橡膠樹白粉菌保守效應蛋白致病機制研究　

關鍵詞：橡膠樹；白粉菌；效應蛋白

中圖分類號：S432.1 文獻標志碼：A

病原菌與植物的互作過程中，要突破植物的免疫系統(tǒng)，才能夠實現(xiàn)成功侵染。在這個過程中，病原相關分子模式（pathogen-associated molecularpattern）往往被植物細胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor）識別，激發(fā)保守分子模式觸發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity）[1]。然而， 很多病原菌可分泌效應蛋白（ effectorproteins）抑制植物的免疫，效應蛋白是病原菌致病的關鍵毒性因子，大部分植物真菌或卵菌的效應蛋白在分泌后可作用于侵入點的植物細胞，影響植物細胞對病原的識別，抑制胞內免疫信號途徑，效應蛋白的核心功能是抑制植物免疫，促進自身侵染[2]。

白粉菌是一種活體營養(yǎng)型專性寄生真菌，在與宿主互作的過程中，會穿透宿主細胞壁形成吸器在宿主細胞內獲得水分和營養(yǎng)，同時產生大量的效應蛋白分泌至宿主細胞內，從而促進真菌的增殖和侵染[3]。目前已針對大小麥白粉菌和侵染豆科作物、葫蘆科作物、葡萄、擬南芥等的白粉菌開展了寄主-病原互作機理研究。目前已預測到白粉菌特有的一類候選效應蛋白可能是侵染寄主過程中的重要武器。預測到的效應蛋白（candiatesecreted effector proteins， CSEPs）需符合以下3 個特征：（1）編碼蛋白N 端存在預測信號肽（signalpeptide）序列；（2）信號肽剪切位點后無跨膜域結構；（3）白粉菌外的物種中無同源序列[4]。解析CSEPs 的功能將深入了解病原菌致病機理，并促進病害防控。但很多CSEPs 的功能仍是未知的。

對于一些專性寄生真菌，常利用寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing， HIGS）來研究效應蛋白功能。HIGS 需要構建表達沉默RNA 的轉基因植物，而有些寄主植物難以實現(xiàn)轉基因，因此限制了HIGS 的應用范圍。噴施誘導基因沉默（spraying-induced gene silencing， SIGS）技術通過噴施外源RNA 傳遞到植物、病原菌等生物體表面，進而沉默生物體關鍵基因[5]，SIGS 具有與HIGS 類似的功能，但不依賴于作物基因轉化，應用范圍更廣。對于專性寄生真菌，包括橡膠樹白粉菌（Erysiphe quercicola）[6]、葡萄白粉菌（E. necator）[7]、葫蘆科白粉菌（E. cucurbitacearum） [8] 、大豆銹病病原菌（ Phakopsorapachyrhizi）[9]，已應用SIGS 進行真菌基因沉默，并展示出良好的沉默效果。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）為多年生木本植物，是天然橡膠的主要來源[10]，但橡膠樹白粉菌侵染引起白粉病連年爆發(fā)，導致橡膠產量下降[11]。在前期工作中，對橡膠樹白粉菌全基因組完成了測序，從中預測到133 個CSEPs[12]，但對這些CSEPs 在侵染中發(fā)揮的功能幾乎是未知的。本研究對其中一個保守的效應蛋白CSEP02974 開展致病功能研究，該效應蛋白在其他7 個白粉菌中均有同源基因，因此這類蛋白可能是多個白粉菌的致病因子。酵母蔗糖轉化酶分泌試驗證明了CSEP02974 信號肽具有引導蛋白分泌的活性。煙草定位試驗表明CSEP02974 可能在植物中被轉運至植物細胞內。在擬南芥中表達該效應蛋白可以抑制植物免疫。由于橡膠樹難以實現(xiàn)轉基因，無法通過HIGS 進行基因沉默，因此采用適用范圍更廣的SIGS 進行研究?；虺聊椭虏⌒詼y試顯示，該效應蛋白為白粉菌致病所需。本研究鑒定到一個橡膠樹白粉菌致病的關鍵效應蛋白，為進一步研究橡膠樹-白粉菌互作分子機理提供良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試的本氏煙草（Nicotianabenthamiana） 、橡膠樹熱研7-33-97、擬南芥（Arabidopsis thaliana）由本實驗室提供。在橡膠樹葉片古銅期進行致病性試驗，在煙草、擬南芥第4～6 周時開展農桿菌介導的瞬時表達試驗。

1.1.2 質粒及菌株 橡膠樹白粉菌HO-73 菌株接種于橡膠樹葉培養(yǎng)，由本實驗室保存、提供；酵母YTK12 菌株感受態(tài)由本實驗室保存提供；pBin-GFP 載體為本實驗室構建保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101 購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 試劑 植物總RNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit 和限制性內切酶購自Thermo Fisher Scientific，高保真DNA 聚合酶試劑盒Prime STAR HS DNA Polymerase（Cat.R040A）購自TaKaRa 公司，通用型DNA純化回收試劑盒（Cat.DP204）購自天根生化科技（北京）有限公司，質粒提取試劑盒（Cat.C201-01）、同源重組試劑盒ClonExpress Ⅱ One StepCloning Kit（Cat.C112-01）購自諾維贊（南京）生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及載體構建 利用本實驗室發(fā)表的橡膠樹基因組數(shù)據(jù)及注釋文件查找CSEP02974基因的完整序列，通過Premier 5.0 軟件設計基因擴增引物CSEP02974-F/R（表1）。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，32 個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，4 ℃待機。PCR 產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。將回收產物與pBin-GFP 載體連接，轉化DH5α 感受態(tài)細胞后進行Sanger測序。使用限制性內切酶BamHⅠ對pBin-GFP 載體進行酶切，設計引物pBin-CSEP02974-F/R、pBin-CSEP-02974ΔSP-F/R、SPPR1-CSEP02974-GFP-F（表1），擴增CSEP02974 基因，通過同源重組構建pBin-CSEP02974-GFP、pBin-CSEP02974^ΔSP-GFP、SPPR1-CSEP02974-GFP 載體。利用Lti6b-F/R 引物從擬南芥cDNA 中擴增Lti6b（At3g05890），并克隆至35S-RFP 表達載體上，完成Lti6b-mRFP 表達載體的構建。所有載體均通過PCR 檢測和生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證其準確性。

1.2.2 農桿菌介導的本氏煙草和擬南芥轉化 將構建的植物表達載體轉入農桿菌GV3101 的感受態(tài)中。在含有50 μg/mL 卡那霉素（kanamycin）和25 μg/mL 利福平（rifampicnic）的LB 培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 d 后離心（5000 r/min，5 min）菌液3 次，用氯化鎂緩沖液（10 mmol/LMES， 10 mmol/L MgCl2， 100 μmol/L AS）[13]懸浮，并將OD 調至0.6，室溫靜置2 h 后用注射器將菌液接種至生長4～6周的本氏煙葉背面。參考蘸花法[14]在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有CSEP02974-GFP質粒的土壤桿菌，于28 ℃恒溫搖床5000 r/min 培養(yǎng)48 h。然后以相同轉速離心10 min，收集菌體。參考蘸花法[14]配置轉化懸浮液，確保土壤桿菌懸浮液的OD 大于0.6。從培養(yǎng)4 周齡的野生型Col-0 擬南芥中選擇正常生長和發(fā)育的植株，將修剪的擬南芥植株花苞浸泡在土壤桿菌懸浮液中，5 min 后密封，暗箱處理24 h。培養(yǎng)轉化后的擬南芥植株至8 周齡，于37 ℃烘箱烘48 h。加熱溶解1/2MS 固體培養(yǎng)基，每100 mL 中加入50 μL 潮霉素溶液，倒入平板中。擬南芥種子處理：75%乙醇浸泡15 s，去離子水漂洗，2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，再次漂洗，置于1/2MS 培養(yǎng)基中無菌萌發(fā)。篩選經(jīng)萌發(fā)的擬南芥幼苗，按營養(yǎng)土與蛭石比例3∶1 移栽，植株成熟后提取DNA 驗證轉化子，選擇T2 代轉基因植株進行后續(xù)試驗。

1.2.3 魯米諾法（Luminol）測定擬南芥葉片活性氧（ROS）的變化 在96 孔板中加入90 μL ddH2O和10 μL 魯米諾過氧化物酶緩沖液（200 μmol/Lluminol， 10 μg/mL 過氧化物酶）。向96 孔板中加入擬南芥葉盤（約10000 個），并加入10 μmol/L（GlcNAc）7。用酶標儀檢測熒光強度的變化情況（發(fā)射波長為530nm，激發(fā)波長為400 nm），以熒光強度表示ROS 迸發(fā)水平1.2.4 擬南芥葉片胼胝質積累測定 本氏煙草葉片成功注射農桿菌2 d 后，摘取葉片放于脫色液（乙醇∶乙酸=3∶1）中脫色至透明，透明葉片用0.01% 苯胺藍溶液（ 苯胺藍溶于0.067 mol/LKHPO 溶液）進行避光染色4 h，熒光顯微鏡（發(fā)射波長為665 nm，激發(fā)波長為600 nm）下觀察胼胝質積累情況，使用ImageJ 軟件計算每100 mm²胼胝質的積累數(shù)量。

1.2.5 酵母表達載體構建 酵母表達載體pSUC2、pSUC2-Avr1b 由本實驗室保存。將pSUC2 載體用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切，用Cycle PureKit 純化試劑盒純化回收。用CSEP02974SP-F/R 引物KeyPo Master Mix 聚合酶擴增CSEP02974 的信號肽全長，用Gel Extraction Kit 純化試劑盒純化回收。用ClonExpress One Step Cloning Kit 將純化后的SP 片段克隆到pSUC2 載體中得到pSUC2-CSEP02974-SP 酵母分泌載體。操作方法和反應體系均參考產品使用說明書，所有載體均通過PCR檢測和生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證其準確性。

1.2.6 酵母分泌試驗 用酵母分泌系統(tǒng)對CSEP02974 的信號肽功能進行驗證。將pSUC2、pSUC2-Avr1b、pSUC2-CSEP02974SP 載體用經(jīng)典酵母轉化試劑盒進行轉化得到含有相應載體的酵母菌株，操作步驟參考產品使用說明書。將含有不同載體的酵母菌株分別接種于CMD-W 和YPRAA 培養(yǎng)基平板上，驗證YTK12 是否含有轉化酶的活性。轉化酶可將氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）還原為1，3，5-三苯甲臜（1，3，5-triphenylformazan， TPF）形成不溶紅色沉淀，以進一步驗證信號肽的功能。

1.2.7 蛋白提取和免疫印跡分析 剪下本氏煙草葉片蛋白表達區(qū)域，加入液氮研磨葉片成粉狀。在1.5 mL 離心管中加入1 mL 植物蛋白裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑以及研磨的植物葉片，放于冰上冰浴30 min，每5 min 震蕩1 次，4 ℃下，12000 r/min 離心10 min，取上清液至新的離心管中。用移液槍吹打懸浮Anti-GFP 免疫磁珠，轉移30 μL 混合液到新的離心管中。加入500 μL 1×PBST，移液槍吹打懸浮Anti-GFP 磁珠，800 r/min離心1 min，棄上清液，向沉淀中加入提取的植物蛋白500 μL，4 ℃下，50 r/min 孵育6 h。4 ℃800 r/min 離心3 min，將上清液轉移至新的離心管中備用。加入500 μL 1×PBST 上下翻轉樣品1 min，4 ℃，800 r/min 離心3 min，磁性分離后棄上清液。重復洗滌3 次，直至洗滌后的上清液OD 小于0.05，棄上清液。向所得沉淀中加入100 μL 1×PBST 吸打，加入30 μL 蛋白上樣緩沖液，加熱煮沸15 min，冷卻至室溫后用GFP 一抗緩沖液、熒光二抗進行Western Blot 檢測。根據(jù)Western Blot 圖像中條帶大小判斷蛋白是否表達。

1.2.8 CSEP02974-dsRNA 的體外合成及處理選擇CSEP02974 序列中特異性最高的區(qū)域為dsRNA 體外轉錄模板序列，根據(jù)Invitro TranscriptionT7 Kit（TaKaRa）使用說明合成并純化dsRNA。利用濃度為2×10⁵ 個/mL 的白粉菌孢子懸浮液接種古銅期橡膠樹葉片， 24 h 后噴施0.1 μg/mL dsRNA 至葉片接菌處。在接種后第7天對橡膠樹葉片病斑進行致病性分析。

1.2.9 CSEP02974 表達的qRT-PCR 分析 分別收集橡膠樹葉片上經(jīng)過沉默處理后第7 天的葉片于液氮中研磨至粉末，用Eastep R Super totalRNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（PromegaBiotech）提取所有樣品的總RNA。用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉錄為cDNA。橡膠樹的Actin 基因作為內參，使用Quant-StudioTM5 RealTime PCR 儀器（Thermo FisherScientific）和SuperReal PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）進行qRT-PCR 檢測，利用QuantStudioTM Design & Analysis Softwarev1.5.2軟件對基因表達量進行分析。操作方法參考使用說明書。

2 結果與分析

2.1 CSEP02974抑制植物免疫防衛(wèi)反應功能分析

本研究選取橡膠樹白粉菌效應蛋白CSEP-02974 進行試驗，經(jīng)過NCBI（national center forbiotechnology information， http：//ncbi.nlm.nih.gov/）比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他白粉菌種的蛋白均具有較高的氨基酸相似性（表2），表明CSEP02974 可能是保守的致病因子。

為了研究CSEP02974 是否具有保守的抑制植物免疫的功能，構建了攜帶CSEP02974 的表達載體pBin-CSEP02974-GFP。通過農桿菌轉化法，對擬南芥Col-0 進行轉化，獲得表達CSEP02974-GFP 的轉基因株系，并且通過逆轉錄PCR 分析驗證擬南芥中CSEP02974-GFP 的表達（圖1A）。真菌來源的幾丁質（chitin）和細菌來源的flg22 是已報道的PAMP[15]，分別用10 μmol/L 幾丁質單體（GlcNAc）7 和10 μmol/L flg22 處理擬南芥葉片36 h，利用苯胺藍（aniline blue）染料對胼胝質染色，并統(tǒng)計胼胝質形成量。統(tǒng)計結果顯示，flg22和（GlcNAc）7 均可以激發(fā)野生型（WT）擬南芥葉片形成大量的胼胝質，而表達CSEP02974 的擬南芥葉片中，胼胝質數(shù)量明顯減少（圖1B，圖1C）。

通過魯米諾化學發(fā)光的方法檢測CSEP02974-GFP（濃度為5 μmol/L）處理后擬南芥葉片活性氧（ROS）的含量變化。結果顯示，（GlcNAc）7和flg22 誘導葉肉原生質體ROS 的積累，在50 min時ROS 積累量較高，而表達CSEP02974 的葉盤中ROS 含量較少（圖1D）。

2.2 CSEP02974的分泌功能驗證

為了測試CSEP02974 是否為分泌蛋白，通過SignalP-5.0 在線系統(tǒng)（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）對CSEP02974 的蛋白序列進行分析，預測到CSEP02974 的第1～22位氨基酸為信號肽序列。為了確認CSEP02974 的假定N 端信號肽的分泌功能，通過蔗糖酶缺陷型釀酒酵母YTK12 菌株測試信號肽活性[16]。將CSEP-02974 信號肽序列連接至含有蔗糖酶（invertase）基因的pSUC2 載體上，之后把構建的載體轉入YTK12 酵母菌株中，28 ℃培養(yǎng)3 d 后，轉化含CSEP02974 信號肽的YTK12 菌株在含棉子糖的YPRAA 培養(yǎng)基上生長較快。另外，在化學催化方法中，轉化含CSEP02974 信號肽的YTK12 菌株能使透明狀態(tài)的TTC溶液轉化為不可溶的紅色物質TPF（圖2）。以上結果表明CSEP02974 信號肽具有活性，因此CSEP02974 可能為分泌蛋白。

2.3 CSEP02974 的定位分析

為了研究CSEP02974 在分泌后是否轉運至植物細胞內，本研究利用本氏煙草瞬時表達所測試的蛋白并研究其定位（圖3A）。使用30%蔗糖溶液誘導煙草細胞質壁分離， 并以共表達的Lti6b-mRFP 作為細胞膜標簽[17]。以單獨的GFP作為對照，當將煙草PR1 蛋白信號肽（SP）連接至GFP，觀察到SP-GFP 蛋白在植物胞質中信號減弱（圖3B），說明PR1 蛋白信號肽可以引導GFP 蛋白分泌出植物細胞。將SP 替換CSEP02974 自身信號肽和使CSEP02974 融合GFP標簽，觀察到SP-CSEP02974-GFP 在植物胞質中信號較強（圖3B），表明SP引導CSEP02974分泌出細胞后，CSEP02974 又可被轉運至胞質。同時，觀察到含自身信號肽的CSEP02974-GFP或刪除信號肽的CSEP02974-GFP（CSEP02974^ΔSP_GFP）和單獨GFP類似，均主要定位在胞質中（圖3B）。上述結果表明CSEP02974 可被植物轉運至細胞質。

2.4 CSEP02974的致病性分析

為研究CSEP02974 在白粉菌侵染過程中的作用，接種白粉菌24 h 后，將合成的CSEP02974-dsRNA 稀釋至0.1 μg/mL 后噴施于已接種白粉菌的橡膠樹葉片表面，并于接種7 d 后觀察白粉菌侵染情況（圖4A）。與野生型（WT）和噴灑GFP序列的dsRNA（GFP-dsRNA） 相比， 噴施CSEP02974-dsRNA 的植株上白粉菌引起的癥狀明顯減輕，病斑面積僅為GFP-dsRNA 處理的11.11%（圖4B）。對經(jīng)dsRNA 處理過的橡膠樹葉片進行取樣，以白粉菌EF1a 引物為內參，采用qRT-PCR 檢測CSEP02974 在侵染過程中的表達情況（圖4C）。結果表明，CSEP02974-dsRNA 處理后，CSEP02974 的表達水平為野生型的39%，為GFP-dsRNA 處理的48%。以上結果表明，葉面噴施CSEP02974-dsRNA 可導致侵染橡膠樹的白粉菌基因沉默，并顯著抑制白粉菌的侵染和在葉片內的擴展。

3討論

橡膠樹為多年生木本植物，因其自然特性，其抗病基因鑒定和育種較難開展，抗病資源稀缺；并且對于專性寄生真菌，特別是白粉菌，目前對這類真菌的效應蛋白的基因功能缺乏了解，因此，亟需進行寄主-病原互作機制的研究，以探尋抑菌的新靶點。

活性氧迸發(fā)和胼胝質的積累被認為是植物應對病原物侵染的基礎防衛(wèi)反應[18]，利用農桿菌介導的瞬時表達方法，觀察候選效應蛋白是否能誘導或抑制模式植物細胞活性氧爆發(fā)、胼胝質沉積等反應，是真菌效應蛋白篩選的常用方法[19-20]。如稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）效應蛋白Slp1、小麥禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）效應蛋白Mg3LysM 可抑制幾丁質觸發(fā)的免疫[21-22]；水稻黃單胞菌T3SS 效應蛋白可抑制flg22誘導的擬南芥的PTI[23]；玉米黑粉菌分泌的Pep1 通過抑制植物的過氧化物酶活性，清除活性氧的積累來保護菌絲[24]。為了檢測克隆的候選效應蛋白是否具有免疫抑制的功能，本研究構建了表達CSEP02974-GFP 的轉基因擬南芥，用PAMP 進行處理后發(fā)現(xiàn)CSEP02974 可抑制flg22 和幾丁質誘導的胼胝質和活性氧的積累，確定CSEP02974 為毒性蛋白。

目前對白粉菌效應蛋白的功能驗證常用的方法是基因沉默。SIGS 作為一種新型基因沉默技術，其以病原菌生長發(fā)育和致病相關基因為靶標，將體外合成的針對靶基因的dsRNA 噴施于植物表面，抑制靶基因的表達[25]。SIGS 已被應用于多種植物病害機理研究，并展示出良好的應用前景。已有報道指出，SIGS 技術能夠有效沉默核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄孢菌（Botrytiscinerea）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等農業(yè)上重要的病原真菌[26]。局部應用靶向DCL1 和DCL2 的dsRNA 可抑制水果、蔬菜和花卉的灰霉菌病[23]。SIGS 在白粉菌中的應用也較為廣泛，如葫蘆科白粉菌CNAP8878、CNAP9066等6 個保守非注釋蛋白通過dsRNA 誘導的基因沉默后，出現(xiàn)明顯的沉默表型，白粉菌生物量和病狀大幅減少[8]。通過SIGS 技術沉默橡膠樹白粉菌β-微管蛋白（Tub）、甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）和幾丁質合酶（Chs）基因，導致致病力下降，病斑大幅減少[6]。這為白粉菌的基因沉默技術提供了新方向。在白粉菌中對CSEP02974 進行基因沉默，通過熒光定量PCR 分析和表型觀察發(fā)現(xiàn)，沉默該基因會導致白粉菌擴展侵染受抑制。

近年來，對白粉菌效應蛋白的功能鑒定、靶標篩選等研究已經(jīng)取得了一定進展，但關于白粉菌效應蛋白轉運的研究甚少，在效應蛋白功能機制的研究中，對效應蛋白的分泌和轉運機制具有重要的研究價值[27]。本研究通過酵母分泌系統(tǒng)驗證了CSEP02974信號肽具有分泌活性，通過煙草系統(tǒng)探明了CSEP02974被分泌后進入宿主細胞。目前，效應蛋白在稻瘟菌中的轉運機制研究已經(jīng)取得了一定進展，稻瘟菌效應蛋白從病原菌的侵染菌絲中分泌后，細胞質效應蛋白PWL2 會進入受體植物的細胞質中直接作用于宿主，并能通過轉運進入諸多還未侵染菌絲的相鄰宿主細胞中，質外體效應蛋白Bas4會停留在由EIHM 膜（extrainvasive hyphal membrane， EIHM）與侵染菌絲膜形成的質外體隔間里[28-29]。效應蛋白的這一系列作用機制的差異性取決于效應蛋白分泌后定位特點的多樣性。本研究通過農桿菌介導的煙草瞬時表達技術在煙草葉片中瞬時表達全長效應蛋白，發(fā)現(xiàn)CSEP02974 在細胞質壁分離分泌到細胞外后，在細胞膜上仍可見到熒光，推測CSEP02974被分泌到細胞外后又進入細胞質內，推測CSEP-02974 是細胞質效應蛋白。

綜上，本研究利用異源表達系統(tǒng)、農桿菌侵染系統(tǒng)、酵母分泌系統(tǒng)以及相對定量、亞細胞定位、SIGS技術鑒定了橡膠樹白粉菌關鍵致病因子，為致病機理研究提供有利支撐。