番茄CYP450基因家族鑒定及病原菌脅迫相關成員的生物信息學分析

摘要：細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶是陸地植物中最大的酶蛋白基因家族，具廣泛催化活性，參與植物多種初生代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成。分析番茄（Solanum lycopersicum L.）CYP450基因家族成員的數(shù)量、序列特點、系統(tǒng)演化關系、在病原菌誘導下的表達模式和互作網(wǎng)絡，為闡明番茄CYP450基因的生物學功能奠定基礎。通過HMM檢索和BLAST比對2種方法在番茄中得到328條CYP450序列，歸屬于9個家族簇；理化性質(zhì)分析結果顯示番茄CYP450蛋白大多為親水性蛋白質(zhì)，包含豐富的堿性氨基酸，主要定位于葉綠體和質(zhì)膜；番茄葉霉病病菌（Cladosporium fulvum）誘導條件下的59個差異表達基因分屬7個家族簇，相同家族簇成員具相似蛋白保守基序和基因結構；16個與聚炔類合成關鍵基因有相似表達模式的基因均來自CYP71和CYP72家族簇，它們可能在聚炔類合成通路的下游發(fā)揮重要作用，但其功能還需進一步驗證。

關鍵詞：番茄；聚炔類化合物；CYP450基因家族；番茄葉霉菌；生物信息學分析

中圖分類號：S641.201 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0034-13

收稿日期：2023-10-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31800179）；河南省杰出青年科學基金（編號：232300421008）。

作者簡介：那日松（1981—），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士，副教授，碩士生導師，主要從事天然脂肪酸代謝產(chǎn)物全合成與藥物活性機制研究。E-mail：nrs@henau.edu.cn。

通信作者：曹亞男，博士，講師，主要從事藥用植物分子系統(tǒng)學研究。E-mail：caoyn47@163.com。

CYP450酶是一類廣泛存在于微生物、動植物及人體中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結合的血紅素單加氧酶，是陸生植物中最大的酶蛋白基因家族，約占植物基因組編碼基因的1%，在植物的各個器官都有分布［1］。CYP450具有廣泛催化活性，參與植物多種初生代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成，如萜類、生物堿、甾醇、脂肪酸、氰胺、植物激素、色素等［2］。陸地植物CYP450基因可歸為11個家族簇（clan）：CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746為單家族簇；CYP71、CYP72、CYP85、CYP86為多家族簇［3-4］。CYP71家族簇包括超過50%的植物CYP450成員，CYP746家族簇主要存在于綠藻和苔蘚中，在石松類和導管植物中目前還未有發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸代謝相關的基因主要集中在CYP86家族簇的CYP94亞家族簇中［1，3］。植物CYP450基因的表達受多種因素諸如光照、溫度、機械損傷以及病原菌侵染等的影響［5］。

聚炔類化合物（PA）是一大類非揮發(fā)性植物活性物質(zhì)，具有對熱不穩(wěn)定、易降解的特性，難以儲存；具有至少2個碳-碳三鍵或乙炔基官能團，通常來源于脂肪酸或聚酮類等前體化合物［6-7］。PA具有廣泛的生物活性，包括抗菌性等，在天然農(nóng)藥和醫(yī)藥等領域引起廣泛關注［7-8］。PA已在高等植物24個科中被發(fā)現(xiàn)，但大多來源于桔梗類植物，如菊科、五加科和傘形科［9］。茄科植物雖然不能自發(fā)性地產(chǎn)生PA，但在真菌的誘導下可以大量產(chǎn)生此類物質(zhì)，以增強植物自身的抗病性［10］。在植物中一共發(fā)現(xiàn)3條PA生物合成途徑，其中crepenynate路徑被認為是聚炔類化合物合成的主要途徑，并且僅在桔梗類植物中被發(fā)現(xiàn)，它產(chǎn)生了大多數(shù)目前已知的PA［8，11］。在病原菌誘導條件下，茄科植物產(chǎn)生的PA也被認為是通過crepenynate路徑產(chǎn)生的。例如，在番茄葉霉病病菌（Cladosporium fulvum）侵染下，番茄（Solanum lycopersicum）能夠產(chǎn)生大量與傘形科植物類似的法卡林醇類PA［10］。在crepenynate合成通路中，前人的研究表明脂肪酸去飽和酶2（即fatty acid desaturase 2，F(xiàn)AD2）在PA生物合成的啟動中起重要作用［12-15］。而在PA合成的下游階段CYP450家族似乎是不可缺的，在多個步驟發(fā)揮重要作用［16］。

番茄作為主要的蔬菜作物之一，在全世界各地被廣泛種植。葉霉病作為番茄三大病害之一，其暴發(fā)與流行已嚴重威脅著番茄的生產(chǎn)［17］。而番茄葉霉病病菌（C. fulvum）誘導下PA的產(chǎn)生，能顯著增強番茄的抗病性。然而，在番茄中，PA合成基因除了FAD2家族外，其他還未見報道；CYP450基因家族是否真正地參與番茄中PA的生物合成？如果參與，其又是如何發(fā)揮作用的？還未有人系統(tǒng)地研究過。本研究以番茄（S. lycopersicum）作為研究對象，對其CYP450基因家族進行鑒定、并解析系統(tǒng)進化關系；篩選C. fulvum誘導條件下CYP450的差異表達基因，基于生物信息學研究方法，對蛋白保守基序、基因結構及其在染色體上的分布、基因表達模式和蛋白互作網(wǎng)絡等進行分析，以期為將來聚炔類物質(zhì)生物合成下游基因的挖掘和驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 番茄CYP450基因家族成員鑒定

通過2種方法確認番茄CYP450家族蛋白序列。首先，從Pfam數(shù)據(jù)庫獲得CYP450超家族的保守結構域信息（PF00067），利用TBtools v1.129軟件中的Simple-HMM Search工具搜索獲得番茄CYP450序列［18］。同時，以擬南芥（Arabidopsis thaliana）CYP450蛋白序列為搜尋參照（query），通過blastp和tblastn搜索獲得E值小于10-10的番茄同源序列。搜索和比對2種方法所得序列去重后，通過NCBI中CD-search程序進行結構域確認，最終獲得番茄CYP450家族成員（表1）用于后續(xù)分析。

1.2 番茄CYP450基因家族的系統(tǒng)進化分析

把番茄和擬南芥CYP450蛋白序列以及NCBI下載的蓖麻（Ricinus communis）CYP450蛋白序列（NCBI 登錄號：29686.m000867）整合，將所得文件使用MAFFT v7.490工具進行多序列比對，最后，利用TBtools v 1.129 軟件采用最大似然（maximum likelihood，ML）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設置為5 000次重復。

1.3 病原菌脅迫下的番茄CYP450基因表達模式分析

通過NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫下載并分析番茄VF36在C. fulvum和水對照處理12、24、48 h之后12個組織的基因表達數(shù)據(jù)（GSE編號：GSE123543，項目編號：PRJNA509154）；利用TBtools v 1.129軟件包Differential Gene Expression Analysis DESeq2 Wrapper插件進行差異表達基因篩選（P<0.01；|log2foldchange|>1），然后再利用該軟件包的HeatMap程序繪制番茄CYP450差異表達基因的時間表達熱圖。采用百邁克云平臺在線程序coexpression_cluster對CYP450差異表達基因與4個番茄聚炔類化合物合成基因（FAD2：Solyc12g100240.1，Solyc12g100250.1，Solyc12g100260.1；脫羧酶基因：Solyc12g100270.1）的表達模式進行聚類分析［19］。

1.4 番茄CYP450蛋白理化性質(zhì)分析

通過ExPASy程序（https：//cn.expasy.org/tools）分析在病原菌誘導條件下，番茄CYP450基因家族成員蛋白的分子量、等電點和親疏水性等理化特性［20］。利用WOLF PSORT在線網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對CYP450蛋白進行亞細胞定位預測。

1.5 番茄CYP450差異表達基因保守基序和基因結構分析

利用MEME v5.5.3（https：//meme-suite.org/tools/meme）在線檢測番茄CYP450蛋白序列保守基序。根據(jù)番茄基因組注釋文件gff3（https：//www.phytozome.net/tomato）中CYP450基因的外顯子和內(nèi)含子位置信息，使用GSDS在線網(wǎng)站（https：//gsds.gao-lab.org1）繪制其基因結構圖。

1.6 番茄CYP450差異表達基因染色體定位及共線性分析

根據(jù)番茄基因組注釋文件gff3和基因組序列文件，利用TBtools v 1.129 軟件包的One Step MCScanX插件分析CYP450差異表達基因的共線性，并進行染色體定位［21］。最后，通過TBtools v 1.129軟件對結果進行可視化處理。

1.7 番茄CYP450蛋白互作網(wǎng)絡分析

利用String蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）分析C. fulvum誘導條件下，CYP450蛋白的互作網(wǎng)絡。

2 結果與分析

2.1 番茄CYP450基因家族的系統(tǒng)進化關系

結合檢索和比對2種方法共在番茄基因組中得到328條CYP450序列（表1），氨基酸數(shù)量為75（Solyc03g112017.1.1）～759（Solyc03g112017.1.1）個。將這些序列與擬南芥和蓖麻的CYP450一起進行系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)進化樹和CYP450基因分類原則，在植物所擁有的11個家族簇中，番茄CYP450蛋白可歸屬為其中的9個（圖1）。與擬南芥和桃（Prunus persica）類似，番茄中也沒有CYP727家族簇和CYP746家族簇基因成員。在9個家族簇中，CYP71最大，包含207個CYP蛋白；其次為CYP72，含40個CYP蛋白；再次為CYP85和CYP86，分別含34、33個CYP蛋白；CYP74含7個CYP蛋白，CYP97含4個CYP 蛋白；CYP51、CYP710和CYP711均只含有1個CYP 蛋白。

2.2 番茄CYP450基因表達模式分析

根據(jù)表達量分析結果，有179個基因在番茄葉霉菌誘導后發(fā)生了表達，與對照相比，在其中檢測到59個差異表達基因。與4個番茄PA合成基因的共表達聚類分析結果（圖2）顯示，有8個基因與FAD2基因Solyc12g100240.1、Solyc12g100250.1和Solyc12g100260.1具有相似表達模式，隨病原菌誘導時間增長表達量呈降低—升高—降低的趨勢；其他8個基因與脫羧酶基因Solyc12g100270.1表達模式類似，隨誘導時間增長表達量呈逐漸降低的趨勢。

2.3 番茄CYP450蛋白的理化性質(zhì)

對番茄59個差異表達基因的蛋白質(zhì)進行基本理化性質(zhì)分析，結果（表2）顯示，這些CYP450基因編碼的氨基酸數(shù)量為390～579個， 平均長度為507個氨基酸，其相對分子量最小為45 185.27 u，最大為67 461.73 u，平均為57 927 u。等電點在5.85～9.49范圍內(nèi)，從整體上看，超過81%的CYP450家族蛋白質(zhì)等電點大于7，等電點處于堿性范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子含有豐富的堿性氨基酸。蛋白質(zhì)疏水性分析結果表明，除Solyc03g114940.3.1、Solyc05g047680.4.1外，其余57個CYP450家族蛋白親水性系數(shù)均小于0，說明該家族蛋白質(zhì)絕大多數(shù)屬于親水性蛋白質(zhì)。亞細胞定位預測結果顯示，大多數(shù)蛋白（40個）定位于葉綠體，12個定位于質(zhì)膜，3個定位于細胞質(zhì)，各有1個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核、細胞骨架和液泡。

2.4 番茄CYP450基因保守基序和結構域

使用MEME網(wǎng)站查找番茄CYP450蛋白保守基序，共鑒定到10種motif（圖3），最保守的motif為1、2和4，均存在于57條序列中；包含motif最多的為CYP71家族簇成員（7～10個），其中23條序列包含10個motif；最少的為CYP72家族簇（1～4個）和CYP74家族簇（1個）；CYP86家族簇成員包含的motif數(shù)量為5～6個；CYP51、CYP711、CYP86和CYP97家族簇分別包含4、6、3、4個motif，在每個家族簇內(nèi)部，各自的所有成員均由相同motif組成。從整體上看，同家族簇的CYP450蛋白motif組成類似。

基因結構分析結果表明，CYP450基因的內(nèi)含子數(shù)量為0～13個，大部分（約89.8%）CYP450基因含有的內(nèi)含子數(shù)量小于4個。Solyc05g016330.3.1擁有的內(nèi)含子最多，數(shù)量達到13個；其次是Solyc04g083160.2.1、Solyc04g078900.3.1和Solyc10g083790.3.1，各含有8個內(nèi)含子。在系統(tǒng)發(fā)育樹中同家族簇的CYP450基因通常具有相似的基因結構特征，即內(nèi)含子、外顯子的數(shù)量和排列類似。

2.5 番茄CYP450基因染色體定位及共線性分析

根據(jù)番茄基因組注釋文件，59條差異表達的CYP450基因序列不均勻地分布在12條染色體上，染色體10上含有的序列最多，12條序列聚集成2個基因簇，其次是染色體07，7條序列也是分成2組，染色體02和11上含有的序列最少，均包含2條序列。其余36條序列以聚集、分成2組或者散列的狀態(tài)分布在8條染色體上（圖4）。

共線性分析發(fā)現(xiàn)，59條序列中重復類型最多的為散在重復（dispersed duplication）類型，有25條序列，其次是串聯(lián)重復（tandem duplication）類型，有22條序列，10條序列被識別為全基因組/片段重復（WGD/segmental duplication）類型，其他2條序列被歸為近端重復（proximal duplication）類型。由圖4和表3可知，番茄CYP450基因家族與其他基因通過全基因組/片段重復的形式共形成11組旁系同源基因?qū)Γ珻YP450基因家族內(nèi)部通過串聯(lián)重復的形式形成1組旁系同源基因?qū)Α?/p>

2.6 番茄CYP450蛋白互作關系

利用在線軟件String預測番茄CYP450家族成員同源蛋白之間的互作關系。結果（圖5）顯示，在59個差異表達基因中，來自CYP85家族簇的2個蛋白，Solyc08g075320.4.1和Solyc04g078900.3.1之間具有較強關聯(lián)；CYP71家族簇的Solyc03g122360.3.1、CYP72家族簇的Solyc05g011970.3.1、CYP51家族簇的Solyc01g008110.4.1和CYP71家族簇的Solyc02g069490.4.1之間彼此關聯(lián)，形成關系鏈。CYP85家族簇的Solyc12g006460.2.1、CYP71家族簇的Solyc04g083160.2.1和CYP86家族簇的Solyc10g080840.1.1之間相互作用，形成1個閉合聯(lián)結通路，其中，與脫羧酶Solyc12g100270.1共表達的Solyc04g083160.2.1與Solyc12g006460.2.1蛋白關聯(lián)最強，此外，該通路還與3個其他蛋白間存在關聯(lián)。

3 討論

細胞色素P450酶是植物中最大的酶家族，同時參與初生和次生代謝。在不同植物中，其家族成員數(shù)量變化較大，如在作物中，擬南芥有272個，水稻（Oryza sativa）有355個，小麥（Triticum aestivum）則多達1 476個；在藥用植物中，楤木（Aralia elata）有254個，紅豆杉（Taxus chinensis）有293個，人參（Panax ginseng）則有484個［22-25］。本研究從番茄中篩選到328個CYP450，將這些序列與擬南芥和蓖麻CYP450一起比對，然后構建系統(tǒng)進化樹（圖1），發(fā)現(xiàn)與擬南芥和桃類似，番茄中也沒有CYP727和CYP746家族簇成員［26］。與擬南芥一致，這些CYP450成員大多（超過95.7%）分布在4個多基因家族簇（CYP71、CYP72、CYP85和CYP86），其中，CYP71含有的基因數(shù)量最為豐富，有207個。在蛋白保守基序和基因結構上（圖3），番茄不同家族簇的CYP450成員含有的motif數(shù)量及種類變化大，基因長度跨度大、外顯子數(shù)量變化明顯，這可能與植物中CYP450超家族參與豐富的生物學過程有關。

與水對照相比，在葉霉病病菌誘導條件下，共有59個基因的表達量發(fā)生了顯著變化，這些基因主要來源于7個家族簇，大多定位于葉綠體（40個）和質(zhì)膜（12個），至今，還沒有發(fā)現(xiàn)定位在線粒體上的植物CYP450［27］。在植物中，WGD被認為是導致植物專性代謝產(chǎn)物多樣化的重要機制之一，如Wang等研究發(fā)現(xiàn)，五加科植物在大約23.7百萬年前時經(jīng)歷過一次全基因組重復事件，導致許多和抗逆、抗病相關的基因家族發(fā)生了擴張，包括三萜類化合物合成基因家族的擴張，這可能是促使五加科植物產(chǎn)生多樣而豐富的三萜皂苷的重要機制之一［28］。在番茄中，共線性分析結果顯示，通過全基因組/片段重復（WGD/segmental duplication）形式番茄CYP450基因家族形成了11組旁系同源基因?qū)Γ@些基因可能也參與番茄次生代謝產(chǎn)物（如聚炔類化合物）合成和多樣化的進程。

CYP450基因家族通過單加氧反應參與植物次生代謝，在次代產(chǎn)物骨架結構的多樣化及功能化修飾中具有關鍵作用［29］。目前，已報道的參與植物次代產(chǎn)物合成和修飾的基因主要集中在CYP71、CYP72、CYP85、CYP86和CYP97家族簇［24-26，30］。本研究通過共表達聚類分析，鑒定得到16個可能與PA合成相關的基因，這些基因均來自CYP71和CYP72家族簇，其中，來自CYP71家族簇的共表達基因Solyc04g083160.2.1與CYP85家族簇的差異表達基因Solyc12g006460.2.1可能具有較強的相互作用。CYP71是CYP450基因家族中最大的家族簇，在植物次代產(chǎn)物的合成中發(fā)揮多重作用［31］。如在擬南芥中，來自CYP71家族簇的基因參與生長素的合成，可催化色氨酸形成芥子油苷的前體物吲哚乙醛肟［32］。在蒼耳中，CYP71成員可能參與倍半萜的生物合成［33］。在三萜源植物中，CYP51、CYP71、CYP72和CYP85成員則與三萜結構修飾相關［30］。CYP72是CYP450基因家族中較大的家族簇之一，可能參與物種特異性次生代謝產(chǎn)物的生成。如在豆類中，CYP72A與苜蓿（Medicago truncatula）和甘草（Glycyrrhiza uralensis）的特異性三萜皂苷生物合成有關；在藥用植物楤木中，2個CYP72A基因可能在常春藤皂苷元合成中有多種作用［34-36，24］。因此，綜合以上研究，推斷在番茄葉霉病病菌誘導條件下鑒定得到的59個番茄差異表達CYP450基因，尤其是其中的16個與聚炔類合成關鍵基因有相似表達模式的成員，可能在PA合成通路的下游發(fā)揮重要作用，但其功能還需進一步驗證。

4 結論

本研究首次鑒定了番茄葉中的CYP450基因家族成員，解析了基因間的系統(tǒng)進化關系。分析了CYP450基因家族在病原菌（即番茄葉霉病病菌）誘導后不同時期的表達狀況，鑒定了其中的差異表達基因和與聚炔類合成關鍵基因具類似表達模式的共表達基因，并明確了這些CYP450基因家族成員的基本信息，包括蛋白理化性質(zhì)、基因結構和互作關系等。本研究為后續(xù)聚炔類生物合成下游基因的挖掘和功能驗證奠定了基礎。

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