不同單細胞全基因組擴增體系擴增牛微量血液DNA效果評價

摘 要： "旨在通過二代測序技術評估不同單細胞全基因組擴增（single cell whole genome amplification， scWGA）體系對牛微量血液基因組DNA的擴增效果，建立微量DNA全基因組擴增體系。本研究分別采用MDA（multiple displacement amplification）和MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）兩種scWGA體系對華西牛1 ng血液基因組DNA進行全基因組擴增，隨后基于兩種體系的擴增產(chǎn)物以及原始未稀釋血液DNA構建測序文庫，利用DNBSEQ-T7RS測序平臺進行全基因組測序（whole genome sequencing，WGS），通過比較擴增產(chǎn)物片段大小、濃度、總質(zhì)量評估擴增效率，通過分析GC含量、測序覆蓋度、基因分型一致率、基因型檢出率等評估兩種體系的擴增效果。結果顯示，MDA體系的擴增產(chǎn)物片段大于MALBAC體系（8 kb vs.0.2～2 kb），產(chǎn)物濃度和總質(zhì)量顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05）?；跍y序數(shù)據(jù)，1×和5×測序深度下，MDA體系的基因組覆蓋度顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05），此外，MDA體系的分型一致率、檢出率顯著高于MALBAC體系，而等位基因缺失率、假陽性率顯著低于MALBAC體系（Plt;0.05）。綜上，本研究揭示了MDA和MALBAC兩種擴增體系基于華西牛1 ng血液基因組DNA擴增的體系特點，為改進現(xiàn)有華西牛胚胎基因組選擇中的關鍵擴增技術提供理論依據(jù)，促進華西牛遺傳育種進展。

關鍵詞： 全基因組選擇擴增；MDA；MALBAC；微量DNA擴增體系

中圖分類號： S823.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3436-10

收稿日期：2023-12-11

基金項目：國家重點研發(fā)計劃政府間重點專項（2022YFE0100200）；國家自然科學基金國際合作項目（32161143032）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和財政部資助：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系資助（CARS-36）；國家家養(yǎng)動物種質(zhì)資源庫、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS06）

作者簡介：牛一凡（1999-），男，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動物繁殖研究，E-mail： nyf.niuyifan@qq.com

通信作者：馬友記，主要從事綿、山羊繁育與疾病防治的研究，E-mail：yjma@gsau.edu.cn；趙學明，主要從事家畜胚胎生物技術的研究，E-mail：zhaoxueming@caas.cn

Evaluation of the Effect of Different Single Cell Whole Genome Amplification Systems

on the Amplification of Bovine Trace Blood DNA

NIU" Yifan1，2， LI" Chongyang2， YANG" Baigao2， ZHANG" Peipei2， ZHANG" Hang2， FENG" Xiaoyi2，

CAO" Jianhua2， YU" Zhou2， MA" Youji1*， ZHAO" Xueming2*

（1.College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，

China;

2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，

China）

Abstract：" The purpose of this paper was to evaluate the amplification effect of different single cell whole genome amplification （scWGA） systems on bovine trace blood genomic DNA by next-generation sequencing， and to establish a trace DNA whole genome amplification system. In this study， the whole genome of 1 ng blood genomic DNA of Huaxi cattle was amplified by MDA （multiple displacement amplification） and MALBAC （multiple annealing and looping-based amplification cycles） scWGA systems， and then the sequencing library was constructed based on the amplification products of the two systems and the original undiluted blood DNA. The whole genome sequencing （WGS） was usedperformed using the DNBSEQ-T7RS sequencing platform. The amplification efficiency was evaluated by comparing the fragment′s size， concentration and total mass of the amplified products. The amplification effects of the two systems were evaluated by analyzing GC content， average depth， consistent rate of typing and call rate. The results showed that the fragment of the amplified product in MDA system was larger than that in MALBAC system （8 kb vs.0.2-2 kb）， the concentration and total mass of the product were significantly higher than those in MALBAC system （Plt;0.05）. Based on the sequencing data， the genome coverage of MDA system was significantly higher than that of MALBAC system at 1×and 5×sequencing depth（Plt;0.05）. In addition， the consistency of typing rate and call rate of MDA system were significantly higher than MALBAC system， while the allele drop rate and 1 positive rate of MALBAC system were significantly lower than MALBAC system（Plt;0.05）. In summary， this study revealed that the characteristics of two amplification systems of MDA and MALBAC were based on the characteristics of DNA amplification of Huaxi cattle 1 ng blood genome， which provided a theoretical basis for improving the key amplification techniques in Huaxi cattle embryo genome selection and promoting the progress of Huaxi cattle genetics and breeding.

Key words： whole genome sequencingamplification; MDA; MALBAC; trace DNA amplification system

*Corresponding authors： 英文通信作者MA Youji，E-mail：yjma@gsau.edu.cn; ZHAO Xueming， E-mail：zhao-xueming@caas.cn

全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）技術在獲取家畜基因組DNA信息中具有重要的應用價值。該技術最早出現(xiàn)于1992年，伴隨著該技術的發(fā)展，可以做到無偏差地擴增微量DNA或單個細胞的全基因組。該技術可用于測定家畜基因組序列，檢測單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位點［1］和計算估計育種值［2］。目前，在家畜上常用的WGA技術體系包括多重置換擴增（multiple displacement amplification， MDA）、多次退環(huán)狀循環(huán)擴增（multiple annealing and looping-based amplification cycles， MALBAC）［3-4］。

MDA擴增體系由傳統(tǒng)WGA技術改進而形成［5］，是目前最受歡迎的等溫擴增技術［2，6-8］。MDA的擴增步驟包括：首先在30℃條件，隨機6堿基引物與模板DNA在多個位點退火結合，再在phi29 DNA聚合酶的作用下，發(fā)生鏈置換擴增反應，被置換產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物又成為新的復制模板，形成超分支結構，如此循環(huán)，最后產(chǎn)生片段大?。?0 kb的擴增產(chǎn)物［9-10］。這種體系的優(yōu)點是錯誤率和擴增偏差低［11-14］、擴增效率和保真度高［4，15-17］、擴增產(chǎn)物長［12］，但是由于該體系屬于恒溫擴增，所以會導致非特異性擴增［4，15，18-19］和嵌合體［20-21］的形成。

MALBAC的擴增體系結合了PCR和MDA兩種技術體系，具有更高的均勻性［22］、特異性和可重復性［4，13］。MALBAC體系的擴增步驟先是隨機引物在0℃下與模板結合；再通過具有鏈置換活性的DNA聚合酶在65℃下生成半擴增子；然后半擴增子在94℃退火產(chǎn)生全擴增子；全擴增子自環(huán)化可以避免在第一時期PCR中進行反應，而在第二時期PCR中作為靶標［13，23］。最后，MALBAC體系的擴增產(chǎn)物長度為0.2～2 kb［24］。這種體系的優(yōu)點是基因組覆蓋度優(yōu)于MDA，操作較為簡單［25］，擴增均勻性好［26-27］，等位基因缺失（allele dropout，ADO）率較低［28］；但是該體系所使用的Bst和Taq聚合酶不能高保真［29］，在DNA模板量少時，假陽性率偏高［11，30-31］。

華西牛是我國最新培育的肉牛品種，具有生長速度快、屠宰率和凈肉率高、繁殖性能好、抗逆性強、適應性廣等特點［32-33］。目前，華西牛群體規(guī)模亟需擴大，胚胎基因組選擇技術可實現(xiàn)華西牛在胚胎階段的優(yōu)生優(yōu)育選擇，大幅度加快育種選擇進展和優(yōu)質(zhì)群體擴繁。因此，本試驗采用兩種單細胞全基因組擴增體系對華西牛母牛微量血液基因組DNA進行擴增，然后同原始血液DNA一起進行二代測序（next-generation sequencing，NGS），來比較不同的單細胞全基因組擴增體系對于微量牛血液DNA的擴增效率，為改進現(xiàn)有牛微量血液基因組DNA擴增體系提供理論依據(jù)，為開發(fā)華西牛胚胎全基因組擴增體系提供參照。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需牛血液均來自北京安伯胚胎生物技術有限公司石家莊肉牛良種場，2023年1月份采集的同一飼養(yǎng)管理條件下的3頭母牛，母牛品種均為華西牛。用5 mL注射器（換為9號針頭）從牛號為A、B和C的3頭母牛尾根處采集適量靜脈血，注射進抗凝血采樣管，冰袋運輸，-20℃冰箱保存。單細胞全基因組擴增體系選擇多重置換擴增（MDA）體系和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增（MALBAC）體系。

1.2 試驗方法

1.2.1 母牛血液基因組DNA的提取、質(zhì)檢

牛血液室溫下解凍后，移液槍吸取1 mL按照常規(guī)SDS法提取血液DNA，提取出的100 μL牛血液DNA于-20℃保存，冰袋運輸。采用NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀進行DNA濃度和純度的測定，采用BIO-RAD電泳儀和 DYPC-31BN電泳槽放入 0.8%瓊脂糖凝膠，電泳液采用1×TAE（天津康普森），在點樣孔中加入100 ng DNA樣品和3 μL Loading Buffer，Marker點樣孔中加入3 μL Trans 2000 plus II（TaKaRa，上海），電壓選擇170 V，電泳25 min，在Newbio Gi-1凝膠成像設備中拍攝膠圖。剩余樣品放入-20℃ 冰箱，Loading Buffer與Marker放入4℃冰箱保存。

1.2.2 牛微量血液基因組DNA擴增

測定濃度后的牛血液DNA采用TE緩沖液進行稀釋（取1 μL稀釋至1 ng·μL-1），取稀釋后的牛血液DNA 1 μL（即1 ng），再分別根據(jù)兩種體系制造商的要求進行1 ng血液基因組DNA的全基因組擴增。MDA體系操作步驟：在離心管中用無核酸酶水將血液基因組DNA補充到2.5 μL，加入2.5 μL反應緩沖液D1后室溫孵育3 min，再加入5 μL停止液，最后加入由8 μL無核酸酶水、30 μL緩沖液和2 μL DNA聚合酶組成的40 μL反應混合液，在30℃孵育3 h后，將酶在65℃下滅活5 min。MALBAC體系操作步驟：將5.5 μL裂解混合液加入盛有1 μL血液基因組DNA的PCR管中，反應條件為50℃ 50 min 和80℃ 100 min孵育。再加入30 μL預擴增混合液，反應條件為95 ℃ 3 min，然后運行8次預擴增循環(huán)（每次循環(huán)：20 ℃ 40 s，30 ℃ 40 s，50 ℃ 30 s，60℃ 30 s，70 ℃ 4 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 10 s），然后加入30 μL擴增混合液，反應條件為95 ℃ 3 min，并運行14次PCR擴增循環(huán)（每次循環(huán)： 94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min）。MALBAC體系步驟中描述需要設置陰性對照（DNA換為無核酸酶水即為陰性對照）。

1.2.3 牛微量血液基因組DNA擴增產(chǎn)物的質(zhì)檢

采用兩種擴增體系分別擴增1 ng母牛血液DNA，同時采用原始血液DNA樣本進行測序作為原始對照（NC組）。牛血液微量基因組DNA擴增出的文庫DNA質(zhì)檢同血液基因組DNA的質(zhì)檢，但紫外分光光度計采用Qubit。

1.2.4 牛微量血液DNA擴增產(chǎn)物與原始血液DNA的文庫構建、質(zhì)檢與上機測序

血液DNA 質(zhì)控合格后進行打斷、末端修復、加“poly-A”尾、加測序接頭、 PCR 富集等步驟構建 DNA 文庫。將雙鏈的靶區(qū)域文庫進行變性、環(huán)化和消化，得到單鏈環(huán)狀 DNA。單鏈環(huán)狀 DNA 通過滾環(huán)擴增技術（rolling circle amplification）得到擴增產(chǎn)物即 DNA 納米球（DNA nano ball）。文庫構建完成后，使用 Qubit 進行定量質(zhì)控，文庫質(zhì)量合格后利用DNBSEQ-T7RS測序儀對12個樣本的DNA片段進行雙末端測序，按照PE 150測序策略執(zhí)行，獲得的原始reads以FASTQ格式保存。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)的處理與分析" 通過BWA軟件將Clean reads比對到參考基因組（Bos taurus ARS-UCD1.3 GCA_002263795.3）上，統(tǒng)計各樣品的比對率、測序深度、基因組覆蓋度等信息。檢出率是指該樣本所有位點基因型檢出（非缺失）SNP位點數(shù)與重測序所有樣本SNP位點數(shù)比值。分型一致率是指以原始對照血液重測序樣本檢出位點基因型為參考，擴增樣本的基因型（非缺失）與對照樣本基因型（非缺失）一致的比率。等位基因缺失率是指參考的對照組重測序樣本基因型為AC，擴增后位點變?yōu)榧兒螦A，統(tǒng)計擴增后等位基因發(fā)生缺失的位點比例。假陽性率計算是指參考的對照組重測序樣本基因型為AA，擴增后位點變?yōu)锳C，統(tǒng)計擴增后等位基因發(fā)生改變（假陽性）的位點比例。本次重測序獲得的總SNP位點為11 791 129（檢出位點數(shù)、對照組缺失位點、擴增組缺失位點、對照組和擴增組同時缺失位點的總和）。測序數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0 進行單因素ANOVA檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，利用GraphPad Prism 8進行差異顯著性柱狀圖的繪制。

2 結 果

2.1 3頭母牛血液DNA的質(zhì)檢結果

為了順利進行血液基因組DNA的擴增，本研究首先對母牛血液DNA進行質(zhì)檢。質(zhì)檢結果如表1所示，3頭母牛血液DNA質(zhì)檢后的濃度和總量達到了進行后續(xù)擴增試驗的要求。

3頭牛血液基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖" 見圖1，3頭牛血液基因組DNA的片段長度主要集中在8 000 bp以上，且條帶較為集中，說明這3頭牛的血液DNA不存在污染情況。

2.2 牛1 ng血液DNA擴增產(chǎn)物質(zhì)檢結果

為探究不同體系對于微量牛血液DNA的擴增效果，本研究對不同體系的擴增產(chǎn)物進行了濃度測定與擴增倍數(shù)統(tǒng)計。如表2所示，MALBAC體系的擴增產(chǎn)物最終體積為65 μL，MDA體系為50 μL，且所有擴增產(chǎn)物的濃度、純度、完整性和總量都滿足試驗要求。結果表明，MDA體系擴增產(chǎn)物的濃度、總質(zhì)量和擴增倍數(shù)都極顯著的優(yōu)于MALBAC體系（Plt;0.01）。

如圖2所示，MDA體系擴增牛血液文庫DNA的主帶集中在大于8 kb的部分，MALBAC體系集中在0.2～2 kb之間，可見，MDA體系的擴增產(chǎn)物片段較長。

2.3 牛1 ng 血液DNA擴增產(chǎn)物測序數(shù)據(jù)量結果

本研究對1 ng 牛血液DNA經(jīng)過試劑盒擴增后測序數(shù)據(jù)量、Q20值、Q30值和GC含量進行統(tǒng)計匯總。如表3所示，本次共計測出752.13G的原始數(shù)據(jù)，過濾后的堿基總量為751.05G，測得原始reads數(shù)目為2 507 086 432，過濾后的reads數(shù)目為2 505 286 542，有效堿基比率總體均值為99.93%，Q20值的總體均值為97.14%，Q30值的總體均值為91.87%，總體的GC含量均值為42.52%。足證說明本次的數(shù)據(jù)產(chǎn)出足夠，Q20值與Q30值合格。

2.4 牛1 ng 血液DNA擴增產(chǎn)物比對統(tǒng)計結果

為探究不同擴增體系對于1 ng 牛血液DNA的比對效果與體系重現(xiàn)性，本研究對經(jīng)不同體系擴增的微量牛血液DNA進行比對統(tǒng)計匯總。如表4和圖3所示，本次比對統(tǒng)計結果顯示NC組（（99.87±0.021）%）、MDA（（99.88±0.012）%）和MALBAC體系（（99.86±0.006）%）的比對率無顯著性差異。從正確比對率來看，NC組（（98.41±0.040）%）顯著高于MDA體系（（94.92±1.161）%）和MALBAC體系（（93.97±0.217）%，Plt;0.05）。從重復率結果來看，NC組 （（2.25±0.917）%）顯著高于MDA體系（（1.48±0.124）%，Plt;0.05），但與MALBAC體系 （（1.99±0.447）%）沒有顯著差異，且MDA體系與MALBAC體系也無顯著性差異。

2.5 牛1 ng 血液DNA擴增產(chǎn)物測序質(zhì)控統(tǒng)計結果

為了探究兩種WGA體系擴增產(chǎn)物測序的質(zhì)量效果，本研究統(tǒng)計了平均測序深度下兩種體系擴增產(chǎn)物測序的分型一致率、等位基因缺失率、假陽性率與檢出率。如表5和圖4所示，牛血液DNA的測序質(zhì)控統(tǒng)計結果顯示，MDA體系的分型一致率（（97.96±0.987）%）極顯著高于MALBAC體系（（87.50±1.236）%，Plt;0.01）；MALBAC體系的

等位基因缺失率（（6.29±1.239）%）顯著高于MDA體系（（0.85±0.072）%，Plt;0.05）；MALBAC體系的假陽性率（（4.09±0.397）%）極顯著高于MDA體系（（0.87±0.116）%，Plt;0.01）；而MDA體系的檢出率（（98.87±0.192）%）顯著高于MALBAC體系（（86.55±3.120）%，Plt;0.05），說明MDA體系的測序擴增產(chǎn)物的測序質(zhì)量效果優(yōu)于MDAMALBAC體系（表5）。

2.6 牛1 ng 血液DNA擴增產(chǎn)物測序深度及覆蓋度統(tǒng)計結果

為研究兩種WGA體系擴增產(chǎn)物的測序覆蓋度效果，本研究統(tǒng)計了兩種體系擴增產(chǎn)物測序的平均測序深度與測序覆蓋度。如圖5所示，本次的平均測序深度結果顯示，NC組 （（23.13±1.305）×）顯著低于MDA體系（（36.04±4.519）×，Plt;0.05），但兩者都與MALBAC體系（（29.13±8.904）×）無顯著性差異。從1×測序覆蓋度來看，NC組（（98.82±0.050）%）極顯著高于MALBAC體系（（91.79±2.086）%，Plt;0.01），但與MDA體系（（98.42±0.148）%）無顯著性差異，同時，MDA體系的1×測序覆蓋度顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05）。從5×測序覆蓋度來看，NC組（（97.83±0.100）%）和MDA體系（（96.80±0.290）%）都極顯著高于MALBAC體系（（71.49±6.631）%，Plt;0.01），說明MDA體系的測序覆蓋度優(yōu)于MALBAC體系，尤其是在測序高測序深度時的測序覆蓋度。

3 討 論

隨著二代測序技術的快速發(fā)展和廣泛應用，使其測序成本大幅下降［34］，二代測序技術有望運用在牛的胚胎基因組選擇上。另一方面，科學家們重視對擴增技術進行不斷地改進，使我們可以得到高保真、擴增偏倚小、等位基因丟失少的擴增產(chǎn)物，例如數(shù)字液滴多重置換擴增（dd MDA）［35］、凝膠多重置換擴增（gel MDA）［36］等。本研究采用已有的兩種不同擴增體系對微量牛血液DNA進行全基因組擴增，比較不同WGA體系的擴增效果，再通過二代測序的結果來評定兩種擴增體系的測序效果。

首先，從擴增效果上來看，MDA體系在擴增產(chǎn)物濃度、總質(zhì)量和擴增倍數(shù)方面極顯著優(yōu)于MALBAC體系，這與Liu等［37］的研究結果相似，他使用MALBAC體系的擴增產(chǎn)物平均濃度在44.66 ng·μL-1（一個卵裂球），MDA體系的擴增產(chǎn)物平均濃度為340.9 ng·μL-1（一個卵裂球），比本次研究高出1倍多。造成這種情況可能的原因是對方所擴增樣本的類型是人的卵裂球，雖然起始DNA量大概在6 pg左右，但是所擴增的時間也較長。本次的瓊脂糖凝膠電泳圖結果同樣顯示出MDA體系的擴增產(chǎn)物（大于8 kb）大于MALBAC體系（0.2～2 kb），本研究結果與Lyu等［38］的研究結果：MDA 產(chǎn)生的片段大小為10～100 kb相同，本研究中MALBAC 體系產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物（0.2～2 kb）同樣與Huang等［14］、Zhang［39］等、Zhou［4］等和Lyu等［38］的研究結果MALBAC體系產(chǎn)生擴增產(chǎn)物長度為0.3～2 kb相似。本研究表明，MDA體系對1 ng牛血液DNA的擴增效果優(yōu)于MALBAC體系。

其次，相關研究表明，MALBAC體系偏向于擴增高GC含量區(qū)域［40］，但是此次MALBAC體系擴增出的GC含量更接近于NC組的大量血液DNA的直接測序結果，說明MALBAC體系可以較為準確地擴增牛微量血液基因組DNA。再從比對統(tǒng)計結果方面來看，MDA體系和MALBAC體系的比對率、正確比對率和重復率并無顯著性差異，但MALBAC體系的重復率較高，表明MALBAC體系的重現(xiàn)性較好，這與Zhou等［4］和Chen等［13］的研究結果相似。與此同時，MDA體系的平均測序深度和1×測序覆蓋度與MALBAC體系無顯著差異，但在5×測序覆蓋度方面，MDA體系極顯著優(yōu)于MALBAC體系，表明隨著測序深度的增加，MALBAC體系的測序覆蓋度不如MDA體系，且MDA體系的測序覆蓋度較為穩(wěn)定。此外，MDA體系與MALBAC體系在分型一致率、等位基因缺失率、假陽性率與檢出率等指標上的差異顯示出MDA體系的測序效果顯著優(yōu)于MALBAC體系。綜上，MDA體系在微量血液DNA的擴增效果和測序效果方面優(yōu)于MALBAC體系。

最后，本研究的試驗結果正如同Biezuner等［41］研究7種單細胞全基因組擴增體系的靶向測序結果表明，市售的試劑盒都存在某一或幾個方面的優(yōu)勢，沒有一種體系會在所有測序指標中都表現(xiàn)出優(yōu)勢，還是需要根據(jù)試驗的需要進行專門的WGA體系選擇［29］。當前已有擴增體系還存在微量DNA的全基因組擴增會導致假陽性、等位基因缺失、喪失雜合性等局限性［42］。未來，還需要不斷改進WGA體系所用DNA聚合酶和反應步驟來優(yōu)化擴增體系，或者對WGA體系的反應體積進行縮小，來提高擴增和測序效果［4］。

4 結 論

本研究通過對3頭華西牛微量血液DNA分別采用兩種不同的全基因組擴增體系進行擴增后測序，成功探明了不同體系對微量牛血液DNA擴增的優(yōu)勢與不足，并發(fā)現(xiàn)MDA體系相對擴增效果與測序效果好于MALBAC體系。本研究結果從測序結果的基礎上分析了已有擴增體系對微量牛血液DNA的擴增效果，為下一步進行牛胚胎基因組選擇提供了理論依據(jù)。同時，我們的本研究結果表明，MDA體系是目前對微量華西牛血液DNA的綜合擴增效果最好的一款已有體系，但是仍存在不能高保真擴增GC區(qū)域和需要較深測序深度這兩方面的劣勢，還是需要根據(jù)自身試驗需求來進行市售單細胞擴增體系的選擇。

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（編輯 郭云雁）