Exendin-4對小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元自發(fā)放電影響

［摘要］目的探究胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑Exendin-4對小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元自發(fā)放電的影響。

方法采用免疫熒光染色觀察GLP-1受體（GLP-1R）在小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部的表達(dá)。使用在體電生理微電極注射10 μmol/L的 Exendin-4到小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元表面，觀察黑質(zhì)網(wǎng)狀部非多巴胺能（假定為γ-氨基丁酸能）神經(jīng)元的自發(fā)放電變化。

結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示，小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部有GLP-1R的高表達(dá)。在所記錄到的13個黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元中，Exendin-4可顯著降低其中9個神經(jīng)元的自發(fā)放電，其放電頻率由加藥前（18.62±3.19）Hz降低到（14.615±3.06）Hz，差異有顯著性（t=7.257，P<0.05）；其放電頻率平均降低（21.85±7.72）%，較生理鹽水組的（1.15±9.67）%顯著升高（Z=2.282，P<0.05）。在另外的4個黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元中，Exendin-4對放電頻率無明顯影響，其放電頻率由（13.49±7.16）Hz變?yōu)椋?3.54±7.45）Hz，差異無顯著性。

結(jié)論Exendin-4能降低部分黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率。

［關(guān)鍵詞］艾塞那肽；黑質(zhì)；網(wǎng)狀部；胰高血糖素樣肽-1受體；電生理學(xué)；小鼠， 近交C57BL

［中圖分類號］R977.15；R322.81

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0491-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.092

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240726.0930.004;2024-07-2616：42：48

Effect of Exendin-4 on the spontaneous discharge of neurons in the substantia nigra pars reticulata of mice

SHEN Fangshuai， LI Xiaoxue， LIU Cui， CHEN Xinyi， XUE Yan， CHEN Lei

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effectof Exendin-4， a glucagon-like peptide-1 （GLP-1） receptor agonist， on the spontaneous discharge of neurons in the substantia nigra pars reticulate of mice.

MethodsImmunofluorescent staining was used to observe the expression of GLP-1receptor （GLP-1R） in the substantia nigra pars reticulata of mice. Extendin-4 10 μmol/L were injected onto the surface of neurons in the substantia nigra pars reticulate using in vivo electrophysiological microelectrodes to observe the spontaneous discharge of non-dopaminergic neurons （assumed to be GABAergic neurons） in the substantia nigra pars reticulate.

ResultsImmunofluorescent staining showed a high expression level of GLP-1R in the substantia nigra par reticulate of mice. As for the 13 neurons recorded in the substantia nigra par reticulata， Exendin-4 significantly reduced the spontaneous discharge rate of 9 neurons， with a significant reduction in discharge frequency from （18.62±3.19） Hz to （14.615±3.06） Hz （t=7.257，P<0.05）， and the discharge frequency was reduced by （21.85±7.72）% on average， which was significantly higher than the reduction rate of （1.15±9.67）% in the normal saline group （Z=2.282，P<0.05）. In the other 4 neurons， Exendin-4 had no signi-

ficant effect on discharge frequency， which changed from （13.49±7.16） Hz to （13.54±7.45） Hz.

ConclusionExendin-4 can reduce the spontaneous discharge frequency of some neurons in the substantia nigra pars reticulata.

［Key words］exenatide; substantia nigra; pars reticulata; glucagon-like peptide-1 receptor; electrophysiology; mice， inbred C57BL

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體（GLP-1R）是一種G蛋白偶聯(lián)受體[1]。GLP-1R激動劑被許可用于治療2型糖尿病，其作用是刺激胰腺中的GLP-1R，從而觸發(fā)胰島素的釋放。同時，研究發(fā)現(xiàn)大腦中廣泛存在GLP-1R的表達(dá)[2-3]。黑質(zhì)網(wǎng)狀部主要由γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元構(gòu)成，神經(jīng)元數(shù)量相對黑質(zhì)致密部較為稀疏。黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元群是調(diào)控運動和覺醒睡眠的中樞部位[4-5]。這些GABA能神經(jīng)元整合廣泛的輸入，并通過神經(jīng)傳導(dǎo)支配多個促覺醒和運動控制回路[4]。在帕金森?。≒D）中，不僅伴隨著黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元放電變化，還有黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元接受來自丘腦底核的興奮性輸入，這些神經(jīng)元被過度激活最終抑制丘腦和運動皮質(zhì)活動[5-6]。近年來，越來越

多的研究結(jié)果表明GLP-1R激動劑在PD中對神經(jīng)元起保護(hù)作用，能夠改善PD臨床表現(xiàn)中的運動和非運動缺陷[7-8]。然而，GLP-1R激動劑是否能調(diào)控黑質(zhì)網(wǎng)狀部的GABA能神經(jīng)元從而參與運動控制，目前尚不明確。本實驗使用免疫熒光染色和在體電生理記錄的方法，探究GLP-1R激動劑Exendin-4對小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元自發(fā)放電的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑及來源Exendin-4購自英國Tocris公司，氨基甲酸乙酯（又稱烏拉坦）購自上海麥克林生化科技有限公司，乙酸鈉和滂胺天藍(lán)購自美國Sigma公司。GLP-1抗體購自美國AbclonawnezZ0YQSvIX4Jn1+/0JEA==l公司；山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司；酪氨酸羥化酶（TH）抗體購于英國Abcam公司。

1.1.2動物選擇及處理7～8周的雄性C57小鼠由濟(jì)南市朋悅實驗動物繁育有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)在室溫（23±1）℃、12 h-12 h晝夜循環(huán)光照、濕度50%～60%的實驗環(huán)境中，具備自由進(jìn)食和飲水的條件。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后用于實驗。動物使用符合實驗醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2實驗方法

1.2.1在體細(xì)胞外電生理記錄小鼠腹腔注射200 g/L烏拉坦（1 g/kg體質(zhì)量）進(jìn)行麻醉，實驗中使用恒溫加熱板維持實驗動物體溫穩(wěn)定。麻醉后對小鼠進(jìn)行腦立體定位手術(shù)（前囟后2.8～3.6 mm，旁開1.0～2.0 mm，深度4.0～5.0 mm）。使用微玻璃電極拉制儀拉制三管電極，其中一支記錄電極中加入含有0.5 mol/L乙酸鈉和20 g/L滂胺天藍(lán)染料的混合液，其余兩支電極則分別加入10 μmol/L的Exendin-4[9]和生理鹽水。在體細(xì)胞外電生理記錄過程中，觀察放電頻率及形狀，通常認(rèn)為黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元放電若為非多巴胺能神經(jīng)元放電即可假設(shè)為GABA能神經(jīng)元[10]。多巴胺能神經(jīng)元放電頻率通常在4～6 Hz范圍內(nèi)[10]，易于辨認(rèn)。小鼠腦中的生物電信號被信號放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)化器擴大，應(yīng)用Spike2軟件收集、記錄并處理放大后的電信號。當(dāng)電極尖端到達(dá)黑質(zhì)網(wǎng)狀部并記錄到穩(wěn)定的神經(jīng)元自發(fā)放電300 s后，通過生物細(xì)胞納升注射器將上述藥物注射到神經(jīng)元表面，觀察藥物對神經(jīng)元放電頻率及放電模式的影響。神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電頻率為給藥前120 s的平均頻率，加藥后的反應(yīng)頻率為加藥后反應(yīng)高峰處50 s的平均頻率。如果給藥后神經(jīng)元放電頻率的變化超過基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)±2個標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為該神經(jīng)元對該藥物有反應(yīng)，否則認(rèn)為該神經(jīng)元為無反應(yīng)神經(jīng)元。

1.2.2免疫熒光染色小鼠深度麻醉后，經(jīng)心臟先后灌注冰冷生理鹽水和40 g/L多聚甲醛，之后斷頭取腦，將鼠腦浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中并置4 ℃冰箱固定6～8 h。之后，腦組織先后浸泡于200和300 g/L蔗糖溶液脫水，直至腦組織自動沉到溶液底部。然后，使用冰凍切片機進(jìn)行切片，腦片厚度為20 μm，取含有黑質(zhì)的腦片進(jìn)行免疫染色。將腦片以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次置于搖床5 min，室溫孵育并以體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清封閉1～2 h。棄去封閉血清后加一抗，于4 ℃冰箱搖床孵育8 h。吸出一抗，用PBS沖洗3次后加二抗鼠源TH抗體和兔源GLP-1R抗體，室溫孵育1 h。充分沖洗二抗后將腦片貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，腦片晾干后滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。在奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察免疫熒光反應(yīng)并拍攝圖像。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所得計量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，神經(jīng)元加藥前后的放電頻率均數(shù)比較采用配對t檢驗；兩組計數(shù)資料數(shù)據(jù)神經(jīng)元自發(fā)放電頻率變化率以百分?jǐn)?shù)表示，兩組比較采用曼-惠特尼秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元GLP-1R的表達(dá)

免疫熒光染色顯示，黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元有大量的GLP-1R表達(dá)，尤其是在黑質(zhì)網(wǎng)狀部的背外側(cè)部。提示正常小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部的神經(jīng)元活動很有可能受到GLP-1及其受體激動劑的調(diào)控。見圖1。

2.2Exendin-4對黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元自發(fā)放電頻率影響

在記錄到的6個黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元中，微壓力注射生理鹽水后，其放電頻率由（18.05±7.57）Hz變?yōu)椋?7.56±7.58）Hz，差異無顯著性（t=0.562，P=0.614）；平均反應(yīng)百分?jǐn)?shù)為（1.15±9.67）%。在微壓力給予10 μmol/L的 Exendin-4后所記錄到的10個黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元中，Exendin-4能夠顯著降

低其中9個神經(jīng)元的自發(fā)放電，其放電頻率由加藥SNr：黑質(zhì)網(wǎng)狀部；SNc：黑質(zhì)致密部；Ventral SNr：黑質(zhì)網(wǎng)狀部腹側(cè)；Dorsolateral SNr：黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)。綠色為TH染色，紅色為GLP-1R染色。

前（18.62±3.19）Hz降低到（14.62±3.06）Hz，差異有顯著性（t=7.257，P<0.05）；放電頻率平均降低（21.85±7.72）%，與生理鹽水組比較差異有顯著性（Z=2.282，P<0.05）。在另外的4個黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元中，Exendin-4對放電頻率無明顯影響，其放電頻率由（13.49±7.16）Hz變?yōu)椋?3.54±7.45）Hz，差異無顯著性（t=－0.247，P=0.821）。見圖2。

2.3Exendin-4對黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元放電模式影響

通過計算放電間隔直方圖和自相關(guān)圖對黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元的放電模式進(jìn)行分析，本實驗只記錄到一種黑質(zhì)網(wǎng)狀部神經(jīng)元基礎(chǔ)放電模式，即規(guī)律性放電。在給予Exendin-4后，神經(jīng)元放電模式與加藥前比較顯示，在對Exendin-4有反應(yīng)的9個和無反應(yīng)的4個神經(jīng)元中，Exendin-4均不改變神經(jīng)元的放電模式。

3討論

黑質(zhì)網(wǎng)狀部的GABA能神經(jīng)元在正常生理條件下參與機體的運動控制和覺醒[4-5]。尤其是黑質(zhì)網(wǎng)狀部谷氨酸脫羧酶2（GAD2）陽性的GABA能神經(jīng)元的共同激活或失活，介導(dǎo)了自主行為方向的轉(zhuǎn)變、促進(jìn)或抑制睡眠。這類GAD2陽性的GABA能神經(jīng)元整合廣泛的輸入，并通過廣泛的側(cè)支投射來支配多個促覺醒和運動控制環(huán)路[4]。在疾病條件下，黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元非正常放電引起癲癇的癥狀發(fā)生。許多調(diào)控黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元放電的藥物被證實可以減輕癲癇癥狀的發(fā)生并用于治療[11]。此外，在PD的經(jīng)典環(huán)路理論中，黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元接受來自丘腦底核谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性輸入，導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元過

分激活，GABA釋放過量，造成丘腦和運動皮質(zhì)被抑制。因此，黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的放電活動對機體的運動控制功能非常重要。

以往的文獻(xiàn)報道，大腦中GLP-1R的激活通?？梢砸种齐妷洪T控的鉀通道開放，增加神經(jīng)元放電頻率，加強神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[8]。有研究表明，GLP-1R激動劑利拉魯肽增加了來自未飲酒大鼠的中央杏仁核（CeA）和邊緣下區(qū)（ILC）神經(jīng)元的自發(fā)抑制性突觸后電流頻率，表明GABA釋放增強[12]。然而與之前研究不同的是，本實驗表明給予Exendin-4可以降低部分黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率。這可能是GLP-1R通過激活ERK1/2的不同作用來實現(xiàn)下游表達(dá)的多樣性所導(dǎo)致的[1]。有研究結(jié)果表明，GLP-1R激活的結(jié)果可能因空間和時間因素而異，其中區(qū)室化可能導(dǎo)致下游信號的

激活受到抑制，這種微結(jié)構(gòu)域的形成已被證明影響

GLP-1R信號傳導(dǎo)，例如PKA誘導(dǎo)的ERK1/2的激活已被證明是短暫的，并導(dǎo)致其易位到細(xì)胞核[13-14]。這種藥物的效果差異可能來源于網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的高頻放電和腦區(qū)環(huán)路的不同，本實驗神經(jīng)元放電頻率抑制效果的信號機制需要進(jìn)一步的實驗探究。GLP-1或Exendin-4可通過分離的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的GLP-1R抑制γ-氨基丁酸受體介導(dǎo)的電流。預(yù)孵育刺激性G蛋白抑制劑消除了Exendin-4的作用。此外，當(dāng)鈣調(diào)素和鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ的活性被抑制時，Exendin-4效應(yīng)被消除[15]。然而，NPY/AgRP神經(jīng)元中的電生理研究表明，GLP-1通過增加GABAA受體介導(dǎo)的局部GABA能中間神經(jīng)元的GABA神經(jīng)傳遞間接抑制了NPY神經(jīng)元超極化。同時，GLP-1可能引起神經(jīng)元鉀離子通道開放抑制其超極化和放電頻率，最終使得小鼠在黑暗中進(jìn)食被抑制[16-17]。最后，在黑暗條件下，將GLP-1注射到終紋床核神經(jīng)元中減少了食物攝入，而注射GLP-1R拮抗劑Exendin9-39增加了進(jìn)食[17]。終紋床核神經(jīng)元的全細(xì)胞膜片鉗記錄表明，GLP-1能引發(fā)可逆性神經(jīng)元去極化或超極化反應(yīng)[17-18]。這些研究表明，GLP-1R激活可能引起神經(jīng)元發(fā)生復(fù)雜的放電反應(yīng)[17]。本實驗結(jié)果符合Exendin-4等GLP-1類似物或者激動劑改善運動障礙的研究結(jié)論。然而，未來需要在PD動物模型上進(jìn)一步確認(rèn)GLP-1R激動劑是否能降低黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的放電頻率，以及聯(lián)合給予GLP-1R阻斷劑來確認(rèn)Exendin-4和內(nèi)源性GLP-1對此類神經(jīng)元的調(diào)控作用。許多研究已經(jīng)證明，Exendin-4等GLP-1R激動劑在PD模型中有神經(jīng)保護(hù)作用，可改善運動和非運動缺陷[7，19-24]。GLP-1可以調(diào)節(jié)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的放電活動，降低炎癥反應(yīng)，增加多巴胺能神經(jīng)元存活率，并且對其起到保護(hù)作用[25-30]。在PD條件下GLP-1不僅可以通過多巴胺能神經(jīng)元起到神經(jīng)保護(hù)作用，還可能通過降低作為主要輸出核團(tuán)的黑質(zhì)網(wǎng)狀部過度激活的GABA能神經(jīng)元的放電頻率，從而參與減輕對丘腦和皮質(zhì)的抑制性輸入，最終改善PD的自主運動失調(diào)等癥狀。這可能對傳統(tǒng)GLP-1減輕PD運動障礙的機制有新的意義。

有研究表明，使用在體電生理技術(shù)在黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)能更容易記錄到神經(jīng)元的自發(fā)放電[10]。而這部分黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)神經(jīng)元主要分布著小清

蛋白陽性的GABA能神經(jīng)元[4]。本實驗中所記錄到

的神經(jīng)元放電大多來自黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)。未來實驗可以進(jìn)一步探究黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)和內(nèi)側(cè)的神經(jīng)元放電是否有差異。同時，本研究證實GLP-1R激動劑可以調(diào)控部分GABA能神經(jīng)元的活動，而不是所有的黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元都受到GLP-1R激動劑的調(diào)節(jié)。結(jié)合本文免疫熒光染色結(jié)果，這可能是由于黑質(zhì)網(wǎng)狀部有兩種或多種GABA能神經(jīng)元，其中部分GABA能神經(jīng)元很少表達(dá)或者不表達(dá)GLP-1R。有研究表明，網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元并非全部同質(zhì)，黑質(zhì)網(wǎng)狀部的GABA能神經(jīng)元大致可以分為小清蛋白陽性神經(jīng)元和GAD2陽性神經(jīng)元，其中GAD2陽性神經(jīng)元更靠近黑質(zhì)網(wǎng)狀部內(nèi)側(cè)[4]。本研究中的免疫熒光染色結(jié)果顯示，GLP-1R更多地表達(dá)在黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)，即小清蛋白陽性的GABA能神經(jīng)元主要分布的位置。

綜上所述，本文在體電生理技術(shù)檢測顯示，在小鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部微量注射GLP-1R激動劑Exendin-4可以降低部分GABA能神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率。同時，本實驗免疫熒光染色的結(jié)果表明，黑質(zhì)網(wǎng)狀部背外側(cè)神經(jīng)元大量表達(dá)GLP-1R。這一實驗結(jié)果提示，GLP-1R及其激動劑可能通過調(diào)控黑質(zhì)致密部GABA能神經(jīng)元的放電活動，從而改善PD等疾病中的行為障礙。

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