二穗短柄草TCP轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

關(guān)鍵詞：TCP家族；生物信息學(xué)；二穗短柄草；非生物脅迫；干旱脅迫

轉(zhuǎn)錄因子（Transciptionfactor，TF）通過結(jié)合特定基因的順式作用元件調(diào)控植物的生長發(fā)育［1］。TCP基因家族是一種植物特有的轉(zhuǎn)錄因子［2］，其家族蛋白在N端具有一個(gè)負(fù)責(zé)激活或抑制轉(zhuǎn)錄的保守結(jié)構(gòu)域（約60個(gè)氨基酸）。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的差異，TCP基因家族可分為ClassⅠ（PCF或TCP-P家族）和ClassⅡ（TCP-C家族：CIN和CYC/TB1）這2個(gè)亞家族［3，4］。

近年來，TCP基因家族在擬南芥、水稻、小麥、大麥等多個(gè)物種中均有報(bào)道，廣泛參與調(diào)控植物生長過程［5］。AtTCP15通過控制毛狀體的發(fā)育和角質(zhì)層的形成，從而調(diào)節(jié)擬南芥地上部表皮的特化［6］；ApTCP15通過降低自身表達(dá)量來增強(qiáng)穿心蓮對(duì)干旱、高溫、MeJA和UV等多種非生物脅迫的耐受性［3］；OsTB1是水稻分蘗的負(fù)調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)分蘗芽的伸長［7］；TaTCP5通過與多種激素信號(hào)途徑，如ABA、JA通路中的關(guān)鍵基因結(jié)合，從而提高對(duì)小麥的熱響應(yīng)［8］；HvTB2轉(zhuǎn)錄因子與HvTB1轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體參與調(diào)控大麥穗型［9］。

二穗短柄草是一年生溫帶禾本科植物，具有植株矮小、生命周期短（一般為70d左右）、基因組?。ā?70Mb）、遺傳資源豐富等特點(diǎn)，并與麥類作物關(guān)系密切，因此，二穗短柄草具有成為更有研究前途的麥類作物模式物種的潛力［10］。此外，二穗短柄草作為優(yōu)質(zhì)牧草，能夠用于草原生態(tài)系統(tǒng)的建設(shè)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，研究二穗短柄草TCP基因家族不僅有助于明確其基因功能，更有利于麥類作物的遺傳改良。

本研究在二穗短柄草全基因組范圍內(nèi)鑒定了21個(gè)TCP成員，并對(duì)這些TCP基因的基本特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和順式作用元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，檢測(cè)了其在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，本研究將為進(jìn)一步研究二穗短柄草TCP基因功能提供有利線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為二穗短柄草Bd21。培養(yǎng)條件如下，22℃暗培養(yǎng)1周，4℃同步化1周，再移至正常培養(yǎng)條件（22℃，16h光照，8h黑暗）下，待幼苗長至5cm后，將其平均分為3組，一組用PEG（20%v/v）處理2h、二組用200mMNacl處理2h，三組用同體積清水處理，處理結(jié)束后取樣用于熒光定量PCR分析。

1.2 基因家族成員的系統(tǒng)鑒定及蛋白理化性質(zhì)的分析

二穗短柄草的蛋白數(shù)據(jù)從EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/index.html）網(wǎng)站獲取，利用theArabidopsisInformationResource（https：//www.arabidopsis.org/）檢索得到AtTCP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列，然后通過TBtools的BLASTComparetwoSeqs程序，對(duì)二穗短柄草基因組的TCP基因進(jìn)行鑒定。以Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中的TCP結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型profile（PF03634）為標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用Hmmer網(wǎng)站（http：//hmmer.org/）進(jìn)一步篩選候選BdTCPs。最后，預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，并去除冗余序列及非TCP基因編碼序列。利用TBtools軟件（Version2.012）中GTF/GFF功能模塊下的基因注釋信息，明確TCP基因在染色體上的分布；并使用在線工具ExPASY（https：//www.expasy.org/tools）分析二穗短柄草TCP蛋白的理化性質(zhì)。通過Plant-mPloc6（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)二穗短柄草TCP蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫中獲取24個(gè)AtTCP蛋白序列，通過國家水稻數(shù)據(jù)中心（https：//www.ricedata.cn/gene/）獲取22個(gè)OsTCP蛋白序列，使用MEGA-X中的ClustalW程序比對(duì)擬南芥、二穗短柄草和水稻的TCP蛋白序列，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并通過Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview/#/treeview）網(wǎng)站進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 蛋白保守domain及基因Motif和結(jié)構(gòu)分析

利用Pfam（https：//pfam.xfam.org/）分析蛋白保守domain，通過JGI網(wǎng)站（https：//phytozomenext.jgi.doe.gov/）獲取BdTCP蛋白的相關(guān)信息，使用MEME（https：//meme-suite.org/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)BdTCP成員的Motif類型和排序，最后利用TBtools完成相關(guān)分析的可視化。

1.5 基因家族成員的共線性分析以及順式作用元件分析

利用McScanX對(duì)BdTCP基因進(jìn)行共線性分析，運(yùn)用Circos完成共線性關(guān)系的可視化。通過JGI網(wǎng)站獲取二穗短柄草v3.2.版本的參考序列，利用perl腳本截取BdTCP基因ATG上游2kb的promoter序列，提交至PlantCare網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）完成順式作用元件分析。

1.6 基因家族表達(dá)模式分析

分別提取清水、干旱和鹽脅迫處理下的二穗短柄草總RNA，利用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScriptⅢ1stStrandcDNASynthesisKit）合成cDNA，使用TaKaRaTBGreen?FastqPCRMix和ABISteponePlus熒光定量PCR儀完成相關(guān)BdTCP基因的定量分析。使用JGI網(wǎng)站BLASTBdTCP基因的特異序列，借助Primer3完成qRTPCR引物設(shè)計(jì)。所有樣品均進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，數(shù)據(jù)分析和繪圖使用GraphPadPrism（Version10.0.3）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 BdTCP成員的全基因組鑒定及其蛋白理化性質(zhì)分析

通過檢索二穗短柄草基因組數(shù)據(jù)庫，共獲得21個(gè)具有完整編碼框的TCP基因，分別命名為BdTCP01～BdTCP21（表1）。對(duì)BdTCP蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，其編碼的氨基酸長度范圍為177-497aa，平均為330.67aa；相對(duì)分子質(zhì)量范圍為18371.75-49382.61Da，平均為34728.51Da；理論等電點(diǎn)（PI）范圍為4.81-9.99，平均為7.45，說明TCP家族蛋白富含中性氨基酸；所有BdTCP蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明BdTCP蛋白是不穩(wěn)定蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)范圍為42.85-77.91，平均為61.53；所有BdTCP蛋白親水性總平均值均小于0，表明BdTCP蛋白屬于親水性蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白位于細(xì)胞核中（除BdTCP7位于葉綠體、BdTCP21位于線粒體外），表明BdTCP蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用（表1），這與其他物種TCP蛋白的核定位結(jié)果一致［11，12］?；蜃⑨屝畔⒈砻?，21個(gè)BdTCPs在二穗短柄草5條染色體上分布不均勻（圖1）。

2.2 BdTCP成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了深入理解BdTCP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究利用二穗短柄草、擬南芥和水稻TCP結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。總體來看，這3個(gè)物種的TCP成員均被分為PCF、CIN和CYC/TB13個(gè)亞族，且每個(gè)亞族均包含擬南芥、水稻和短柄草的TCP（圖2），表明在雙子葉和單子葉植物分化之前，TCP家族就已形成［13］。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，21個(gè)BdTCP蛋白均包含一個(gè)完整的TCP結(jié)構(gòu)域，有13個(gè)氨基酸高度保守，其中8個(gè)位于基本保守區(qū)域（Basic），5個(gè)位于HLH區(qū)域；與ClassⅡ（CYC、CIN）相比，Class（ⅠPCF）在Basic結(jié)構(gòu)域中缺失4個(gè)氨基酸（圖3）。為了便于理解BdTCP基因的功能，我們分析了BdTCP基因與玉米、大麥、水稻以及小麥之間的同源關(guān)系。結(jié)果顯示，21個(gè)BdTCPs在水稻中均具有同源基因，而個(gè)別基因在小麥、大麥或玉米中沒有同源基因（表2），表明TCP家庭成員在物種間高度保守，但也可能存在一定功能分化。因此，研究BdTCP基因也十分必要。

2.3 BdTCP蛋白domain以及基因Motif和結(jié)構(gòu)分析

二穗短柄草TCP蛋白保守domain分析結(jié)果表明，BdTCP蛋白最多含有8個(gè)保守Motif，分別命名為Motif1～Motif8（圖4B；表3），但不同成員之間所含Motif種類、數(shù)目及排序有所不同，21個(gè)BdTCP成員均含有Motif1和Motif2，說明這兩個(gè)Motifs是該家族蛋白發(fā)揮功能所需的保守基序；此外，一些Motif特異分布在個(gè)別亞家族中，除Motif1和Motif2以外，BdTCP01～BdTCP11（PCF亞族）均含有Motif3，說明Motif3為PCF亞族功能分化的特異基序，BdTCP12～BdTCP21（ClassⅡ亞族）除BdTCP19（CIN亞族）外都含有Motif4，說明Motif4為ClassⅡ亞族功能分化的特異基序，Motif6只分布在PCF和CYC亞族中，Motif5和Motif7只分布在PCF亞族中，Motif8只分布在CYC亞族中。此外，BdTCP01、BdTCP03和BdTCP07包含的Motif種類完全相同且最多，為7個(gè)，均屬PCF亞族。BdTCP19所含motif種類最少，僅包含Motif1和Motif2。由此可見，同一亞族中的BdTCP成員因其親緣關(guān)系較近而具有相似的motif組成。

BdTCP蛋白domain分析結(jié)果表明，該基因家族蛋白都擁有保守的TCP/TCPsuperfamily（圖4C；表3）。基因結(jié)構(gòu)分析表明，21個(gè)BdTCPs基因的結(jié)構(gòu)均較為簡單，除BdTCP07和BdTCP21含有一個(gè)內(nèi)含子外其余成員幾乎都無內(nèi)含子，這與已報(bào)道的其他物種的TCP基因結(jié)構(gòu)類似［3］，間接說明了本研究TCP結(jié)構(gòu)分析的可靠性（圖4D；表3）。

2.4 BdTCP基因的共線性分析

為明確二穗短柄草TCP基因家族序列之間的相似性，本研究運(yùn)用TBtools軟件繪制二穗短柄草TCP家族成員的共線性關(guān)系圖。結(jié)果表明，有6對(duì)（12個(gè)）基因存在共線性關(guān)系，它們?nèi)繉儆谄螐?fù)制，并且存在共線性關(guān)系的每一對(duì)基因都屬于同一亞族。這12個(gè)基因在二穗短柄草的5條染色體上均有分布，其中2號(hào)染色體上分布了4個(gè)，5號(hào)染色體上僅有一個(gè)。有9個(gè)基因不存在共線性關(guān)系，其中，8個(gè)基因?qū)儆赑CF亞族，1個(gè)基因?qū)儆贑IN亞族。這9個(gè)基因主要分布在4號(hào)染色體。不存在1個(gè)BdTCP基因同時(shí)與多個(gè)BdTCP基因共線性的情況（圖5）。

2.5 BdTCP基因的順式作用元件分析

順式作用元件位于基因旁側(cè)序列，能夠影響基因的表達(dá)［19］。為進(jìn)一步理解BdTCP基因的功能，我們對(duì)其上游2kbpromoter區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行了分析，共發(fā)現(xiàn)5類順式作用元件，分別為光響應(yīng)相關(guān)順式作用元件、生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件、激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件、逆境脅迫相關(guān)順式作用元件和厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)作用元件。每個(gè)BdTCP基因都至少含有1個(gè)生物脅迫或非生物脅迫相關(guān)的順勢(shì)作用元件，主要包括低溫響應(yīng)和防御應(yīng)激響應(yīng)以及干旱響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，暗示該家族成員極有可能參與非生物脅迫反應(yīng)。同時(shí)，每個(gè)BdTCP也都包含激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，如脫落酸、生長素和赤霉素等響應(yīng)元件，其中脫落酸是植物水分利用的中心調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)控氣孔的開放和蒸騰作用。除BdTCP11、BdTCP18和BdTCP20外，其余18個(gè)BdTCPs均含有脫落酸響應(yīng)元件（表3）；且BdTCP02-BdTCP05，BdTCP08、BdTCP10、BdTCP12、BdTCP14、BdTCP15、BdTCP17、BdTCP19這11個(gè)BdTCPs同時(shí)含有干旱及脫落酸響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，推測(cè)這11個(gè)BdTCPs參與調(diào)控干旱脅迫（圖6）。

2.6 BdTCP成員的表達(dá)模式分析

為了挖掘BdTCP成員的功能，我們分別以200mMNacl處理的二穗短柄草幼苗（株高5cm）和20%PEG（v/v）處理的二穗短柄草幼苗（株高5cm）為實(shí)驗(yàn)材料，分別提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用BdTCP的特異qPCR引物（表4），以Actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，鹽脅迫處理下的BdTCP成員的表達(dá)量無顯著變化，干旱脅迫處理下BdTCP成員中的BdTCP10（Bradi3g49660）和BdTCP15（Bradi1g58450）的表達(dá)發(fā)生了極顯著上調(diào)，表明這2個(gè)基因參與了干旱脅迫的正向瞬時(shí)響應(yīng)（圖7）。

3 討論

TCP是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物器官形態(tài)建成、逆境脅迫響應(yīng)和激素調(diào)節(jié)等生物過程。鑒定并分析TCP基因家族的功能，有利于研究其在植物抗逆境脅迫中的作用，為改良重要農(nóng)作物的抗逆性提供有益基因資源。目前，TCP家族基因已在多個(gè)物種中有過相關(guān)報(bào)道，并且在玉米（Zeamays）、小麥（Triticumaestivum）、水稻（Oryzasativa）、大麥（Hordeumvulgrae）等主要糧食作物中也得到了系統(tǒng)鑒定，例如玉米、小麥、水稻、野生大麥和栽培大麥中分別含有46個(gè)、58個(gè)、22個(gè)、22個(gè)和20個(gè)非冗余的TCP基因［8，9，22，23］，說明TCP基因家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了復(fù)制和消除現(xiàn)象。本研究共鑒定出21個(gè)BdTCPs基因，通過物種間同源基因分析，在玉米、大麥、水稻和小麥中分別檢索到20個(gè)、20個(gè)、21個(gè)和52個(gè)同源基因（表2），表明TCP基因家族在物種間高度保守，但也可能存在一定功能分化。因此，研究二穗短柄草TCP基因也十分必要。

多項(xiàng)研究表明，TCP在響應(yīng)植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。小麥中的TaTCP5-D受熱脅迫誘導(dǎo)，是水分利用相關(guān)的關(guān)鍵基因［8］，鑒于TCP家族有一定的保守性，推測(cè)其同源基因BdTCP18是一個(gè)耐熱性調(diào)控因子，參與調(diào)控水分利用。玉米中的ZmTCP42可能參與ABA/干旱響應(yīng)［22］，過表達(dá)ZmTCP42的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出更高的ABA敏感性，暗示BdTCP成員可能響應(yīng)干旱脅迫。本研究對(duì)干旱、鹽脅迫處理下的BdTCP基因進(jìn)行了定量分析。熒光定量PCR結(jié)果顯示，BdTCP10、BdTCP15參與了干旱脅迫的瞬時(shí)響應(yīng)（圖7）。順式作用元件分析結(jié)果顯示，BdTCP05含有干旱響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，BdTCP16含有ABA響應(yīng)元件（圖6；表3），ABA是植物水分利用的中心調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)節(jié)氣孔開放和蒸騰作用，推測(cè)這2個(gè)基因參與干旱脅迫的后期響應(yīng)，其功能還有待研究。本研究鑒定的干旱瞬時(shí)響應(yīng)基因BdTCP10、BdTCP15以及推測(cè)的2個(gè)干旱脅迫后期響應(yīng)基因BdTCP05、BdTCP16將為二穗短柄草及麥類作物的抗旱研究提供有利線索。

深入分析發(fā)現(xiàn)，BdTCP15也含有低溫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件，其水稻同源基因OsTCP21，與OsPCF6共同受miR319的負(fù)調(diào)控來增加水稻的耐冷性［21］。miR319是所有陸生植物中最古老、最保守的miRNA家族之一［24］。二穗短柄草miR319家族由Bdi-MIR319a、Bdi-MIR319b和Bdi-MIR319c三個(gè)成員組成（PmiREN，PlantMicroRNAEncyclopedia），預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)BdTCP15-17這3個(gè)基因均受Bdi-MIR319b和Bdi-MIR319c的調(diào)控，推測(cè)這3個(gè)TCP成員也參與低溫脅迫的響應(yīng)；此外，BdTCP15還含有生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件，其擬南芥同源基因AtTCP24參與調(diào)節(jié)次生壁增厚和花藥內(nèi)壁發(fā)育［25］，推測(cè)BdTCP15也參與相關(guān)生長發(fā)育的調(diào)控。BdTCP10的同源基因AtTCP7廣泛參與擬南芥多個(gè)生物過程，如促進(jìn)開花、調(diào)控葉分化、調(diào)節(jié)核內(nèi)DNA復(fù)制等［26］，但相關(guān)基因功能在二穗短柄草、水稻、小麥、大麥中還尚未有過報(bào)道，鑒于禾本科與雙子葉擬南芥的區(qū)別，BdTCP10及其禾本科同源基因仍具有研究價(jià)值。

4 結(jié)論

TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在，是一類重要的調(diào)控因子，與植物非生物脅迫響應(yīng)關(guān)系密切。本研究對(duì)二穗短柄草TCP基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定與分析，通過熒光定量PCR鑒定出了干旱瞬時(shí)響應(yīng)基因BdTCP10和BdTCP15，還通過順式作用元件分析鑒定了可能參與干旱脅迫后期響應(yīng)的基因BdTCP05和BdTCP16，以及可能參與低溫脅迫響應(yīng)的BdTCP15-17，將為二穗短柄草及麥類作物的抗非生物脅迫研究提供有用線索。