分離純化，保藏在武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO：M2017147），該菌株已完成全基因組測(cè)序。質(zhì)粒PCAMBIA1300、 eGFP、eYFP，南昌師范學(xué)院生科院真菌分子遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

PCR相關(guān)酶、內(nèi)切酶、T4連接酶等購(gòu)自Takara公司。5-FOA和尿嘧啶購(gòu)自Sigma公司。5-FOA用DMSO溶解，配制成600 mg/mL母液，備用；尿苷配制成6 mg/mL水溶液過濾除菌備用。

CA培養(yǎng)基：NaNO3 2 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂粉 15 g/L，滅菌后按量加入尿苷至終濃度為60 mg/L。

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆 200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 載體構(gòu)建 以NCBI下載已知的pyrG基因序列，本地BLAST搜索Ts93全基因組序列，獲取TspyrG基因序列。圖1為載體圖，載體構(gòu)建主要過程如下：以pCAMBIA1300載體為骨架，用XhoⅠ單切后自連，去除潮霉素基因。然后擴(kuò)增473 bp eYFP基因序列（只取了部分eYFP基因序列，用于后期敲除突變株的PCR驗(yàn)證，引物為XbeYFPU/BaeYFPL），通過XbaⅠ/BamHⅠ雙切后連接成1300pyrGkh；敲除載體按照同源置換方法，設(shè)計(jì)引物（表1）分別擴(kuò)增基因5′端1 079 bp同源序列（引物HiTspyrGSU/XbTspyrGSL），3′端974 bp同源序列（引物BaTspyrGXU/KpTspyrGXL），酶切連接至1300pyrGkh載體，構(gòu)建TspyrG基因敲除載體1300ΔpyrG。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TspyrG基因ORF（引物XhTspyrGU/XhTspyrGL），以1300th載體為骨架，通過酶切連結(jié)，將其中的潮霉素抗性基因ORF替換為pyrG基因的ORF，構(gòu)建TspyrG基因重組載體1300pyrG。轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)選用綠色熒光eGFP基因（引物XbeGFPU / BaeGFPL），構(gòu)建載體1300pyrGeG（圖1）。eGFP基因重組過程如下：首先將eGFP與TspyrG兩個(gè)基因分別加上啟動(dòng)子與終止子，然后在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中，由于左（left border）右（right border）邊界內(nèi)的序列都會(huì)隨機(jī)整合進(jìn)目標(biāo)菌的基因組中，所以eGFP與pyrG這兩個(gè)蛋白在各自的啟動(dòng)子下分別表達(dá)。所以，如果以TspyrG敲除突變株為受體菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功的轉(zhuǎn)化子就會(huì)因?yàn)橹匦芦@得pyrG蛋白而恢復(fù)表型。而由于eGFP蛋白也成功轉(zhuǎn)入，就會(huì)使轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生熒光現(xiàn)象。

1.3.2 ATMT轉(zhuǎn)化 PDA培養(yǎng)獲取木霉菌分生孢子，稀釋至5×105 CFU/mL，與等體積已活化含對(duì)應(yīng)載體的農(nóng)桿菌混勻，取200 μL混合液涂板，具體操作方法參見Fu等[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉Ts93pyrG基因克隆

于NCBI下載10個(gè)pyrG基因序列，通過本地BLAST，在 Ts93全基因組中搜索相似基因，篩選獲得TspyrG基因，該基因無內(nèi)含子，大小 1 140 bp，編碼1個(gè)379氨基酸的蛋白（NCBI登錄號(hào)OP186039），序列比對(duì)表明（圖2），該蛋白與T.asperellum的乳清苷-5-磷酸脫羧酶（NCBI登錄號(hào)GFP54067.1）相似度達(dá)到99.74%，蛋白質(zhì)含有9個(gè)高度保守motif，與該酶的功能密切 相關(guān)。

2.2 5-FOA對(duì)Ts93菌株致死濃度確定

5-FOA按量添加至CA培養(yǎng)基，分別配制成終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的平板，接種直徑0.5 cm的Ts93菌餅，測(cè)定對(duì)野生株的致死濃度。結(jié)果見圖3，隨著濃度的升高，菌落直徑逐漸減小，至1.2 mg/mL時(shí)，Ts93完全無法生長(zhǎng)，因此，為了降低突變株假陽性概率，將篩選濃度提高至1.5 mg/mL。

2.3 TspyrG基因敲除

通過ATMT方法進(jìn)行基因敲除，其中TspyrG基因上游片段大小為1 080 bp，下游片段為946 bp，結(jié)果見圖4-A，構(gòu)建成功的載體見圖4-B。共培養(yǎng)15個(gè)平板，挑選了33個(gè)可能的突變株。按照同源置換原理，TspyrG基因會(huì)被敲除載體中eYFP序列替換。因此，隨機(jī)挑選6個(gè)突變株提取DNA，以eYFPU/eYFPL引物，擴(kuò)增eYFP序列。結(jié)果見圖4-C，其中1、3、5、6擴(kuò)增條帶明顯。因此，挑選1號(hào)、3號(hào)兩個(gè)突變株進(jìn)行單孢分離純化，挑取DNA，通過4輪PCR進(jìn)一步確定是否為理想的TspyrG基因敲除突變株（圖4-D）。PCR驗(yàn)證突變株的原理參考Fu等[13]。結(jié)果表明，TspyrG基因敲除突變株能夠擴(kuò)增到eYFP序列，同時(shí)，由于eYFP準(zhǔn)確替換了TspyrG基因，所以在該基因5′同源序列上游的引物YZTspyrGu結(jié)合eYFPL引物可以擴(kuò)增出條帶。為了排除基因成功敲除的同時(shí)，會(huì)有額外的T-DNA隨機(jī)整合在基因組其他位置，從而影響其他基因的功能，通過設(shè)計(jì)T-DNA的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。結(jié)合PCR驗(yàn)證結(jié)果，確定TspyrG基因被成功敲除，同時(shí)無額外的T-DNA整合在基因組。

2.4 敲除突變株特性分析

隨機(jī)挑選2個(gè)敲除突變株進(jìn)行功能分析（圖5）。在不含5-FOA與尿苷的CA培養(yǎng)基上，Ts93生長(zhǎng)正常，而兩突變株無法生長(zhǎng)；添加尿苷后，Ts93與兩株突變株均能正常生長(zhǎng)；而在添加了

5-FOA、不加尿苷的培養(yǎng)基上，3個(gè)菌株均無法生長(zhǎng)；同時(shí)添加5-FOA與尿苷情況下，Ts93無法生長(zhǎng)，而2個(gè)突變株生長(zhǎng)正常。結(jié)果表明，敲除TspyrG基因后，菌株無法自主合成尿嘧啶，需要額外補(bǔ)充，但突變株同時(shí)具有抗5-FOA的能力（圖5）。

為了進(jìn)一步確定該基因破壞后是否會(huì)影響菌株其他生理功能，分析突變株的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢能力（圖6）。在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，Ts93與突變株菌落直徑均達(dá)到7.0 cm左右，三者生長(zhǎng)速度無明顯差異（P>0.05）；培養(yǎng)96 h后，菌株都產(chǎn)綠色孢子，孢子量均達(dá)到107CFU/mL，三者產(chǎn)孢量也無明顯差異（P>0.05）。綜合研究結(jié)果表明，TspyrG基因?qū)晟L(zhǎng)等功能無明顯影響。

2.5 尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株庫(kù)的構(gòu)建

為驗(yàn)證該基因作為選擇標(biāo)記的可靠性，以ΔTspyrG突變株作為受體菌，以改造后的1300pyrGeG為轉(zhuǎn)化載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于載體中含有TspyrG基因的完整表達(dá)框，成功轉(zhuǎn)化的菌株可以在不含尿苷的基礎(chǔ)

培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，以此作為篩選標(biāo)記挑選出成功的轉(zhuǎn)化子。同時(shí)，用eGFP（enhanced green fluorescent protein，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）基因進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明，共培養(yǎng)15個(gè)平板，篩選獲得30個(gè)可能的突變株，與基因敲除中30個(gè)板共獲得33個(gè)突變株無明顯差異。同時(shí)，30個(gè)突變株的生長(zhǎng)速度有明顯差異，其中5個(gè)比野生菌Ts93快，7個(gè)比野生株慢，其他菌株無明顯差異（圖1）。隨機(jī)挑選2個(gè)轉(zhuǎn)化成功的突變株（生長(zhǎng)速度與野生株無明顯差異）進(jìn)行分析，其中突變株1在28 ℃培養(yǎng)12 h，突變株2培養(yǎng) 26 h。結(jié)果表明（圖7），在不含5-FOA與尿苷的CA培養(yǎng)基上，Ts93與回補(bǔ)株均能正常生長(zhǎng)，但ΔTspyrG由于無法合成尿嘧啶而不能生長(zhǎng)；在補(bǔ)充尿苷后，三者都能夠正常生長(zhǎng)；而在只加5-FOA但不含尿苷的CA培養(yǎng)基上，三者均不能生長(zhǎng)；當(dāng)5-FOA與尿苷都補(bǔ)充后，ΔTspyrG可以生長(zhǎng)，其他兩株均無法生長(zhǎng)。eGFP基因成功轉(zhuǎn)化，菌絲與分生孢子梗有明顯熒光。同時(shí)，通過PCR對(duì)突變株進(jìn)行驗(yàn)證。選取引物XhTspyrgU/XhTspyrGL擴(kuò)增TspyrG基因ORF（1 156 bp），其中野生株（泳道1）與回補(bǔ)突變株（泳道2）均可以擴(kuò)增到該基因片段，但是敲除突變株無法擴(kuò)增到基因片段。綜合上述結(jié)果表明，以ΔTspyrG為受體菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，由于TspyrG基因的回補(bǔ)，使ΔTspyrG回復(fù)了野生株特性。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，建立了一種無抗生素篩選標(biāo)記的木霉菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠用于隨機(jī)突變株庫(kù)的構(gòu)建，同時(shí)，TspyrG基因也可以作為轉(zhuǎn)基因過程的一種篩選標(biāo)記，用于基因操作。該基因在酵母菌中研究很詳細(xì)，是常用的一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記[14-15]，在絲狀真菌中對(duì)該基因的研究主要集中在曲霉及部分植物病原菌[16-17]。木霉菌中關(guān)于該基因的研究最早是Berges等[18]在里氏木霉中（T.reesei）的突變株庫(kù)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)相關(guān)基因ura3和ura5。而本研究首次在棘孢木霉中克隆出該基因，同時(shí)，也分析了該基因作為篩選標(biāo)記的可行性?；蚍治霰砻?，絲狀真菌中該基因的同源性很高，具有9個(gè)保守的Motif，蛋白質(zhì)大小在300～500氨基酸。進(jìn)一步研究表明，該基因破壞后，對(duì)于菌株的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢等能力無明顯影響，這也為今后用于構(gòu)建隨機(jī)突變株并篩選功能基因提供保障。同時(shí)，以ΔTspyrG為受體菌構(gòu)建突變株，只需要使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基即可篩選獲得隨機(jī)突變株，大大節(jié)約了篩選成本，降低了抗生素的環(huán)境污染。對(duì)eGFP基因的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，成功轉(zhuǎn)化后的突變株在性狀上回復(fù)了野生株的特性，而且該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得的突變株具備T-DNA的隨機(jī)整合特性，產(chǎn)生的突變株大部分生長(zhǎng)無明顯影響，但也有部分菌株出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)孢能力減弱現(xiàn)象，說明T-DNA的隨機(jī)整合造成了部分功能基因的缺失，從而影響菌株生長(zhǎng)。木霉菌是傳統(tǒng)的生防菌，具備誘導(dǎo)植物抗性、拮抗病原菌、降解環(huán)境污染物等多種功能，而且具備基因組小，分生孢子單倍體等適合遺傳轉(zhuǎn)化特性，是很好的基因功能研究材料。而TspyrG基因作為一種遺傳選擇標(biāo)記，可用于基因分子操作如雙敲除、多基因敲除，具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究從棘孢木霉Ts93中克隆獲得編碼乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因TspyrG，該基因缺失后，菌株無法在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，需要額外補(bǔ)充尿嘧啶，但突變株能夠耐受1.0 mg/mL的5-FOA。以該基因缺失突變株為受體菌，通過回補(bǔ)試驗(yàn)表明，回補(bǔ)突變株能夠恢復(fù)缺失功能，同時(shí)，轉(zhuǎn)化具備隨機(jī)整合特性，說明，該基因可以作為 Ts93基因操作的篩選標(biāo)記。

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Establishment of Transformant System for Trichoderma asperellum Using TspyrG as Selected Marker

FAN Lili，WEI Runling，F(xiàn)U Kehe，LIU Wentao and SHI Jing

（Department of Biology，Nanchang Normal University，Nanchang 330032，China）

Abstract In this study，weTcqgh3FJQioCvUKLSL+GYg== cloned a TspyrG gene，which encodes orotidine-5′-phosphate decarboxylase，an essential enzyme in pyrimidine biosynthesis in T.asperellum Ts93 strain.The TspyrG gene，which does not contain introns，comprises an open reading frame of 1 140 codons and encode a 379 aa protein.The ΔtspyrG mutants were obtained via Agrobacterium-mediated transformation，which were unable to grow without the uracil.And the transformant plasmid 1300pyrG was constructed successfully based on the plasmid PCAMBIA1300.Agrobacterium transformation system with uracil auxotroph maker was successfully constructed using ΔTspyrG as recipient strain.Transformant of eGFP showed no significant difference between auxotrophic selection marker and antibiotic selection marker in the transformant system.

Key words Trichoderma asperellum; Auxotroph; Agrobacterium-mediated transformation

Received 2023-03-06 Returned 2023-04-06

Foundation item Project of Jiangxi Provincial Department of Education （No.151252，No.GJJ161233）;Regional Project of National Natural Science Foundation of China（No.31660020）.

First author FAN Lili，female，Ph.D，lecturer.Research area：molecular genetics of Trichoderma. E-mail：llfan31@163.com

Corresponding author FU Kehe，male，Ph.D，lecturer.Research area：microbial soil remediation. E-mail：khfu0112@163.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

基金項(xiàng)目：江西省教育廳項(xiàng)目（151252，GJJ161233）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目（31660020）。

第一作者：范莉莉，女，博士，講師，主要從事木霉菌分子遺傳研究。E-mail：llfan31@163.com

通信作者：傅科鶴，男，博士，講師，主要從事微生物土壤修復(fù)研究。E-mail：khfu0112@163.com