一測多評法測定甘草及其不同炮制品中7種成分含量

摘 要：為了實(shí)現(xiàn)對甘草藥材及其炮制品成分的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)，建立了一測多評測定甘草藥材及3種炮制品中7種化學(xué)成分含量的方法。以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算異甘草苷相對校正因子；以甘草酸為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的相對校正因子，再測定各成分含量，并將計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：一測多評法測定甘草及其不同炮制品中7種成分的含量具有可行性；甘草炮制后，其中的甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷的含量均有所降低，且在不同炮制品中的含量呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，均為ω（甘草藥材）＞ω（炒甘草）＞ω（甘草片）＞ω（炙甘草）。所建立的一測多評法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，可為甘草及其不同炮制品的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué)；甘草；炮制品；一測多評；質(zhì)量評價(jià)

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Determination of seven components in licorice and its different

processed products by QAMS

Abstract：

In order to achieve the quality evaluation of multiple indicator components in licorice and its processed products， a quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） was established to determine the content of seven chemical components in licorice medicinal materials and three different processed products. The calibration factor for isoliquiritigenin was calculated by using glycyrrhizin as the internal standard; The relative correction factors of apigenin glycyrrhizic acid， apigenin isoliquiritigenin， neoisoliquiritigenin， and glycyrrhizin were calculated by using glycyrrhetinic acid as the internal standard， and then the content of each component was determined. The calculated results were compared with the results obtained by the external standard method. The results show that the QAMS is feasible for determining the content of seven components in licorice and its different processed products. After processing， the content of glycyrrhizin， glycyrrhetinic acid， apigenin glycyrrhizin， apigenitigenin， and neoisoglycyrrhizin all decreases and shows the same trend of change. The trend of content change is ω （licorice herbs）> ω （fried licorice）> ω （licorice tablets）> ω （roasted licorice）. The established method is stable， accurate， and has good repeatability， which can provide reference for the quality evaluation of licorice and its different processed products.

Keywords：

chemistry of Chinese materia medica; licorice; processed products; QAMS; quality evaluation

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[1]。甘草臨床應(yīng)用廣泛，素有“十方九草，無草不成方”之說。甘草炮制方法較多，經(jīng)歷代發(fā)展，現(xiàn)代市售甘草炮制品主要有3種，即甘草片、炙甘草和炒甘草。甘草片和炙甘草為《中華人民共和國藥典》[1]（以下簡稱《中國藥典》）收載的甘草炮制品，炒甘草多收載于省級炮制規(guī)范[2-5]。甘草片味甘性偏涼，長于瀉火解毒、化痰止咳；炙甘草味甘性溫，長于補(bǔ)脾益氣；炒甘草味甘性燥，長于補(bǔ)中益氣、養(yǎng)正和中。

對于甘草不同炮制品的研究雖有報(bào)道，但多是采用HPLC指紋圖譜或多成分定量的方法對甘草炮制前后化學(xué)成分的含量進(jìn)行比較研究。例如：陳佳等[6]采用化學(xué)模式，識別分析了甘草藥材及炙甘草炮制前后化學(xué)成分的差異；寧雪等[7]建立了同時(shí)測定甘草及其不同炮制品中甘草苷、異甘草苷、甘草素等7種成分含量的HPLC法。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）僅用一個對照品就能夠?qū)崿F(xiàn)多指標(biāo)成分的測定。因此，該法已被廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的成分含量測定中[8]，比如：裴玉瓊等[9]采用QAMS法測定了炙甘草飲片中6種成分的含量。但是，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中尚未見采用一測多評法對甘草藥材及3種市售炮制品中有效成分含量進(jìn)行研究的報(bào)道。因此，本研究采用一測多評法測定甘草藥材及其3種炮制品（甘草片、炙甘草、炒甘草）中甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的含量，分析這些成分在甘草及其炮制品中的含量變化，為甘草及其炮制品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材 料

1.1 儀 器

高效液相色譜儀：LC-15C，島津公司提供；Waters e2695，沃特世科技（上海）有限公司提供；Agilent 1260Ⅱ，安捷倫科技有限公司提供。

色譜柱：Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），沃特世科技（上海）有限公司提供；Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），島津公司提供；ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷倫科技有限公司提供。

電子天平（BSA224S-CW，CPA225D），賽多利斯公司提供；KQ-250E超聲波清洗器（250 W，40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司提供。

1.2 試 藥

甘草素（批號為DST171014-010，純度≥98%），成都德思特生物技術(shù)有限公司提供；甘草酸銨（批號為110731-201619，純度≥93.0%），甘草苷（批號為11610-201607，純度≥93.1%），均由中國食品藥品檢定研究院提供；異甘草苷（批號為18101805，純度≥98%），新異甘草苷（批號為18102405，純度≥98%），芹糖異甘草苷（批號為18102407，純度≥98fgfXCtc1cYesFUo5qNDFuD9kvayaDW7m2TMpM0RF7SI=%），芹糖甘草苷（批號為18102403，純度≥98%），均由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供。

15批甘草藥材（編號為S1—S15）經(jīng)神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)量檢測中心鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根及根莖，按照《中國藥典》進(jìn)行檢測，結(jié)果均符合要求，藥材具體信息見表1。甘草炮制品為本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

2 方法和結(jié)果

2.1 前期準(zhǔn)備

2.1.1 炮制品的制備

1）甘草片

參照《中國藥典》“甘草”項(xiàng)下甘草片炮制方法，從15批甘草藥材中各取約200 g，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，即得（編號為P1—P15）。

2）炙甘草

參照《中國藥典》“甘草”項(xiàng)下炙甘草炮制方法，取按照本節(jié)“1）”項(xiàng)下制備方法所制甘草片，15批各約200 g，照蜜炙法炒至黃色至深黃色，不粘手時(shí)取出，晾涼（編號為Z1—Z15）。

3）炒甘草

參照《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》[4]“炒甘草”項(xiàng)下炮制方法，取按照本節(jié)“1）”項(xiàng)下

制備方法所制甘草片，15批各約200 g，置于已預(yù)熱的炒制容器內(nèi)，文火加熱，炒至表面深黃色，取出，晾涼（編號為C1—C15）。

2.1.2 溶液的制備

1）對照品溶液的制備

分別取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、甘草素、甘草酸對照品適量，精密稱定，加70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇

制成每1 mL分別含芹糖甘草苷0.053 0 mg、甘草苷0.025 7 mg，芹糖異甘草苷0.062 2 mg，異甘草苷0.051 7 mg，新異甘草苷0.050 9 mg，甘草素0.014 8 mg，甘草酸0.203 9 mg的混合對照品溶液。

2）供試品溶液的制備

分別取甘草藥材、甘草片、炙甘草、炒甘草飲片粉碎后過4號篩，各取約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，再稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 色譜條件的確定

測定時(shí)選用Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B）。其梯度洗脫程序：0～＜20 min，10%～＜30%A；20～<45 min，30%～＜65%A；45～65 min，65%～95%A。流速為1.0 mL/min；檢測波長為276 nm。理論板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于5 000。混合對照品及甘草不同炮制品的液相色譜圖見圖1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍考察

精密吸取混合對照品溶液1，4，8，10，14，16，20 μL，分別注入到高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)（X），峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的線性回歸方程，如表2所示。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取按照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制得的混合對照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD值分別為0.35%，1.04%，0.76%，0.49%，1.01%，0.90%，1.08%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甘草藥材（編號為S1）粉末約0.2 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，18，24 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，記錄甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的峰面積，計(jì)算各成分峰面積的RSD值分別為1.21%，0.70%，1.12%，1.19%，0.86%，0.93%，1.10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（編號為S1）約0.2 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素含量的RSD值，結(jié)果分別為1.23%，0.98%，0.90%，1.00%，1.14%，1.07%，1.23%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末9份（編號為S1），每份約0.1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別按各成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的80%，100%，120%精密加入甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的對照品儲備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。各成分的平均加樣回收率（括號外數(shù)值）和RSD值（括號內(nèi)數(shù)值）分別為102.06%（1.28%）、101.51%（2.40%）、101.72%（2.02%）、100.65%（2.72%）、101.02%（2.72%）、102.68%（1.87%）、101.61%（2.14%）。

2.3 相對校正因子評價(jià)

2.3.1 相對校正因子的計(jì)算

分別取2，4，10，14，16，20 μL混合對照品溶液進(jìn)樣，并將檢測結(jié)果按公式fk/m=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）進(jìn)行計(jì)算，得到相對校正因子。式中：Ak為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Wk為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；Am為其他組分m的峰面積；Wm為其他組分的質(zhì)量[10-13]。以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算異甘草苷的校正因子；以甘草酸為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的相對校正因子，結(jié)果見表3。

2.3.2 高效液相色譜儀及色譜柱的考察

分別使用不同品牌的高效液相色譜系統(tǒng)（LC-15C，Waters e2695和Agilent 1260Ⅱ），以及Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3種不同的色譜柱，考察高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示，不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子無顯著性影響（結(jié)果見表4），以耐用性結(jié)果最終確定f甘草苷/異甘草苷=0.48，f甘草酸/芹糖甘草苷=0.46，f甘草酸/芹糖異甘草苷=0.22，f甘草酸/新異甘草苷=0.25，f甘草酸/甘草素=0.32。

2.3.3 待測組分色譜峰的定位

采用不同高效液相色譜儀及色譜柱時(shí)，待測組分的保留時(shí)間會有所波動，待測組分的色譜峰，一般根據(jù)相對保留時(shí)間差（RT內(nèi)標(biāo)物/待測=RT待測-RT內(nèi)標(biāo)物）進(jìn)行定位[11]。取按照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制得的混合對照品溶液，分別采用3種色譜儀與不同色譜柱測定，以甘草苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算異甘草苷的相對保留時(shí)間差；以甘草酸為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的相對保留時(shí)間差，結(jié)果（見表5）顯示5種成分相對保留時(shí)間差的RSD值均小于3%，表明利用相對保留時(shí)間差可定位色譜峰。

2.4 一測多評法與外標(biāo)法的結(jié)果比較

分別取15批甘草藥材按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測定。分別采用外標(biāo)法（external standard method，ESM）與一測多評法計(jì)算甘草藥材中甘草苷、異甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷、甘草素的含量。結(jié)果（見表6—表9）表明，2種方法測得的各成分含量無明顯差異，甘草藥材中的甘草苷、甘草酸含量與采用《中國藥典》方法所得檢測結(jié)果（詳見表1）無明顯差異。這說明將QAMS應(yīng)用于甘草藥材及其炮制品的多成分指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)中是可行的。甘草經(jīng)炮制后，其成分中的甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷的含量均有所降低，且在不同炮制品中呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，均為ω（甘草藥材）＞ω（炒甘草）＞ω（甘草片）＞ω（炙甘草），此變化趨勢與文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于甘草藥材及其炮制品的含量變化趨勢是一致的[14-15]；甘草素含量的變化趨勢為ω（甘草片）＞ω（炙甘草）＞ω（炒甘草）＞ω（甘草藥材），異甘草苷含量的變化趨勢為ω（炒甘草）＞ω（甘草藥材）＞ω（甘草片）＞ω（炙甘草）。

2.5 討 論

本研究對選用的3個產(chǎn)地15批甘草藥材按照《中國藥典》方法進(jìn)行了檢測，結(jié)果均符合要求。在實(shí)驗(yàn)前期，分別對流動相、提取溶劑和超聲提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)選。首先，對乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸等3個流動相系統(tǒng)進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸為流動相時(shí)，各色譜峰分離度良好、基線平穩(wěn)、保留時(shí)間適中。故本研究選取乙腈-0.1%磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫。其次，將甘草藥材粉末過40目（0.425 mm）篩對供試品溶液制備方法進(jìn)行了考察，分別選用50%甲醇、70%甲醇、甲醇（分析純）、稀乙醇、70%乙醇和乙醇（分析純）為提取溶劑，分別以10，30，45 min為超聲提取時(shí)間進(jìn)行對比研究。結(jié)果顯示，采用70%乙醇作為提取溶劑并超聲提取30 min時(shí)，各成分含量最高。隨后，將此提取條件與加熱回流提取方式進(jìn)行了對比，結(jié)果并無明顯差異。因此，確定供試品溶液制備方法為以70%乙醇為提取溶劑，并超聲提取30 min。

因中藥具有多成分、多功效的特點(diǎn)，近年來多采用多成分同時(shí)定量的模式進(jìn)行質(zhì)量控制[16-17]，但高昂的檢測成本又限制了多指標(biāo)質(zhì)量控制模式的應(yīng)用。一測多評法是采用相對易得、價(jià)廉的內(nèi)參對照品，實(shí)現(xiàn)對多成分同時(shí)定量的分析方法[11-12]。本研究建立了一測多評法測定甘草藥材及其3種炮制品中7種化學(xué)成分的含量測定方法。方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD值均小于3%，平均加樣回收率為95%～105%；各待測成分與內(nèi)標(biāo)物的相對校正因子和相對保留時(shí)間在不同品牌高效液相色譜儀和不同色譜柱上得到了較好的驗(yàn)證，RSD值均小于3%，說明方法的重現(xiàn)性良好。通過對15批次甘草及其不同炮制品的檢測，一測多評法與外標(biāo)法的含量測定結(jié)果無顯著差異，并且測定結(jié)果顯示甘草經(jīng)炮制后的成分中，甘草苷、甘草酸、芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、新異甘草苷的含量均有所降低，且在不同炮制品中呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，均為ω（甘草藥材）＞ω（炒甘草）＞ω（甘草片）＞ω（炙甘草）。

3 結(jié) 語

本研究采用一測多評法測定了甘草及其不同炮制品中7種化學(xué)成分的含量，分別對流動相、檢測波長、色譜柱、提取溶媒、提取方法、提取時(shí)間等進(jìn)行了考察，最終確定了甘草及其不同炮制品中多成分含量測定的最優(yōu)條件。方法學(xué)結(jié)果表明，甘草苷、異甘草苷、甘草酸等7種成分在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r值均達(dá)到0.999 6及以上，回收率（n=9）均為95%～105%。所建立的一測多評法具有準(zhǔn)確性高、供試品制備方法簡單、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，可為甘草及其不同炮制品的質(zhì)量評價(jià)提供可靠依據(jù)。

由甘草藥材及其不同炮制品的含量測定結(jié)果可知，甘草炮制前后各化學(xué)成分的變化趨勢不同，表明甘草在炮制過程中化學(xué)成分的變化是復(fù)雜的，但僅對7種化學(xué)成分含量進(jìn)行研究尚不能充分、科學(xué)地闡述甘草炮制的科學(xué)內(nèi)涵，后期應(yīng)全面比較不同炮制方法對甘草化學(xué)成分的影響，探討甘草不同炮制品物質(zhì)基礎(chǔ)的差異性，為闡明甘草炮制的科學(xué)內(nèi)涵及更合理的臨床應(yīng)用提供參考。

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