鴨糞鏈球菌的分離與鑒定研究

摘 要：選擇廣東省惠東縣某養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)疑似糞鏈球菌感染的患病鴨分離培養(yǎng)病原菌，通過(guò)鏡檢、PCR檢測(cè)、生化試驗(yàn)與藥敏試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。經(jīng)培養(yǎng)鑒定，該病原菌為鴨糞鏈球菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌，PCR檢測(cè)可擴(kuò)增出大小為546 bp的特異性電泳條帶；對(duì)木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、衛(wèi)矛醇、氧化酶、動(dòng)力、硫化氫等生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化試驗(yàn)呈陽(yáng)性；對(duì)環(huán)丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素等幾種抗生素藥物較敏感。本研究結(jié)果為今后本病的正確診斷和有效防治提供科學(xué)參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：分離；鑒定；鴨；糞鏈球菌

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）10-0028-05

我國(guó)養(yǎng)鴨具有悠久的歷史，最早的養(yǎng)鴨記錄可追溯到公元前500年。目前，我國(guó)已成為主要養(yǎng)鴨生產(chǎn)國(guó)之一，肉鴨生產(chǎn)在世界上占據(jù)重要的地位。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)肉鴨飼養(yǎng)量占全世界總量的70%左右，年屠宰量已超過(guò)30億只，鴨肉年產(chǎn)量超過(guò)500萬(wàn)噸，年總產(chǎn)值高達(dá)500億元，是我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，對(duì)我國(guó)社會(huì)發(fā)展具有重要意義[1-2]。然而，隨著養(yǎng)鴨規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化發(fā)展，鴨糞鏈球菌、鴨漿膜炎、小鴨肝炎、大腸桿菌病、禽流感等疾病頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響鴨的健康生產(chǎn)。糞鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，又稱糞腸球菌，是人和動(dòng)物機(jī)體腸道內(nèi)的一種主要菌，屬于條件性致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能改變或年齡、飲食等因素變化時(shí)，常會(huì)感染動(dòng)物而發(fā)病，并可大范圍的水平傳播，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了極其嚴(yán)重的威脅[3]。因此，積極地分離、鑒定本病原菌，準(zhǔn)確診斷該病，以便更好地防治鴨糞鏈球菌病。本研究選擇廣東省惠東縣某養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)發(fā)生的疑似鴨糞鏈球菌病的6只患病鴨作為試驗(yàn)對(duì)象，采集病料分離、鑒定病原菌，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，旨在為本病的正確診斷和有效防治提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LB液體培養(yǎng)基、葡萄糖肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PCR引物、10 × PCR buffer、dNTPs、Taq DNA 聚合酶等，購(gòu)自大連寶生物有限公司；生化試驗(yàn)鑒定試劑，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏試驗(yàn)用紙片，購(gòu)自天津利達(dá)醫(yī)療器材有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 病料來(lái)源

廣東省惠東縣某養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)疑似鴨糞鏈球菌病的6只患病鴨，分別無(wú)菌采集心臟血液、關(guān)節(jié)液和肝臟組織，作為待檢病料。

1.3 病原菌的分離培養(yǎng)與顯微鏡檢查

分別將上述采集的三種病料劃線接種至普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng) 24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。挑取具有典型特征的單克隆菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后挑取單個(gè)菌落分別接種至LB液體培養(yǎng)基和葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察病原菌的生長(zhǎng)。將分離獲得的病原菌進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.4 PCR檢測(cè)

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌的基因組DNA，PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：2 μL 10×PCR buffer，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，模板2.0 μL，0.5 μL Taq聚合酶，添加滅菌雙蒸水補(bǔ)充至20 μL體系。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)反應(yīng)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)反應(yīng)10 min，4 ℃保存。1%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，觀察是否有特異性條帶產(chǎn)生。

1.5 生化試驗(yàn)

按照細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定試劑操作說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的試驗(yàn)方法，將本試驗(yàn)中分離培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行相關(guān)生化試驗(yàn)鑒定，主要包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、精氨酸水解、七葉苷水解、氧化酶、動(dòng)力、硫化氫、硝酸鹽還原、水楊素等生化反應(yīng)試驗(yàn)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法，對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，主要包括四環(huán)素、環(huán)丙沙星、奈米替星、磷霉素、青霉素、克拉霉素、阿奇霉素、紅霉素、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢呋辛、諾氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、萬(wàn)古霉素等多種抗生素藥物。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

從組織病料中分離出6株病原菌，在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上均可見(jiàn)較一致的針尖大小、光滑濕潤(rùn)、半透明、灰白色、圓形凸起的露滴狀菌落。顯微鏡下觀察可見(jiàn)，革蘭氏陽(yáng)性菌，呈單個(gè)、成對(duì)或多個(gè)菌體連接成短鏈狀排列，無(wú)芽孢。對(duì)照《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，初步鑒定這6株分離菌均為糞鏈球菌。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

針對(duì)糞鏈球菌16S rRNA特異性基因片段設(shè)計(jì)、合成擴(kuò)增上下游引物，上游引物序列為：5’-ATGGCTGATGCTCCATAAGCG-3’，下游引物序列為：5’-GGTTACCTTCTTACGAGCTCGA-3’，應(yīng)用該引物對(duì)6株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，均擴(kuò)增出大小為546 bp的特異性電泳條帶，如圖1所示；這與預(yù)期的目的基因片段條帶大小相一致，PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步鑒定分離的病原菌為糞鏈球菌。

2.3 生化鑒定結(jié)果

將分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、衛(wèi)矛醇、氧化酶、動(dòng)力、硫化氫等生化試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌的藥敏試驗(yàn)抑菌情況見(jiàn)表2。分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素等幾種抗生素藥物較敏感，對(duì)克拉霉素、頭孢唑林、氧氟沙星等中等敏感，對(duì)其余抗生素耐藥。

3 討論

近年來(lái)，隨著科學(xué)規(guī)范化養(yǎng)鴨的不斷發(fā)展，對(duì)鴨病的防控已成為健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且得到養(yǎng)殖者的重視。糞鏈球菌感染是養(yǎng)鴨業(yè)中比較常見(jiàn)的疫病之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鴨糞鏈球菌的分離、鑒定，為后續(xù)正確診斷和防治鴨糞鏈球菌病具有重要意義。大量研究文獻(xiàn)證明，鴨糞鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢，能夠在各種培養(yǎng)基上形成針尖大小、光滑濕潤(rùn)、半透明、灰白色、圓形凸起的露滴狀菌落，常呈單在、成對(duì)或多個(gè)菌體連接成短鏈狀排列[4]。本試驗(yàn)從患病鴨的病料中分離獲得6株病原菌，觀察其培養(yǎng)和生長(zhǎng)狀態(tài)，與糞鏈球菌的形態(tài)特征基本一致，初步說(shuō)明本試驗(yàn)分離的病原菌極有可能是糞鏈球菌。進(jìn)一步結(jié)合PCR檢測(cè)，選擇糞鏈球菌高度保守基因序列16S rRNA作為靶標(biāo)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用該引物能夠在分離菌的基因組DNA中擴(kuò)增出大小為546 bp的特異性電泳條帶，進(jìn)一步證明了該6株分離菌為糞鏈球菌。

此外，生化試驗(yàn)是利用生物化學(xué)反應(yīng)的原理來(lái)測(cè)試細(xì)菌的代謝方式、代謝條件及代謝產(chǎn)物等，以此來(lái)鑒別該微生物屬于類別和種屬[5]。蔣文燦等[4]通過(guò)對(duì)四川省某肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)感染糞鏈球菌的瀕死鴨進(jìn)行采集病料，分離培養(yǎng)后進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果表明該分離培養(yǎng)獲得的鴨糞鏈球菌能夠發(fā)酵D-半乳糖、纖維二糖、果糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。本試驗(yàn)研究中分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化反應(yīng)為陽(yáng)性。這與該病原菌的其它相關(guān)生化試驗(yàn)研究報(bào)道結(jié)果相類似，表明本試驗(yàn)中分離的6株病原菌均為鴨糞鏈球菌。

藥敏試驗(yàn)是指在體外環(huán)境下對(duì)各種抗生素藥物殺菌或抑菌效果的一種檢測(cè)方法，主要是了解特定病原菌對(duì)各種抗生素藥物的敏感性和耐受程度，以便更好地指導(dǎo)臨床科學(xué)選擇適宜的抗生素，用于治療病原菌感染類疾病[6]。目前，常用的藥敏試驗(yàn)方法主要有稀釋法、抗生素濃度梯度法、儀器分析法及藥敏紙片擴(kuò)散法[7]。本試驗(yàn)研究采用常規(guī)的藥敏紙片擴(kuò)散法，選擇18種不同的抗生素藥物紙片對(duì)分離的糞鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該糞鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素較敏感，對(duì)克拉霉素、頭孢唑林、氧氟沙星中等敏感，這為后續(xù)臨床合理用藥治療鴨糞鏈球菌病提供了科學(xué)依據(jù)。于泓洋等[8]從天津市某養(yǎng)牛場(chǎng)內(nèi)感染糞鏈球菌的病牛中分離培養(yǎng)病原菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其研究結(jié)果與本試驗(yàn)中的結(jié)果相一致，這均為后續(xù)合理選擇抗生素、科學(xué)防治糞鏈球菌感染奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)廣東省惠東縣某養(yǎng)鴨場(chǎng)內(nèi)疑似糞鏈球菌感染的患病鴨分離培養(yǎng)病原菌，經(jīng)鑒定分離的6株病原菌均為鴨糞鏈球菌，且對(duì)環(huán)丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素較敏感，這為今后本病正確診斷和有效防治提供科學(xué)參考依據(jù)。

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Isolation and Identification of Duck Fecal Streptococcal Faecalis

Abstract： A diseased duck suspected of being infected with fecal streptococcus in a duck farm in Huidong County， Guangdong Province was selected for isolation and cultivation of pathogenic bacteria. Identification was carried out through microscopy， PCR detection， biochemical testing， and drug sensitivity testing. The result showed that the pathogen was identified as Streptococcus faecalis which is Gram positive. PCR detection can amplify a specific electrophoresis band with a size of 546 bp， which can detect xylose， arabinose， rhamnose β- The biochemical reaction test results of galactosidase， celastrol， oxidase， kinetic， hydrogen sulfide， etc. were negative， and they were more sensitive to several antibiotics such as ciprofloxacin， fosfomycin， ampicillin， cefoperazone， norfloxacin， levofloxacin， vancomycin， etc. The results of this study provide scientific reference for the correct diagnosis and effective prevention and treatment of this disease in the future.

Keywords： Separation; Identification; Duck; Streptococcus faecalis