一株P(guān)RRSV-2 譜系1.8與1.5重組毒株的基因組特征分析

摘 要： 為探究天津地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株的流行變異情況。本研究利用豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）分離培養(yǎng)、有限稀釋法純化和IFA鑒定，從具有嚴(yán)重呼吸癥狀斷奶仔豬群中分離鑒定出一株新的PRRSV流行毒株（命名為T(mén)J-C6），并對(duì)其開(kāi)展了全基因組擴(kuò)增及其分子特征分析。結(jié)果顯示，該毒株全基因組全長(zhǎng)15011 bp，與NADC30毒株的核苷酸相似性最高（91.7%），為NADC30-like PRRSV（譜系1.8），且其N(xiāo)sp 2存在131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失分子特征（“111+1+19 aa”）；GP5 N-糖基化位點(diǎn)分析顯示存在3個(gè)糖基化位點(diǎn)（N32、N43、N50）。重組分析結(jié)果顯示，該毒株是以NADC30-like（譜系1.8）為骨架，與NADC34-like（譜系1.5）發(fā)生重組的PRRSV，其重組區(qū)域位于12213～14628 nt（ORF2a～ORF6）。本研究分離鑒定到一株譜系1.8與譜系1.5重組的PRRSV-2毒株，可為天津地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控提供參考。

關(guān)鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；基因組特征；重組

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3570-09

收稿日期：2023-09-20

基金項(xiàng)目：天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（22YFZCSN00100；22ZYCGSN00570；22YDTPJC00420）

作者簡(jiǎn)介：楊 程（1998-），女，廣西梧州人，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究，E-mail： 164377125@qq.com

通信作者：孫英峰，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究，E-mail： yfsun2000@163.com

Genomic Characterization of a Recombinant Strain of PRRSV-2 between Lineages 1.8

and 1.5

YANG" Cheng1， LIU" Ye1， CHENG" Ning1， WANG" Kaiyue1， LI" Xinlei1， SUN" Jiuying1， HAN" Junping

2， LI" Wenjun3， WANG" Huanhuan3， SHAO" Xiao3， CHENG Xuejiao4， SUN" Yingfeng1*

（1.College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，

China;

2.Tianjin Jinken Animal Husbandry Group Co.，Ltd， Tianjin 300392，" China;

3.Tianjin

Nongken Kangjia Ecological Breeding Co.， Ltd， Tianjin 300386，" China;

4.Tianjin Zhongsheng Challenge Biotechnology Co.， Ltd， Tianjin 300386， China）

Abstract：" In order to investigate the epidemic variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） strain in Tianjin area， a new epidemic strain of PRRSV （named TJ-C6） was isolated and identified from weaned piglets with severe respiratory symptoms by means of isolation and culture of porcine alveolar macrophages （PAMs）， purification by limited dilution method and identification by IFA. The whole genome amplification and its molecular characteristics were analyzed. The results showed that the whole genome length of this strain was 15011bp， and the nucleotide homology with NADC30 strain was the highest （91.7%）， which was NADC30-like PRRSV （lineage 1.8）. Nsp2 had 131 discontinuous deletion features （\"111+1+19aa\"）. GP5 N-glycosylation site analysis showed that there were three glycosylation sites （N32， N43， N50）. Recombination analysis showed that this strain was a recombinant PRRSV with NADC30-like （lineage 1.8） as the skeleton and NADC34-like （lineage 1.5）， and its recombination region was located in 12213-14628nt （ORF2a-ORF6）. In this study， a recombinant PRRSV-2 strain of lineage 1.8 and lineage 1.5 was isolated and identified， which can provide reference for the prevention and control of porcine reproductive and respiratory syndrome in Tianjin.

Key words： PRRSV; isolation and identification; genomic characterization; recombination

*Corresponding author：" SUN Yingfeng， E-mail： yfsun2000@163.com

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害的病毒性傳染?。?］。自20世紀(jì)80年代在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，到目前為止，PRRS疫情已遍布全球［2-5］。我國(guó)于1996年首次報(bào)道并分離鑒定了以CH-1a為代表的經(jīng)典PRRSV毒株［6］。2006年我國(guó)南方地區(qū)先后暴發(fā)了以JXA1、HUN4等為代表毒株引起的高致病豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRSS），迅速蔓延至全國(guó)并演化成優(yōu)勢(shì)流行毒株［7-8］。2013年，國(guó)內(nèi)出現(xiàn)的NADC30-like毒株，逐漸取代其他毒株成為優(yōu)勢(shì)毒株，該毒株基因組變異度高，易與其他譜系的毒株發(fā)生重組導(dǎo)致田間毒株多樣性［9-12］；2017 年，我國(guó)首次報(bào)道 NADC34-like PRRSV，隨后此類(lèi)毒株檢出率逐年攀升，并成為我國(guó)的潛在流行毒株［13-14］，這也為 PRRSV 的防控帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。

PRRSV依據(jù)抗原遺傳差異可分為歐洲型（PRRSV-1）與美洲型（PRRSV-2）兩個(gè)基因型，國(guó)內(nèi)主要為PRRSV-2為主［15-17］。根據(jù)PRRSV ORF5基因序列，將PRRSV-2分為 9 個(gè)譜系（lineage1～9），其中l(wèi)ineage 1（NADC30-like、NADC34-like等）、lineage 3（QYYZ、GM2等）、lineage 5（VR2332、R98等）及l(fā)ineage 8（CH-1a、JXA1等）為我國(guó)PRRSV主要流行毒株［8］。目前，譜系1.8（NADC30-like）毒株為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)PRRSV流行株，且與其他譜系毒株之間存在廣泛的重組現(xiàn)象［11，18-19］，但譜系1不同亞型毒株之間的重組現(xiàn)象鮮有人報(bào)道，伴隨著譜系1.5（NADC34-like）毒株田間上升流行，潛在的譜系1.5與1.8重組毒株加劇了變異毒株的基因組特性、免疫原性和致病性等特性的復(fù)雜性，這為 PRRSV的防控帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。本研究旨在分離鑒定PRRSV譜系1.8與1.5重組毒株并分析其分子遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，為該地區(qū)的PRRS防控提供參考，并為深入解析 PRRSV 毒株的遺傳變異機(jī)制和進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源及主要試劑

2023年，在天津地區(qū)某具有嚴(yán)重呼吸癥狀斷奶仔豬群的肺臟組織。核酸提取試劑盒購(gòu)自BioFlux公司；M-MLV、RRI、dNTP Mix購(gòu)自TaKaRa公司；高保真酶購(gòu)自全式金公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化試劑（北京）有限公司；pUC- T載體購(gòu)自上海生工生物有限公司；平末端加A試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自蘇州雙洳生物科技有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京索萊寶科技公司；PRRSV N蛋白特異性單抗及豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與核酸轉(zhuǎn)錄

根據(jù)GenBank中標(biāo)準(zhǔn)參考毒株的保守基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物PRRSV-F：5′-GGTGTATCGTGCCGTTCT-3′，下游引物PRRSV-R：5′-GTTCCGCTGAAACTCTGG-3′，PCR產(chǎn)物片段預(yù)期大小為534 bp，由上海生工生物有限公司合成。依照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟要求進(jìn)行病毒RNA的提取，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 5mim；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s；循環(huán)35次；72℃ 10min。

1.3 病毒分離鑒定與純化

將用“1.2”引物PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性的樣品接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好PAMs細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，于細(xì)胞出現(xiàn)80%CPE時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液。經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞上清使用有限稀釋法純化病毒，具體的有限稀釋法步驟：TJ-C6 F1代作為病毒原液進(jìn)行十倍倍比稀釋?zhuān)?0-1～10-8共8個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)。將稀釋后的病毒液接至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PAMs細(xì)胞上，培養(yǎng)48～72h，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄CPE情況。取出現(xiàn)CPE的最高稀釋度病毒液進(jìn)行下一輪有限稀釋?zhuān)仓貜?fù)3次。收取第3次有限稀釋中出現(xiàn)CPE的最大稀釋度的病毒液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

對(duì)純化后的病毒進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）鑒定，具體的IFA鑒定步驟：當(dāng)感染后的PAMs細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20min，0.2%Triton室溫孵育15min，含5%脫脂奶粉的PBS封閉1h，一抗（PRRSV N蛋白單抗）4℃過(guò)夜孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，37℃避光孵育1h，最后用DAPI室溫孵育5min，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 全基因組序列擴(kuò)增

利用13對(duì)重疊的引物對(duì)TJ-C6毒株進(jìn)行擴(kuò)增（引物信息見(jiàn)表1），將預(yù)期片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞上，挑取陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)序鑒定。

1.5 遺傳演化及同源性分析

基于MEGA軟件鄰近法（Neighbor Joining， NJ）對(duì)TJ-C6與18株標(biāo)準(zhǔn)參考毒株（表2）進(jìn)行遺傳演化分析。利用MegAlign軟件對(duì)TJ-C6與參考毒株基因組中各區(qū)域的核苷酸及其編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析。使用SimPlot及RDP4軟件對(duì)TJ-C6進(jìn)行重組分析（設(shè)置CH-1R，JXA1、NADC30、NADC34、QYYZ、VR2332為參考對(duì)比分析序列）。

2 結(jié) 果

2.1 TJ-C6毒株的分離與鑒定

利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行臨床樣品的PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增出534 bp的目的條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果確定為PRRSV陽(yáng)性。在接種PAMs細(xì)胞48h后出現(xiàn)明顯CPE，上清液PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。對(duì)出現(xiàn)CPE的PAMs細(xì)胞培養(yǎng)液有限稀釋純化后進(jìn)行IFA鑒定，可見(jiàn)明顯綠色熒光，陰性對(duì)照未見(jiàn)熒光（圖2），表明分離并鑒定一株可在PAMs細(xì)胞上增殖的PRRSV。

2.2 全基因組擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

使用SeqMan拼接測(cè)序結(jié)果，TJ-C6毒株序列全長(zhǎng)為15 011 bp（不含polyA尾）?；贠RF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示，TJ-C6與NADC34-like PRRSV的親緣性更高，其ORF5基因歸屬于譜系1.5（圖3A）。全基因組遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示，TJ-C6屬于以NADC30毒株為代表的譜系1.8，為NADC30-like PRRSV（圖3B）。這表明TJ-C6毒株可能存在重組現(xiàn)象。

2.3 全基因組及各基因片段的相似性分析

利用MegAlign軟件對(duì)TJ-C6與不同譜系的代表毒株進(jìn)行核苷酸與氨基酸相似性比對(duì)分析。在全基因組同源性比對(duì)中，TJ-C6與PRRSV-2譜系1.8的NADC30的相似性最高，為91.7%；與其他譜系代表毒株的相似性為80.9%～85.4%，表明TJ-C6屬于PRRSV-2中的譜系1.8，為NADC30-like毒株。對(duì)每個(gè)區(qū)域進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示，TJ-C6的5′UTR～ORF1b、ORF7～3′UTR區(qū)域都與NADC30相似性最高；而ORF2a～ORF6區(qū)域則與NADC34的同源性較高。另外，TJ-C6在Nsp2區(qū)域與代表毒株的相似性為61.7%～86%，其中，與NADC30的相似性最高（86%），且存在131個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失，與NAD30-like PRRSV的Nsp2缺失模式一致。

GP5蛋白是囊膜蛋白，具有較強(qiáng)的變異能力。TJ-C6的GP5蛋白區(qū)域與代表毒株相似性為82.6%～95%，相似性最高的是譜系1.5的NADC34和ISU-10，均為95%。GP5中的糖基化位點(diǎn)與PRRSV的中和反應(yīng)或病毒逃逸有關(guān)。通過(guò)NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)一步對(duì)TJ-C6的GP5蛋白N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示存在3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于N32、N43、N50（圖4）。其中表位A中的一個(gè)aa（N27S）和表位C中的兩個(gè)aa（N57N、N59S）發(fā)生了突變，表位C的突變模式與NADC34的突變模式一致，而表位A的突變模式則與參考毒株的突變模式不同。

2.4 重組分析

利用SimPlot軟件對(duì)TJ-C6的全基因組序列進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示TJ-C6存在重組現(xiàn)象（圖5），重組位置在12 213-14 628 nt之間。其中1-12 212 nt與14 627-15 011 nt與NADC30的同源相似性較高，而重組區(qū)域則與NADC34的同源相似性較高。使用RDP4軟件對(duì)Simplot分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。RDP4分析結(jié)果與Simplot結(jié)果一致（表3），重組區(qū)域的主要部分為NADC34，其余區(qū)域未檢測(cè)出重組事件。將三個(gè)基因片段分別進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。綜上所述，TJ-C6是一株以譜系1.8為骨架，與譜系1.5發(fā)生重組的PRRSV。

3 討 論

重組是PRRSV新毒株產(chǎn)生與演化的重要機(jī)制，不僅增加了田間毒株的復(fù)雜性，還使得產(chǎn)生的新毒株出現(xiàn)了毒力的變化。PRRSV可在不同譜系之間發(fā)生重組事件，且重組模式較為復(fù)雜［17，20-22］。自譜系1.8毒株（NADC30-like）在國(guó)內(nèi)流行后，已有大量的關(guān)于其與我國(guó)流行的其他譜系的毒株發(fā)生重組研究報(bào)道［23-24］，且部分重組毒株具有較強(qiáng)的致病性［18，25-26］。譜系1.5毒株（NADC34-like）作為我國(guó)的潛在流行毒株，近年來(lái)，開(kāi)始在國(guó)內(nèi)部分地區(qū)被檢測(cè)到，可能逐漸成為與譜系1.8具有同等優(yōu)勢(shì)的流行毒株［27-29］，提高了病毒重組的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究從具有嚴(yán)重呼吸癥狀斷奶仔豬群中分離鑒定一株P(guān)RRSV，命名為T(mén)J-C6，其全基因組分析結(jié)果表明，TJ-C6與NADC30的遺傳進(jìn)化為同一分支，且Nsp2區(qū)域具有與類(lèi)NADC30毒株一致的不連續(xù)131氨基酸（111+1+19）缺失模式；重組分析說(shuō)明該毒株為以譜系1.8毒株（NADC30-like）為主要親本，以譜系1.5毒株（NADC34-like）為次要親本，進(jìn)一步證實(shí)了伴隨著譜系1.5毒株在國(guó)內(nèi)流行，其與本土毒株重組的事件可能會(huì)逐漸增多。另外，分離毒株GP5蛋白上的表位A與表位C存在氨基酸突變，這些氨基酸位點(diǎn)的變化可能與病毒的進(jìn)化或免疫逃逸有關(guān)，不過(guò)該毒株致病性如何還需進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)考證。

本研究利用PAMs原代細(xì)胞成功分離并鑒定了一株譜系1.5與1.8重組重組類(lèi)NADC30 PRRSV，盡管其重組具體機(jī)制仍不是非常明確，但重組的發(fā)生勢(shì)必導(dǎo)致PRRSV毒株致病性和免疫源性的改變，加劇了田間防控的技術(shù)難度。對(duì)重組病毒TJ-C6基因組特征的描述是對(duì)譜系1亞型毒株之間發(fā)生重組變異情況的重要數(shù)據(jù)補(bǔ)充，為研究我國(guó)PRRSV毒株遺傳演化規(guī)律和PRRS防控提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究分離鑒定到一株譜系1.8與譜系1.5重組的PRRSV-2毒株——TJ-C6，重組分析表明該毒株為以譜系1.8毒株（NADC30-like）為主要親本，以譜系1.5毒株（NADC34-like）為次要親本，進(jìn)一步證實(shí)了伴隨著譜系1.5毒株在國(guó)內(nèi)流行，其與本土毒株重組的事件可能會(huì)逐漸增多，可為天津地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控提供參考。

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（編輯 白永平）