不同日齡內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃及糞便真菌多樣性差異研究

摘 要： 本試驗旨在采用高通量測序技術，測定內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡時瘤胃及糞便真菌多樣性的定植規(guī)律，為后續(xù)絨山羊早期營養(yǎng)調(diào)控相關研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。選取按照場區(qū)正常生產(chǎn)管理并飼養(yǎng)的10、30、50、150日齡體重分別為（4.99±0.13）、（7.71±0.52）、（13.83±0.18）、（20.60±0.81）kg的內(nèi)蒙古白絨山羊母羔各3只（每只為1個重復，共12只），進行屠宰、取瘤胃液（R組）及糞便（F組）。采用特異性引物對ITS1F/ITS2R擴增瘤胃和糞便真菌ITS區(qū)，用Illumina Miseq PE300平臺進行測序。結(jié)果表明：1）本試驗24個樣共獲得1 636 055條優(yōu)化序列（Clean tags），平均每個樣含有（68 168±24 317）條，每條序列平均長度為（244±28）bp。2）隨日齡的增加，瘤胃和糞便真菌總OTUs以及與后一個日齡共享的OTUs開始時稍有降低，但隨后逐漸增加。10、30、50、150日齡時瘤胃和糞便共享的真菌OTUs分別占同日齡檢測到的瘤胃和糞便OTU總數(shù)的34.22%、20.87%、27.63%和20.53%。3）隨日齡的增加，瘤胃真菌群落Shannon、Simpson、Ace、Chao指數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05），而50、150日齡時糞便中真菌Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于10日齡組（Plt;0.05）。50日齡時瘤胃中真菌Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于糞便組（Plt;0.05）。4）50日齡和150日齡瘤胃真菌菌群β多樣性極顯著聚為一類（Plt;0.01），并與10日齡和30日齡瘤胃真菌菌群β多樣性極顯著分開（Plt;0.01）。50日齡和150日齡糞便真菌群落β多樣性分別極顯著獨立分布且與10日齡和30日齡糞便真菌群落β多樣性分開（Plt;0.01）。另外，150日齡瘤胃及糞便組內(nèi)真菌群落β多樣性相似度大于其他日齡組。5）當日齡為10、30、50、150 d時，在門水平上瘤胃及糞便真菌組成相似，均為子囊菌門（Ascomycota）、未分類的真菌（Unclassified_k_fungi）、新美鞭菌門（Neocallimastigomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota），其中子囊菌門占絕對優(yōu)勢。而在屬水平上瘤胃及糞便真菌組成稍有差異。瘤胃中豐度最高的物種在10、50日齡時均為未分類的真菌，在30、150日齡時分別為莢孢腔菌屬（Sporormiella）和酵母菌屬（Saccharomyces）。糞便中豐度最高的物種10、50日齡時分別為未分類的真菌和新美鞭菌屬（Neocallimastix），30、150日齡時分別為Cleistothelebolus和枝孢菌層（Cladosporium）。6）在門水平上的進一步LefSe分析發(fā)現(xiàn)，新美鞭菌門無論是在150日齡內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃中還是在50日齡內(nèi)蒙古白絨山羊糞便中均是顯著富集的物種（Plt;0.05）；比較同日齡瘤胃和糞便真菌群落時，只有在150日齡瘤胃和糞便中分別顯著富集了未分類的真菌和子囊菌門。7）基于FUNGuild功能預測，瘤胃真菌在羔羊10、50日齡時分別以未分類營養(yǎng)型（Unclassified）和病理營養(yǎng)型（Pathotroph）為主，30、150日齡時均以腐生營養(yǎng)型（Saprotroph）為主。糞便真菌在10、150日齡時均以病理-腐生-共生營養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）為主，30、50日齡時均以腐生營養(yǎng)型為主。由此可見，隨著內(nèi)蒙古白絨山羊羔羊的發(fā)育，瘤胃真菌群落逐漸有利于飼料中纖維的降解。幼齡時期瘤胃和糞便中還存在很多豐度較高且未分類的物種，其功能還未明確，因此還需要更深一步的研究。

關鍵詞： 高通量測序技術；內(nèi)蒙古白絨山羊；不同日齡；瘤胃；糞便；真菌多樣性

中圖分類號：S826.95

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3526-15

收稿日期：2023-09-28

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目（2021MS03009）

作者簡介：娜梅拉（1998-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，博士生，主要從事動物環(huán)境與營養(yǎng)研究，E-mail： 969119894@qq.com

通信作者：娜仁花，主要從事動物環(huán)境與營養(yǎng)研究，E-mail： nrh0123456@hotmail.com

Study on the Differences of Fungal Diversity in Rumen and Feces of Inner Mongolia Cashmere

Goats at Different Ages

NA" Meila， LI" Kenan， DU" Haidong， GUO" Wenliang， NA" Renhua*

（College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，" China）

Abstract：" The purpose of this experiment was to determine the colonization of fungal diversity in rumen and feces of Inner Mongolia white cashmere goats at different ages by high-throughput sequencing technology， and to provide data basis for subsequent research on early nutritional regulation of cashmere goats. Three female lambs of Inner Mongolia white cashmere goats of each days of age （10，30，50 and 150） with body weight of （4.99±0.13）， （7.71±0.52）， （13.83±0.18） and （20.60±0.81） kg at 10， 30， 50 and 150 days of agerespectively were selected according to the normal production management and feeding in the farm area， each lamb was a replicate， all together 12 lambs， a total of 12）. They were slaughtered and rumen fluid （group R） and feces （group F） were taken. The ITS region of rumen and fecal fungi was amplified by specific primers ITS1F/ITS2R， and sequenced by Illumina Miseq PE300 platform. The results showed that ： 1） A total of 1 636 055 clean tags were obtained from 24 samples in this experiment， with an average of （68 168±24 317） clean tags per sample and an average length of （244±28） bp per sequence. 2） With the increase of age， the total OTU of rumen and fecal fungi and the OTU shared with the next day-of-age decreased slightly at first， but then increased gradually. The fungal OTUs shared by rumen and feces at 10，30，50 and 150 days of age accounted for 34.22%， 20.87%， 27.63% and 20.53% of the total number of OTUs detected in rumen and feces at the same age， respectively. 3） There was no significant difference in Shannon， Simpson， Ace and Chao indexes of rumen fungal community with the increase of age （Pgt;0.05）， but the Shannon and Simpson indexes of fecal fungi at 50 and 150 days of age were significantly higher and lower than those at 10 days of age， respectively （Plt;0.05）. At 50 days of age， the Shannon and Simpson index of fungi in rumen were significantly higher and lower than those in fecal group （Plt;0.05）. 4） The β diversity of rumen fungi at 50 days of age and 150 days of age was significantly clustered into one group （Plt;0.01）， and was significantly separated from the β diversity of rumen fungi at 10 days of age and 30 days of age （Plt;0.01）. The β diversity of fecal fungi of 50-day-old and 150-day-old were significantly independent distribution and the β diversity of fecal fungi ofwere seperated from 10-day-old and 30-day-old were significantly independent distribution （Plt;0.01）. In addition， the similarity of fungi β diversity in rumen and feces groups at 150 days of age was higher than that in other age groups. 5） At 10，30，50 and 150 days of age， the composition of rumen and fecal fungi was similar at the phylum level， which were Ascomycota， Unclassified_k_fungi， Neocallimastigomycota， Basidiomycota and Mortierellomycota， among which Ascomycota was dominant. At the genus level， the composition of rumen and fecal fungi was slightly different. The species with the highest abundance in rumen were Unclassified_k_fungi at 10 and 50 days of age， Sporormiella and Saccharomyces at 30 and 150 days of age， respectively. The species with the highest abundance in feces were Unclassified_k_fungi and Neocallimastix at 10 and 50 days of age， respectively， and Cleistothelebolus and Cladosporium at 50 and 150 days of age， respectively. 6） Further LefSe analysis at the phylum level showed that Neocallimastigomycota was significantly enriched in the rumen aged 150 days and in feces of Inner Mongolia Cashmere Goat aged 50 days（Plt;0.05）. When comparing the rumen and fecal fungal communities at the same age， Unclassified_k_fungi and Ascomycota were significantly enriched only in the rumen and feces at 150 days of age. 7） Based on FUNGuild function prediction， rumen fungi were dominated by Unclassified and Pathotroph at 10 and 50 days of age， respectively， and Saprotroph was dominant at 30 and 150 days of age. Fecal fungi were mainly Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph at 10 and 150 days of age， and Saprotroph at 30 and 50 days of age. It can be seenconcluded that with the development of Inner Mongolia Cashmere Goat lambs， the rumen fungal community is gradually conducive to the degradation of fiber in the feed， and the digestion ability is significantly enhanced. There are still many high-abundance and unclassified species in the rumen and feces of young age， and their functions are not yet clear， so further research is needed.

Key words： high-throughput sequencing technology; Inner Mongolia white cashmere goat; different days of age; rumen; feces; fungal diversity

*Corresponding author： NA Renhua，E-mail： nrh0123456@hotmail.com

內(nèi)蒙古白絨山羊是中國優(yōu)良絨山羊品種之一，所產(chǎn)的羊絨品質(zhì)優(yōu)良，享譽世界，對我國的羊絨生產(chǎn)業(yè)有很大貢獻。反芻動物的生產(chǎn)力主要由瘤胃微生物驅(qū)動，瘤胃微生物包括細菌、產(chǎn)甲烷菌、真菌和原蟲等功能性微生物群，使瘤胃變成了復雜而完善的生態(tài)環(huán)境。其中瘤胃真菌占瘤胃微生物的5%～20%，主要降解纖維素，在降低木質(zhì)素對瘤胃負面影響的同時還可產(chǎn)生50%以上的可發(fā)酵糖［1-3］。已有研究證明，在無細菌條件下，瘤胃中真菌能降解粗飼料中62%的干物質(zhì)［4］。真菌不僅能利用其特有的假根系統(tǒng)附著于粗飼料的木質(zhì)化組織進行物理性降解，還可以分泌大量纖維素酶、木質(zhì)素酶等相關水解酶對植物中的結(jié)構性多糖和非結(jié)構性多糖進行化學性降解，同時有利于其他瘤胃微生物附著于粗飼料表面進行分解，進而生成醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、H2、CO2、甲酸鹽等代謝終產(chǎn)物［5-7］。另外，瘤胃真菌還具備了降解蛋白質(zhì)和淀粉的能力［2，8］。除此之外，腸道微生物也參與宿主的發(fā)育和進化，其中腸道真菌不僅能夠抵御多種病原細菌的侵入，還會影響除腸道外免疫器官的形成和免疫反應［9-10］。據(jù)研究報道，在健康狀態(tài)下的腸道真菌與宿主之間是互惠或偏利共生的關系［11］。糞便主要是由食物殘渣、水分和微生物構成，含有未被消化道吸收利用的物質(zhì)，是機體代謝物的主要排泄形式，因而糞便菌群群落也是反映動物健康的關鍵因素。另外，糞便真菌還具有參與糞的降解和礦化的功能［12］，是草原生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。因此研究糞便微生物群落隨日齡的變化和與瘤胃微生物的區(qū)別也有一定的生物學意義。據(jù)研究，反芻動物胃腸道微生物區(qū)系受到年齡、遺傳、飼糧等多個因素的影響［13］。近年來基于ITS（Internal Transcribed Spacer）基因進行DNA測序是系統(tǒng)進化分類真菌過程中既相對變化又穩(wěn)定的方法。因此，本研究利用高通量測序技術對不同日齡的內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌的組成和多樣性進行縱向和橫向比較，探討幼齡時期真菌的定植規(guī)律，有助于為反芻動物早期營養(yǎng)調(diào)控相關研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

采用單因素試驗設計，從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市土默特左旗金來牧業(yè)科技有限公司分別隨機選取10、30、50、150日齡體重分別為（4.99±0.13）、（7.71±0.52）、（13.83±0.18）、（20.60±0.81）kg的健康發(fā)育的白絨山羊母羔各3只，每只為1個重復，共12只。飼養(yǎng)按照場區(qū)正常的生產(chǎn)管理：從初生到20日齡，自由吸吮母乳；20到90日齡，除母乳外補飼精料（大北農(nóng)981號精料）和苜蓿干草；91日齡斷奶，斷奶后飼喂同一種成年絨山羊料。飼料放入干凈食槽中自由采食，自由飲水。

1.2 樣品的采集及處理

宰前24 h禁食，屠宰過程符合動物福利規(guī)程，按照試驗動物的解剖標準操作規(guī)程及生物樣品的采集對瘤胃液及糞便進行取樣，并分別記作R組（瘤胃液樣品）和F組（糞便樣品），并按日齡分別記作R10、R30、R50、R150、F10、F30、F50、F150。瘤胃液采集方法：每只羊需要采集瘤胃液15 mL，分別用4層紗布過濾，分裝于2個2 mL的凍存管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，待測；糞便采集方法：從直腸末端處采集糞便約5 g，直接分裝于2個2.0 mL 的凍存管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，待測。

1.3 DNA提取、PCR擴增及Illumina Miseq測序

將采集的樣品解凍后，使用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals， 美國）提取瘤胃及糞便真菌的總DNA。并以真菌總DNA為模板，使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTC-ATCGATGC-3′）進行擴增。PCR采用的反應體系包括：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL、下游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、10 ng DNA模板、補ddH2O至20 μL。每個樣本3個PCR 重復，將3個重復的PCR產(chǎn)物混合；使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。使用Axyprep DNA Gel Extraction Kit進行產(chǎn)物純化。之后將PCR產(chǎn)物用 QuantusTM Fluorometer 進行檢測定量。按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。最后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進行文庫構建，利用Illumina Miseq PE300平臺進行測序。以上委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用FASTQ軟件對原始測序序列進行質(zhì)控、過濾，F(xiàn)LASH軟件進行拼接，UPARSE軟件對序列進行OTU聚類（根據(jù)97%的相似度），用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫，設置比對閾值為70%，得到物種分類水平上（門、屬）的分類信息表。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果信息，采用Mothur 1.30.2軟件計算α多樣性指數(shù)。當數(shù)據(jù)非正態(tài)分布時，使用T檢驗對數(shù)值進行比較。使用加權遺傳距離矩陣（weighted unifrac distance）計算并使用R語言（version 3.3.1）構建主坐標分析圖（PCoA分析）?；诜菂?shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和驗檢（non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test），使用線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）檢測門水平上具有顯著豐度差異特征的物種（LDA評分≥4，P≤0.05）。通過FUNGuild預測對真菌群落營養(yǎng)型進行分類分析。使用美吉生物云平合（https：∥cloud.majorbio.com）進行部分數(shù)據(jù)分析與圖表制作，使用Excel 2019對原始數(shù)據(jù)進行初步整理，應用SAS 9.2單因素方差分析（one-way ANOVA） 并對差異顯著者進行Duncan氏法多重比較。試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，Pgt;0.05表示差異不顯著，P≤0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各樣品測序結(jié)果統(tǒng)計

經(jīng)Illumina MiSeq高通量測序，本試驗24個樣品共獲得1 636 055條優(yōu)化序列（Clean tags），平均每個樣品含有（68 168±24 317）條，每條序列平均長度為（244±28）bp。由樣本的稀釋曲線（圖1）可知，隨著樣本數(shù)目的增加，其稀釋曲線趨于平緩，測序數(shù)據(jù)達到飽和，說明本次測序量和測序深度合理，足夠覆蓋每組樣品的多數(shù)真菌，可以進行后續(xù)分析。

2.2 基于OTU的物種Venn圖分析

本試驗中8組共有3 192個OTUs，其中R組有1 779個OTUs，F(xiàn)組有1 413個OTUs，R10、R30、R50、R150、F10、F30、F50、F150分別有757、295、344、383、520、213、235、445個OTUs。由圖2A可知，8組共享的OTU有23個，R組特有的OTU有359個，F(xiàn)組獨有的OTU有304個。由圖2B可知，R組內(nèi)，4個日齡共享的真菌OTU有71個，R10組與R30、R50、R150組共享的OTU分別有142、136、142個，R30組與R50、R150組共享的OTU分別均有120個，R50組與R150組共享的OTU有250個。由圖2C可知，F(xiàn)組內(nèi)，4個不同日齡組共享的真菌OTU有35個，F(xiàn)10組與F30、F50、F150組共享的OTU分別有66、52、82個，F(xiàn)30組與F50、F150組共享的OTU分別有65、98個，F(xiàn)50組與F150組共享的OTU有126個。由圖2D～G可知，10、30、50日齡時，R組真菌總OTU與獨有的OTU均大于F組，而150日齡時F組真菌總OTU與獨有的OTU大于R組，R組與F組共有的OTU分別有437、106、160、170個。

2.3 α多樣性分析

8組樣品覆蓋率均大于99.82%，表明本次測序能夠反映出較好的真菌多樣性。內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性指數(shù)見表1。在4個不同日齡組間，R組Shannon、Simpson、Ace和Chao指數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05）。F組50和150日齡時真菌Shannon指數(shù)顯著高于10日齡組（Plt;0.05），而其Simpson指數(shù)則顯著低于10日齡組（Plt;0.05）；比較同一個日齡組發(fā)現(xiàn)，50日齡時，R組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別顯著大于和小于F組（Plt;0.05）。

2.4 β多樣性分析

由圖3A可知，R組50日齡和150日齡組樣本極顯著聚為一類（Plt;0.01），并與10日齡和30日齡組樣本極顯著分開（Plt;0.01），并且組內(nèi)相似度會隨日齡的增加而增高。由圖3B可知，F(xiàn)組50日齡和150日齡組樣本分別均極顯著獨立分布與10日齡和30日齡組樣本（Plt;0.01），而且150日齡組內(nèi)相似度較大。由圖3C～F可知，從10日齡到150日齡，R組與F組間差異會越來越大。此外，F(xiàn)組組內(nèi)個體的聚集程度相比R組會隨日齡的增加而較快增高。

2.5 不同分類水平上真菌群落組成及相對豐度

在不同分類水平上對測序所得到的有效序列進行物種注釋和統(tǒng)計，24個樣品共檢測到12個門、32個綱、78個目、183個科、365個屬。

2.5.1 門水平上真菌群落組成及相對豐度

在門水平上對10、30、50、150日齡R組與F組相對豐度大于1%的物種進行了統(tǒng)計。由表2、圖4可知，R組與F組豐度最高的前5個物種均為子囊菌門、未分類的真菌、新美鞭菌門、擔子菌門和被孢霉門，其中子囊菌門是4個日齡階段每組中占絕對優(yōu)勢的物種。R組中，10日齡時子囊菌門豐度顯著低于，而被孢霉門豐度顯著高于其他三個日齡組（P≤0.05）。新美鞭菌門豐度50、150日齡時顯著高于10、30日齡組（Plt;0.05）。F組中，新美鞭菌門相對豐度50日齡時極顯著大于其他三個日齡組（Plt;0.01）。

2.5.2 屬水平上真菌群落組成及相對豐度

在屬水平上對10、30、50、150日齡R組與F組相對豐度大于2%的物種進行了統(tǒng)計。由表3、圖5可知R組與F組相對豐度最高的前10個菌屬。在R組，酵母菌屬豐度150日齡時極顯著高于其他三個日齡組（Plt;0.01）。殼二孢屬（Ascochyta）相對豐度150日齡時極顯著高于10、30日齡組，而極顯著低于50日齡組（Plt;0.01）。被孢霉門相對豐度10日齡時顯著高于其他三個日齡組（P≤0.05）；在F組，枝孢菌屬（Cladosporium）相對豐度50日齡時極顯著高于10、30日齡組，而極顯著低于150日齡組（Plt;0.01）。青霉菌屬（Penicillium）豐度150日齡時極顯著高于其他三個日齡組（Plt;0.01）。新美鞭菌屬相對豐度50日齡時顯著大于其他三個日齡組（P≤0.01）。

2.6 真菌群落LEfSe多級物種差異判別分析

由圖6可知，在R組中，子囊菌門顯著富集在30日齡組，新美鞭菌門顯著富集在150日齡組。在F組中，擔子菌門顯著富集在30日齡組，新美鞭菌門顯著富集在50日齡組；另外，通過分析同日齡R組和F組真菌群落發(fā)現(xiàn)，10、30、50日齡時沒有顯著差異的物種，150日齡時R組和F組中分別顯著富集了未分類的真菌和子囊菌門。

2.7 真菌群落功能預測分析

由表4可知，R組中，在羔羊10、50日齡時分別以未分類營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型為主，在羔羊30、150日齡時均以腐生營養(yǎng)型為主。其中病理營養(yǎng)型真菌豐度在50、150日齡時顯著高于10日齡組，病理-腐生營養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph）真菌豐度在30日齡時顯著高于其他3個日齡組（Plt;0.05）。F組中，10、150日齡時均以病理-腐生-共生營養(yǎng)型為主，30、50日齡時均以腐生營養(yǎng)型為主。病理-腐生營養(yǎng)型真菌豐度在50、150日齡時顯著高于10日齡組（Plt;0.05）。除此之外，本試驗還檢測到了共生營養(yǎng)型（Symbiotroph）、腐生-共生營養(yǎng)型（Saprotroph-Symbiotroph）、病理-共生營養(yǎng)型（Pathotroph-Symbiotroph）、腐生-病理-共生營養(yǎng)型（Saprotroph-Pathotroph-Symbiotroph）為主的真菌。

3 討 論

3.1 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌基于OTU的Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計多組所共有和獨有的物種（如OTU）數(shù)目。在本試驗中，隨日齡的增加，瘤胃和糞便中的真菌總OTU以及與后一個日齡共享的真菌OTU開始時稍有降低，但隨后會逐漸增加。是由于發(fā)育早期羔羊瘤胃功能還不完善，內(nèi)環(huán)境還

未建立有效的競爭機制以及穩(wěn)定的微生物區(qū)系，主要依靠食管溝閉合反射來攝取營養(yǎng)物質(zhì)與能量，因此，母體和外界環(huán)境中的微生物易在胃腸道內(nèi)定植，從而10日齡時檢測到的瘤胃和糞便真菌物種較多。之后經(jīng)過適應和選擇在胃腸道中存活、增殖，并逐漸形成穩(wěn)定的微生物區(qū)系［14-16］，使檢測到的物種數(shù)量先降低后增加。并且據(jù)研究證實，幼齡山羊出生后0～14日齡時易受到母體、日糧以及外界環(huán)境各方面因素的影響，14～28日齡期間不同種屬的瘤胃真菌群落會相互競爭而導致其含量會發(fā)生實質(zhì)性變化，28～56日齡時瘤胃真菌群落趨于穩(wěn)定平衡［17］。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，在羔羊10、30、50、150日齡時瘤胃和糞便共享的真菌OTU分別占同日齡檢測到的瘤胃及糞便OTU總數(shù)的34.22%、20.87%、27.63%和20.53%。因此，內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便中真菌結(jié)構差異較大。

3.2 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性的分析

α多樣性分析可以反映微生物的多樣性和豐度。其中Shannon和Simpson指數(shù)綜合反映微生物群落的多樣性和均勻度。Shannon 指數(shù)值越高，Simpson 指數(shù)值越小，表明群落的多樣性越高，各物種個體數(shù)量越多。Ace和Chao指數(shù)用于表示微生物豐富度，其指數(shù)越大代表物種總數(shù)越多，群落的豐富度越高。已有研究表明，反芻動物胃腸道微生物多樣性指數(shù)會隨年齡的增長而升高［18］。劉潔等［19］的研究也表明，日齡能顯著影響羔羊（道賽特羊、湖羊和小尾寒羊）瘤胃及直腸真菌α多樣性，而不同品種之間的差異不明顯。葉倩文等［20］的研究中，一月齡內(nèi)羔羊腸道菌群α多樣性顯著低于斷奶后。本研究中，隨日齡的增加糞便真菌α多樣性會顯著增加，但日齡不能顯著影響瘤胃真菌α多樣性?？赡苁怯捎诒驹囼瀮H選擇了5月齡內(nèi)羔羊而導致與上述研究不盡相同。微生物群落的豐度越高，意味著動物分解飲食的效率就越高［21］，本試驗中瘤胃及糞便真菌豐富度總體上有隨日齡的增長而增高的趨勢，由此可知，隨日齡的增加瘤胃中功能性真菌群落逐漸定植并發(fā)揮作用中。瘤胃微生物多樣性與維持穩(wěn)定的微生物群落密切相關，較高的微生物多樣性對環(huán)境有較強的適應性和抵抗力［22］。本試驗在4個日齡階段瘤胃及糞便中真菌多樣的波動表明，在羔羊發(fā)育早期動物胃腸道內(nèi)還沒形成穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境。

本研究比較同一個日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌多樣性均高于糞便組，其中50日齡時差異顯著；瘤胃組真菌豐富度指數(shù)10、30、50日齡時均大于糞便組，150日齡時小于糞便組，但差異不顯著。王繼文等［23］也發(fā)現(xiàn)，10月齡山羊瘤胃及糞便α多樣性沒有顯著差異，但數(shù)值上糞便組的各項指標略大于瘤胃組的。王遁剛等［9］研究發(fā)現(xiàn)，6月齡藏系綿羊瘤胃微生物Ace和Chao1指數(shù)顯著高于糞便組，而Shannon和Simpson指數(shù)兩組間無顯著差異。并諸多研究證明，當斷奶日齡、日糧精粗比或營養(yǎng)水平不同時，瘤胃真菌菌群會發(fā)生顯著變化［2-3，24］。

3.3 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌β多樣性的分析

β多樣性用于分析分組間微生物組成的相似及差異。其中PCoA聚類分析是從復雜數(shù)據(jù)中提取和可視化最主要的元素和結(jié)構，圖中點與點之間的距離便可以反映微生物相似性或差異性。從本試驗PCoA聚類圖結(jié)果得知，隨日齡的增加，瘤胃和糞便組間真菌組成差異會逐漸增大，并組內(nèi)相似度會隨日齡的增加而增大，其中糞便組內(nèi)差異會較快降低。說明隨著日齡的增加瘤胃和糞便真菌群落不斷被演替著，其中糞便菌群群落逐漸趨于較高的穩(wěn)定性。這是因為瘤胃微生物群落是飼料利用效率中的核心，通過發(fā)酵飼料活性調(diào)節(jié)宿主可獲得的能量［11］，因此反芻初階段瘤胃微生物群落結(jié)構穩(wěn)定較慢。6月齡藏系綿羊與10月齡山羊瘤胃微生物群落均與糞便微生物清晰地分開，且糞便組內(nèi)相似度高于瘤胃組。Meale等［25］的研究中，隨著動物由非反芻階段轉(zhuǎn)到反芻階，犢牛腸道微生物群會重組。以上結(jié)果與本試驗結(jié)果相似。

3.4 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌的組成、相對豐度及物種差異分析

據(jù)研究，已知98%的真菌都屬于子囊菌門和擔子菌門［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，10、30、50、150日齡時內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌前5個優(yōu)勢菌門組成相似，均為子囊菌門、未分類的真菌、新美鞭菌門、擔子菌門和被孢霉菌門。以往研究中，綿羊、山羊、奶牛及馬等其他反芻動物瘤胃和糞便真菌在門水平上的組成也與本試驗相似［27-29］。因此，在門水平上在以上的幾種動物類群間，其瘤胃和糞便真菌菌群結(jié)構在有相似之處，但在屬水平上的瘤胃和糞便真菌組成稍有差距，且不同物種之間同一個采樣部位間的菌屬也有差異。王彩蝶等［30］的研究中，哈薩克羊瘤胃真菌優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬（Candida）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）和梅奇酵母屬（Metschnikowia）等。灘羊瘤胃中真菌豐度較高的菌屬為梨霉菌屬、廣義釀酒酵母菌屬和裂褶菌屬［31］。伊犁馬腸道中的優(yōu)勢菌為隱球酵母菌屬（Cryptococcus）和畢赤酵母屬（Pichia）［31］。

本試驗中，在門水平上，隨日齡的增加瘤胃中子囊菌門和新美鞭菌門豐度會增加。并在4個日齡階段，子囊菌門在瘤胃中占絕對優(yōu)勢，150日齡時瘤胃中顯著富集新美鞭菌門。韓旭峰［32］的研究中，甚至2周歲陜北絨山羊瘤胃真菌優(yōu)勢菌門同樣為子囊菌門。這主要是因為隨著生長發(fā)育，羔羊逐漸習慣采食粗飼料且使瘤胃初具消化粗飼料的能力，使功能性菌種定植而導致的。而瘤胃真菌雖然只占整個瘤胃微生物的5%～20%，但其降解植物纖維的能力要超過整個細菌群體［33］。其中子囊菌門是真菌界最大的一類微生物，瘤胃中不僅能夠為厭氧發(fā)酵環(huán)境清除氧氣，而且主要參與木質(zhì)素和角蛋白等有機物質(zhì)的降解過程［34-36］。新美鞭菌門廣泛存在于反芻動物胃腸道中，參與木質(zhì)化纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉降解的專性厭氧菌，并為宿主提供所需要的營養(yǎng)成分［37-38］。本試驗中，被孢霉門豐度與子囊菌門和新美鞭菌門豐度呈現(xiàn)負相關，但其在瘤胃中的功能還未明確報道，需要進一步研究。在屬水平上，隨日齡的增加，瘤胃中酵母菌屬豐度會極顯著增加，而孢霉菌屬豐度會顯著減少。其中酵母菌屬和孢霉菌屬分別屬于子囊菌門和孢霉菌門。酵母菌屬有利于動物生長性能及自身健康，具有分泌較高活性的消化酶的作用，并其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（B族微生物、氨基酸等）能夠被動物直接吸收利用［39］。另外，張潔等［31］研究發(fā)現(xiàn)，9月齡舍飼灘羊瘤胃真菌以子囊菌門為主，而放牧組以新美鞭菌門為主。與喂食高谷物日糧相比，喂食高纖維日糧的動物瘤胃中屬于新美鞭菌門的物種的多樣性更豐富達到70%［40］。Mao等［41］研究中，山羊（體重為25±3 kg）瘤胃真菌群落的優(yōu)勢菌屬為新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬和瘤胃壺菌屬，與本研究得結(jié)果不一致。Boots等［42］研究表明，飼喂高纖維日糧和谷物的閹牛瘤胃真菌組成不同。因此，除了年齡，日糧組成也是導致瘤胃真菌菌種組成差異的關鍵因素。

在門水平上，50日齡時糞便中顯著富集新美鞭菌門。屬水平上，隨日齡的增加，糞便中青霉菌屬和枝孢菌屬豐度會極顯著增加，并50日齡時新美鞭菌屬的豐度顯著增加。其中，青霉菌屬屬于子囊菌門，是最具有代表性的絲狀真菌菌屬之一，不僅對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有很強的降解作用，還能分解胞外酶，也是溶磷微生物的重要類群［43-46］。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫，由真核宏基因組微生物基因組（eukMAGs）為代表的新美鞭菌屬每個基因組中包含100種以上的各類型碳水化合物活性酶（CAZyme），且僅在經(jīng)過抗生素處理（青霉素-鏈霉素（PS）或氯霉素（CM））和培養(yǎng)的菌群中富集［42］。枝孢菌屬屬于芽枝霉門，研究表明，枝孢菌屬的含量下降對腸道健康和免疫功能有負面影響［47］。因此，本試驗結(jié)果能間接表明隨日齡的增加羔羊消化能力在明顯變強，并機體功能在逐漸增強。

在4個日齡階段，從瘤胃和糞便真菌菌群組成來看，子囊菌門豐度最高，在營養(yǎng)物質(zhì)消化過程中以腐生為主。并使用FUNGuid的功能預測表明，10日齡后，50日齡時瘤胃真菌菌群以病理營養(yǎng)型為主，其余的都以腐生營養(yǎng)型為主。因此內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌主要以腐生營養(yǎng)型為主。腐生營養(yǎng)型真菌主要分解瘤胃內(nèi)的有機物質(zhì)［48］。病原營養(yǎng)型真菌從宿主獲得營養(yǎng)來源，易造成植物病害，而共生營養(yǎng)型真菌則對植株生長和品質(zhì)等產(chǎn)生有益作用［49］。

另外，無論是在門水平上還是在屬水平上，內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便中有大量未分類的真菌，特別在10日齡羔羊瘤胃和糞便中，其豐度隨日齡的增加而減少。而且10日齡時瘤胃及糞便真菌菌群均以未分類的營養(yǎng)型為主，其隨日齡的變化趨勢與未分類真菌豐度的變化相符合，因此10日齡時有主導作用的未分類營養(yǎng)型與大量未分類真菌有直接關系。這些未分類的真菌可能對消化母乳時有著一定的作用，需要進一步探索以深入了解反芻動物真菌生態(tài)系。

4 結(jié) 論

4.1 本試驗中日齡會顯著影響內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃及糞便中真菌群落的β多樣性、物種組成和豐度、顯著富集的物種以及真菌的營養(yǎng)型，而對瘤胃α多樣性的影響不顯著。

4.2 比較同一個日齡瘤胃及糞便真菌群落時發(fā)現(xiàn)，150日齡時糞便真菌總OTU、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均小于瘤胃真菌。瘤胃和糞便真菌菌群組成、β多樣性和顯著富集的物種、真菌營養(yǎng)型存在一定的差異。

4.3 瘤胃和糞便中還有很多豐度較高的未分類菌群，對此還需要進一步研究。

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（編輯 范子娟）