植物組織培養(yǎng)中污染防治方法研究

唐佳佳 徐飛揚(yáng)

摘? ?要：污染是植物組織培養(yǎng)中三大難題之一，嚴(yán)重影響培養(yǎng)物的生長與分化，增加了科研和生產(chǎn)運(yùn)行成本甚至無法進(jìn)行。通過分析植物組織培養(yǎng)過程中污染引發(fā)的原因，總結(jié)較好的污染防治方法。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng);污染;防治

植物組織培養(yǎng)中的污染指的是培養(yǎng)期間培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料生成雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。造成污染的原因很多，從時間角度可以將污染發(fā)生原因歸納為3個階段：前期準(zhǔn)備階段，包括培養(yǎng)基滅菌不徹底、器皿的滅菌不完全，外植體的選擇不當(dāng)與消毒不徹底;無菌操作階段，包括無菌操作室滅菌和超凈工作臺有問題，操作不規(guī)范，操作工具的消毒不徹底等;培養(yǎng)階段，培養(yǎng)環(huán)境不清潔和培養(yǎng)體系意外開放等。

1? ? ?前期準(zhǔn)備階段

1.1? ?器具的準(zhǔn)備與滅菌

組織培養(yǎng)階段常用的培養(yǎng)器皿有三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、玻璃瓶等，洗衣粉水浸泡沖洗干凈后，用蒸餾水潤洗瓶的內(nèi)壁，烘箱烘干備用。

1.2? ? 培養(yǎng)基

1.2.1? 母液的配制與保存。配置母液的藥品采用純度較高的分析純或化學(xué)純，用水采用純度較高的蒸餾水或去離子水（配制培養(yǎng)基時的用水一樣），以免帶入雜質(zhì)和有害物質(zhì)污染培養(yǎng)材料，分別配制、單獨(dú)保存于冰箱，低溫4℃。

1.2.2? ?培養(yǎng)基的成分、pH、瓊脂。（1）減少培養(yǎng)基中的有機(jī)成分。宋鋒惠等[1]去除培養(yǎng)基中的有機(jī)成分（保留了肌醇），發(fā)現(xiàn)對阿月渾子叢生芽增殖沒有影響，還抑制了細(xì)菌生長，分析認(rèn)為細(xì)菌生長可能需要有機(jī)成分。無糖培養(yǎng)去除培養(yǎng)基中的糖及有機(jī)成分，以CO2作為碳源，污染率明顯降低。（2）降低pH。大多數(shù)細(xì)菌在pH小于4.5h不能正常生長，周俊輝等[2]通過酸化培養(yǎng)基，使薔薇屬植物在組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的細(xì)菌污染減少。（3）去除瓊脂。液體培養(yǎng)基具有通氣培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

1.2.3? 培養(yǎng)基中加入消毒劑。（1）抗生素。王亦菲等[3]在彩色海芋的組織培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)200mg/L青霉素，可以有效抑制內(nèi)生菌的生長;朱光廉[4]發(fā)現(xiàn)2g/L苯菌靈和2g/L鏈霉素，可以對相思樹的芽和莖段起到很好的滅菌效果;邢東方等[5]使用150mg/L頭孢霉素，抑制棗在組織培養(yǎng)中的污染;劉占彬等[6]以多花黑麥草種子為外植體的組織培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基中添加70mg/L制霉菌素、10mg/L氨芐西林鈉和0.1%次氯酸鈉，可以很好地控制污染。（2）其他。許婉芳等[7]發(fā)現(xiàn)金線蓮在含多菌靈的培養(yǎng)基中生長健壯無污染;李英慧等[8]發(fā)現(xiàn)稀釋5000倍液的75%百菌清，可有效防治青霉菌污染蘋果試管苗。

1.2.4? 培養(yǎng)基的分裝與滅菌。培養(yǎng)基要趁熱倒入玻璃容器中，注意不要漏在容器口或壁上，立即用封口膜封口，以免雜菌污染。

（1）高壓蒸汽滅菌法，使用時要保證滅菌鍋內(nèi)部清潔，內(nèi)部的冷氣排盡，裝填的滅菌物避免堆放過滿，保持滅菌鍋溫度在121℃20min，且培養(yǎng)基應(yīng)在24h內(nèi)及時滅菌，以免菌類大量繁殖嚴(yán)重污染培養(yǎng)基。

（2）過濾滅菌。對一些在高壓條件下不穩(wěn)定或易分解的藥品，如GA3、IAA等必須經(jīng)過過濾滅菌的方法進(jìn)行滅菌處理，將滅菌后的藥液加入到經(jīng)過高壓滅菌的凝固前4～50℃的培養(yǎng)基中，使用的過濾器等必須經(jīng)過高壓滅菌。

培養(yǎng)基滅菌結(jié)束后取出待冷卻，一般觀察2～3d無污染現(xiàn)象后方可使用，最好在2周內(nèi)使用。

1.3? ?外植體

1.3.1? 外植體的選擇與預(yù)處理。（1）采集前預(yù)先培養(yǎng)。通常田間材料較溫室材料帶菌多，溫室材料較水培材料帶菌多，所以對污染較嚴(yán)重的田間材料，可提前修剪、套袋或改為室內(nèi)培養(yǎng)或水培，帶菌嚴(yán)重的外植體采集前，一般先噴灑殺蟲劑或殺菌劑。（2）取材的年齡、大小、部位。植物體的各個部位幾乎都可以用來組織培養(yǎng)，其中植物胚不易污染且具有幼嫩的分生組織細(xì)胞，莖尖遺傳性穩(wěn)定，病毒含量低，胚和莖尖是較好的外植體。一般說來，體積大的材料較體積小的材料帶菌多。孟楊等以湖北百合不同大小的鱗片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大的鱗片的污染率高于小的。（3）取材的季節(jié)和時間。取材的最佳時間在3d連續(xù)晴朗天氣的某下午，取材季節(jié)在3～5月最佳，在材料休眠末期或萌動前，取外植體較為合適，此時，材料積累了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源激素，且病菌還未到活躍期。湯詩杰等[9]在南京椴組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)3～4月污染控制容易，6～7月污染控制較為困難;王吉鳳等[10]在芍藥組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)2月、8～10月污染最高，4月污染最低;7～10月、1～2月是高溫多雨季節(jié)，高溫多雨的環(huán)境有利于污染的發(fā)生;8月和9月是牧草蟲的大量繁殖階段，極易嚴(yán)重污染組培。（4）采集后的預(yù)處理。從室外采集回來的材料，用擦過酒精的剪刀剪除多余的枯枝黃葉，洗去泥土，用洗潔精或肥皂水清洗表面，用軟毛刷清洗材料表面，然后用自來水沖洗1～2h。

1.3.2? 消毒處理（無菌操作臺上）。對已污染的較為珍貴或稀少的培養(yǎng)物，可切取離污染菌較遠(yuǎn)的部分重新消毒接種。

2? ? ?無菌操作階段

2.1? ?準(zhǔn)備室、接種室、培養(yǎng)室消毒

在每次接種前都必須徹底消毒準(zhǔn)備室、接種室和培養(yǎng)室，常用的消毒溶液有70%酒精和2%的新潔爾滅溶液。接種前后，都要用70%酒精擦洗超凈工作臺，70%酒精噴霧噴灑門窗、地面和墻壁，及時打掃衛(wèi)生，接種前，要開紫外燈2～40min，關(guān)閉后3～60min進(jìn)入操作。

2.2? ?操作

操作前，修剪過長指甲，用洗潔精清洗雙手，帶上手套和口罩，用70%的酒精擦洗手套且在操作中經(jīng)常擦洗，換上干凈固定的拖鞋和工作服。操作過程中，轉(zhuǎn)接瓶與被轉(zhuǎn)接瓶應(yīng)緊挨酒精燈，手盡量避免在器皿上方晃動，接種時，鑷子避免觸到瓶口，并在下風(fēng)方向操作，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣，避免走動引起菌霧，接種時避免說話、隨意走動，手不要離開操作臺，中間不停地用酒精擦洗，接種前，用酒精浸泡接種用的工具，灼燒后冷卻備用，防治交叉污染，接種過程中工具要不停的蘸酒精灼燒。

3? ? ?培養(yǎng)階段

移植培養(yǎng)室光照前可以進(jìn)行一段時間的黑暗處理或低溫處理。

培養(yǎng)期間保持培養(yǎng)室的清潔以免引起細(xì)菌和霉菌污染，一般每周用高錳酸鉀（3～6g/m3）和甲醛（4～6mL/m3）熏蒸1次。李文凱等[11]發(fā)現(xiàn)用蒼術(shù)熏蒸的滅菌效果維持的時間較長，且與紫外線照射和甲醛熏蒸無顯著差異，關(guān)鍵是對人體無刺激和副作用。已污染的培養(yǎng)瓶要及時用高壓滅菌，防止病菌污染培養(yǎng)室里其他培養(yǎng)瓶。

4? ? ?結(jié)語

隨著社會的進(jìn)步科技的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用?？刂莆廴締栴}變得尤為重要。所以，必須加強(qiáng)研究分析，對引起植物組織培養(yǎng)中污染的原因要提高認(rèn)識，采取必要措施進(jìn)行預(yù)防和控制，保證培養(yǎng)物正常生長發(fā)育。

參考文獻(xiàn)

[1]宋峰惠，李康，史彥江.阿月渾子組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（6）

[2]周俊輝，周厚高，劉花全.植物組織培養(yǎng)中的內(nèi)生細(xì)菌污染問題[J].廣西植物，2003（1）

[3]邢東方，尚霄麗，馮建燦.棗組織培養(yǎng)中抗生素對污染的抑制作用[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2010（1）

（責(zé)任編輯? ?張芝）