錳納米佐劑的制備及生物學(xué)效應(yīng)

摘 要： 錳作為生命活動(dòng)中重要微量元素參與了多種生理過程。對(duì)于能量代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和免疫系統(tǒng)正常運(yùn)行至關(guān)重要。與可溶性錳離子相比，納米錳可維持錳離子在注射部位持續(xù)釋放，以誘導(dǎo)局部的免疫應(yīng)答，并增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells， DCs）對(duì)抗原的攝取，促進(jìn)DCs在體內(nèi)活化與成熟。本文從納米錳作用機(jī)制、制備方法、功能表征、納米佐劑存在的問題和解決策略等方面進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹了納米錳作為疫苗佐劑的應(yīng)用，并提出存在問題及解決策略。

關(guān)鍵詞： 納米錳；疫苗佐劑；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3374-09

收稿日期：2023-09-04

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)（232102310381）；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院博士科研啟動(dòng)資金資助（2022HNUAHEDF033）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目子課題（2021YFD1301201）

作者簡(jiǎn)介：王夢(mèng)迪（1989-），女，河南南陽人，博士，主要從事動(dòng)物生理生化研究，E-mail：mengdi.ok@163.com；王 恒（1999-），男，河南安陽人，碩士生，主要從事動(dòng)物生理生化研究，E-mail：771521561@qq.com。王夢(mèng)迪和王恒為同等貢獻(xiàn)作者

通信作者：楊國(guó)宇，主要從事動(dòng)物生理生化研究，E-mail：haubiochem@163.com

Preparation of Nano-manganese and Its Biological Effects

WANG" Mengdi2， WANG" Heng1， LU" Xiuxiang1， WANG" Yumin1， FAN" Wenjie 1， YAO" Chen1， LIU" Pengxiang1， MA" Yanjie

1， YANG" Guoyu1，2*， WANG" Jiang1*，

（1.Key Open Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.College of Food and Biotechnology，

Henan University of Animal Husbandry Economics， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract： Manganese is an important trace element that participates in various physiological processes， including skeletal， reproductive， energy metabolism， and normal functioning of the nervous and immune systems. Compared with soluble manganese ions， nano-manganese can maintain the continuous release of manganese ions at the injection site， induce local immune responses， and enhance the cellular uptake of antigens by dendritic cells （DCs）， promoting the activation and maturation of DCs in the body. This article reviews the relevant issues of nano-manganese from the perspectives of their mechanism of action， preparation methods， functional characterization， problems with nano adjuvants， and solutions. The application of nano-manganese as vaccine adjuvants was emphasized and the problems and solutions of nano-manganese were proposed.

Key words： nano-manganese; vaccines adjuvant; research progress

*Corresponding author：" WANG Mengdi， E-mail： mengdi.ok@163.com; WANG Jiang， E-mail： wangjiang@henau.edu.cnYANG Guoyu， E-mail：haubiochem@163.com

佐劑是一類自身無抗原性，但先于或同時(shí)與抗原混合使用后，能非特異性增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答并顯著提升疫苗效果的物質(zhì)。佐劑首次出現(xiàn)在大眾視野中是1925年，當(dāng)時(shí)法國(guó)免疫學(xué)家兼獸醫(yī)學(xué)家Gaston Ramon通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在注射白喉或破傷風(fēng)類毒素時(shí)加入面包屑和木薯粉等常規(guī)物質(zhì)能夠明顯增強(qiáng)抗毒素免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨后又證實(shí)金屬鹽類、淀粉、油脂、維生素等也具有同樣的功能，這類能夠顯著增強(qiáng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)后來被統(tǒng)稱為佐劑。隨后在1926年，Glenny無意中發(fā)現(xiàn)明礬（鋁）沉淀的蛋白能夠提高抗體產(chǎn)量［1］，目前為止，鋁佐劑仍然是人用疫苗中廣泛使用的佐劑。然而，鋁佐劑在一定程度上存在一定缺陷，如鋁佐劑對(duì)增加血清抗體通常有效，但會(huì)引起注射部位反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力較弱，在一定程度上限制了它的應(yīng)用［2-4］。所以尋找能夠有效激活細(xì)胞免疫的佐劑具有重大的價(jià)值和深遠(yuǎn)的意義。

隨著現(xiàn)代生物免疫研究的發(fā)展，人們對(duì)金屬離子在免疫中的作用不斷進(jìn)行探索，一些金屬離子免疫調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了金屬離子在生物免疫學(xué)的應(yīng)用研究，使得現(xiàn)代生物免疫學(xué)這個(gè)學(xué)科越來越引人注目，也使得新的佐劑研發(fā)進(jìn)入快車道。其中以環(huán)鳥苷磷酸腺苷合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（STING）激動(dòng)劑相關(guān)佐劑的研發(fā)最為矚目。2018年，北京大學(xué)生科院蔣爭(zhēng)凡課題組［5］發(fā)現(xiàn)錳離子（Mn2+）可以很強(qiáng)地激活環(huán)鳥苷磷酸腺苷合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（STING）（圖1），并證明錳離子（Mn2+）是第二種cGAS激動(dòng)劑，且激活能力更強(qiáng)。類似結(jié)果也被國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)［6-8］。這些結(jié)果都提示錳離子（Mn2+）可能具有免疫佐劑，尤其是細(xì)胞免疫佐劑的效果。

1 錳是維持免疫力的重要元素

鐵、鎂和錳等金屬元素是病原微生物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的元素。為了抵抗入侵的病原微生物，機(jī)體采取多種方法限制其獲取這些營(yíng)養(yǎng)元素，這種防御機(jī)制稱為營(yíng)養(yǎng)免疫。錳作為過渡金屬元素，它廣泛應(yīng)用于包括農(nóng)業(yè)、化工、金屬在內(nèi)的很多領(lǐng)域。錳元素存在于自然界中大多是以二價(jià)離子（Mn2+）的形式，錳離子的離子半徑處在鈣離子和鎂離子之間。相關(guān)研究顯示，錳離子幾乎能替代鎂離子和鈣離子在結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，而且在一些需要鈣離子或鎂離子參與的生化合成過程中，錳離子經(jīng)常能夠替代鈣離子和鎂離子的功能［9］。從生物化學(xué)的角度來看，錳離子和鎂離子在細(xì)胞中的催化作用存在著密切的聯(lián)系。一方面，兩者具有相似性，錳離子能夠替代鎂離子作為催化核心與酶結(jié)合，催化類似的生化反應(yīng)發(fā)生，另一方面，兩種離子在酶促反應(yīng)的效率、生化反應(yīng)的產(chǎn)物和對(duì)底物的親和力等方面具有相似性，如在錳離子替代鎂離子進(jìn)行體外催化反應(yīng)中，酶的活性通常會(huì)比以鎂離子為催化核心時(shí)更高。

錳在動(dòng)物生長(zhǎng)中有著重要作用，主要體現(xiàn)如下方面［10-11］。（1）骨骼發(fā)育：錳在動(dòng)物體內(nèi)是一種重要的骨骼成分，能夠促進(jìn)骨骼的形成與生長(zhǎng)，并參與鈣、磷等礦物質(zhì)的代謝過程，從而對(duì)骨骼發(fā)育起到重要作用。（2）生殖系統(tǒng)：錳對(duì)動(dòng)物的生殖系統(tǒng)也有很大的影響，它在生殖過程中起到重要輔助作用，能夠促進(jìn)雌性動(dòng)物的排卵和卵巢功能的正常運(yùn)行，并對(duì)精子的生產(chǎn)和質(zhì)量有著積極的作用。（3）能量代謝：錳對(duì)葡萄糖代謝和脂肪代謝有調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)葡萄糖的吸收和利用，并參與動(dòng)物體內(nèi)脂肪的氧化分解過程，從而提高動(dòng)物體內(nèi)的能量代謝水平。（4）神經(jīng)系統(tǒng)：錳在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持也十分關(guān)鍵，它能夠促進(jìn)神經(jīng)元的正常分泌和傳導(dǎo)，從而維持神經(jīng)系統(tǒng)的生理運(yùn)行。（5）免疫系統(tǒng)：錳在動(dòng)物體內(nèi)是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，它能夠清除體內(nèi)的自由基和毒素，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而提高免疫系統(tǒng)的功能和抵抗力（圖2）。另外，有相關(guān)分子機(jī)制的研究表明［12-13］，錳離子作為佐劑促進(jìn)免疫應(yīng)答的機(jī)理是：①顯著促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的成熟；②促進(jìn)單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，Mo-DCs）的分化；③增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞攝取抗原的能力；④刺激CD4+ T細(xì)胞的分化。

2 納米錳制備方法

不同的納米粒制備過程，納米粒的大小、結(jié)構(gòu)也會(huì)有所差異。納米錳粒常見的制備方法有單一錳材料制備法、納米球包裹制備法和雙佐劑抗原共遞送系統(tǒng)法等。

單一錳材料制備法：該方法操作簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，適用于大批量生產(chǎn)。水熱法［14］：該方法將MnSO4/MnCl2/Mn（NO3）2與KMnO4，溶解于自制蒸餾水中，在磁力攪拌條件下，倒入反應(yīng)釜中，密封條件下高溫反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，固體產(chǎn)物分別用蒸餾水和無水乙醇洗滌，用高速離心機(jī)離心，將固體沉淀下來，過濾干燥得到最終產(chǎn)物MnO2。磷酸錳納米材料制備方法［15］：該方法首先將磷酸二氫鹽溶液加入二價(jià)錳鹽溶液中，攪拌均勻，接著在磁力攪拌的作用下，向上述混合溶液中加入磷酸一氫鹽溶液，肉眼可見溶液由無色透明變?yōu)槿榘咨?，即形成了納米級(jí)微?！姿徨i納米材料，該方法制備了具有單一錳元素價(jià)態(tài)的新型磷酸錳納米顆粒，其化學(xué)組成為Mn3（PO4）2·nH2O。該方法所制備的磷酸錳納米顆粒能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存、具有高度的均一性、生物可降解、具有良好的pH敏感性，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境條件下即可降解，釋放錳離子以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

納米球包裹制備法：錳在到達(dá)腫瘤部位之前被正常組織吞噬，導(dǎo)致全身毒性和過量治療劑量。因此，錳在腫瘤治療中使用的主要瓶頸在于將錳靶向遞送到腫瘤部位，從而有效地產(chǎn)生和激活免疫細(xì)胞來對(duì)抗腫瘤細(xì)胞［16-17］。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)最有效的方法是使用納米材料作為Mn的運(yùn)載工具或直接設(shè)計(jì)Mn基納米材料。2022年12月，四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室宋相容教授團(tuán)隊(duì)［18］在研究的新型可電離脂質(zhì)IC8的基礎(chǔ)上配伍STING激動(dòng)劑Mn（錳），構(gòu)建了mRNA遞送的脂質(zhì)納米?！狪C8/Mn LNPs，研究發(fā)現(xiàn)，該遞送系統(tǒng)在體內(nèi)外均提高了mRNA表達(dá)，并能夠通過激活STING通路促進(jìn)抗原提呈，最終各項(xiàng)研究證實(shí)，新佐劑脂質(zhì)納米?！狪C8/Mn LNPs既能提高抗原提呈能力，又能增強(qiáng)mRNA表達(dá)，可作為mRNA疫苗的佐劑，應(yīng)用前景十分廣闊。Sun等［19］設(shè)計(jì)了一種改進(jìn)的Stber方法合成二氧化硅納米球，在燒杯中加入乙醇、氨水和去離子水進(jìn)行試驗(yàn)。攪拌過程中加入硅酸乙酯懸浮液變成渾濁的白色，離心后用去離子水重懸，加入高錳酸鉀，超聲滅菌后，將沉淀加入Na2CO3溶液中，最后離心得到hMnO2 NPs。He等［20］設(shè)計(jì)了一種二氧化硅包裹的MnO納米顆粒。將油酸錳和1-十八烯混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下高溫劇烈攪拌，最后用丙酮沉淀下來，得到MnO納米粒，隨后將MnO納米粒與CTAC以及TEOS和正己烷的混合物依次混合，得到二氧化硅包覆的MnO納米顆粒。該方法與MnFe2O4 NPs等其他Mn基NPs相比［18-19］，二氧化硅包覆的MnO納米顆粒在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出快速、敏感的降解優(yōu)勢(shì)，為絕對(duì)降解和從生物系統(tǒng)中提取奠定了基礎(chǔ)。

雙佐劑抗原共遞送系統(tǒng)法：應(yīng)用最廣泛的鋁佐劑誘導(dǎo)有效Th1型免疫反應(yīng)的能力較差［21］，錳又是一種潛在的金屬佐劑，通過激活環(huán)鳥苷磷酸腺苷合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（STING）信號(hào)通路，增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，有效調(diào)節(jié)金屬成分有望成為提高疫苗免疫效率的新策略。Qiao等［8］構(gòu)建了錳鋁雙佐劑抗原共遞送系統(tǒng)（MnO2-Al-OVA）來增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫應(yīng)答，即首先將氫氧化鋁熔接在預(yù)先制備好的二氧化錳納米顆粒表面，并與高錳酸鉀（KMnO4）和油酸（OA）進(jìn)行簡(jiǎn)單氧化還原反應(yīng)合成二氧化錳納米顆粒。MnO2-Al-OVA能顯著促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的內(nèi)化和成熟。皮下接種后，MnO2-Al-OVA迅速遷移到淋巴結(jié)（LNs）并有效激活cGAS-STING通路，極大地誘導(dǎo)了體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。國(guó)外研究者Kuo等［22］，使用明礬與TLR9激動(dòng)劑（CpG）聯(lián)合用于COVID-19疫苗和天花亞單位疫苗，將鋁佐劑與免疫刺激劑結(jié)合，同樣是極大地誘導(dǎo)了體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。這樣的雙佐劑抗原共遞送納米疫苗具有良好的安全性和簡(jiǎn)便的制備工藝，具有很大的臨床轉(zhuǎn)譯前景。

3 納米錳功能表征

納米粒表征及穩(wěn)定性等相關(guān)檢測(cè)對(duì)研究納米粒作用機(jī)制及納米粒的推廣使用具有重要意義。納米粒的大小有助于科學(xué)家們確定納米粒的使用途徑、功效、藥物釋放情況和降解模式。用動(dòng)態(tài)光散射、掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡等檢測(cè)手段可確定納米粒大小、分布和形態(tài)等參數(shù)［23］。研究結(jié)果顯示，檢測(cè)納米粒Zeta電荷對(duì)納米粒體外釋放、黏附性、穩(wěn)定性以及納米粒在機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)特性具有重要意義［11］。納米粒的分散系數(shù)（PDI）可直接反映納米粒的分散狀態(tài)。納米粒的Zeta電荷、PDI及粒徑均可通過馬爾文Zeta電位儀進(jìn)行檢測(cè)［24］。研究表明，Zeta電位的重要意義在于它的數(shù)值與膠態(tài)分散的穩(wěn)定性相關(guān)［25］。Zeta電位是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力的強(qiáng)度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta電位的絕對(duì)值（正或負(fù)）越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta電位（正或負(fù)）越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚，即吸引力超過了排斥力，分散被破壞而發(fā)生凝結(jié)或凝聚。PDI用于描述聚合物分子量分布［26］。高分子的分子量通常不均一，本質(zhì)上是混合物，用平均分子量來描述高分子的分子量大小。PDI越大，分子量分布越寬；PDI越小，分子量分布越均勻。

4 納米錳作為疫苗佐劑的影響因素

有相關(guān)研究顯示，納米錳搭載抗原注入機(jī)體后可增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）的募集效果，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的攝取率。比抗原單獨(dú)使用或傳統(tǒng)油佐劑相比，納米錳具有更好的免疫或治療效果［20，27］。納米錳作為疫苗佐劑包封抗原后，因其作為載體可負(fù)載單獨(dú)抗原或幾個(gè)不同的抗原［16，28］，并且具有良好的緩釋效果。它為機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)反應(yīng)［29-30］。研究結(jié)果證明，抗原和佐劑的共同傳遞能被細(xì)胞有效攝?。?1］。納米粒大小、形狀及緩沖液pH等對(duì)納米粒佐劑與抗原結(jié)合有著重要影響的情況下［32-33］，科學(xué)家們基于此圍繞Mn納米粒展開了一系列研究，優(yōu)化其制備方法、粒徑、形狀及表面電荷，以求制備出更為有效的錳納米佐劑。

4.1 粒徑對(duì)納米粒佐劑效果的影響

為了制備出最佳疫苗載體，學(xué)者們對(duì)錳納米粒粒徑進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其機(jī)體作用途徑進(jìn)行了檢測(cè)。與直接將Mn2+加入PBS （pH=7.4）中［34］形成直徑大于1000 nm的大顆粒相比，Sun等［35］以Mn納米粒為基礎(chǔ)，制備出了平均粒徑為35 nm的均勻的納米粒，評(píng)價(jià)了納米粒淋巴結(jié)傳送效率及淋巴結(jié)內(nèi)樹突狀細(xì)胞（DC）的有效靶向性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該納米粒能夠快速進(jìn)入淋巴結(jié)，并且高效地被DC所攝取，進(jìn)而能夠快速誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)。同時(shí)，通過研究納米粒對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)類型的影響檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該大小的納米粒介導(dǎo)能夠誘導(dǎo)機(jī)體 IFN-γ高水平分泌，免疫類型偏向Th1型免疫反應(yīng)。Hou等［36］開發(fā)的一種以Mn為基礎(chǔ)的先天免疫納米佐劑，該納米粒平均粒徑在100 nm左右，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）誘導(dǎo)和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell， NK）募集。同時(shí)，cGAS-STING下游通路也能被激活，上調(diào)Ⅰ型IFN和TNF-α的表達(dá)，具有潛在的抗癌作用。國(guó)外研究學(xué)者KANG研究發(fā)現(xiàn)［37］，10～200 nm的納米顆?？梢酝ㄟ^淋巴毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入淋巴管，隨著淋巴液的排出到達(dá)淋巴結(jié)，實(shí)現(xiàn)對(duì)淋巴結(jié)的靶向遞送。之后，它們被淋巴結(jié)中的APC內(nèi)化，淋巴結(jié)中富含CD8+亞型樹突狀細(xì)胞，具有抗原交叉遞呈能力。隨后由DC呈遞的MHC-Ⅰ類抗原可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。以上結(jié)果表明，Mn納米粒的粒徑大小可以決定作用途徑及介導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型和免疫反應(yīng)強(qiáng)弱。因此，納米粒大小對(duì)Mn納米粒疫苗佐劑在機(jī)體內(nèi)的效應(yīng)發(fā)揮具有重要意義。

4.2 pH對(duì)納米粒佐劑效果的影響

不同pH環(huán)境中，納米錳形成的顆粒大小也不一樣。國(guó)外研究者Jin等 ［38］研究發(fā)現(xiàn) Mn3（PO4）2·3H2O在室溫下在水溶液中自發(fā)沉淀，并在中性pH條件下的Mn3（PO4）2·3H2O中，他們發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液可以誘導(dǎo)出一種較不規(guī)則的Mn幾何形。這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)，為深入了解原子結(jié)構(gòu)與催化活性之間的相互作用提供了有價(jià)值的見解。此外，Zhou等［39］發(fā)現(xiàn)，在制備Mn2+顆粒時(shí)，PBS中形成的Mn2+大顆粒在1h內(nèi)會(huì)迅速沉淀，而在pH=4.7的磷酸鹽緩沖液中形成的納米粒具備丁達(dá)爾效應(yīng)，使用后者的方法制備納米錳材料具備3 d的穩(wěn)定性。隨后為了模擬細(xì)胞內(nèi)核內(nèi)體（pH 5～6）和溶酶體（pH 4～5）的酸性條件，將納米錳材料暴露于PBS （pH 7.4）或酸性溶液（pH 4.5、5.5、6.5）中。nano-MnP在中性條件下（pH 6.5～7.4）可以保持相對(duì)穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)而不會(huì)降解，而在酸性條件下（pH 4.5～5.5）則逐漸降解為游離的Mn2+，說明nano-MnP可以在細(xì)胞外微環(huán)境的中性環(huán)境中保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但在細(xì)胞內(nèi)和溶酶體的酸性環(huán)境中可以降解釋放Mn2+。

4.3 形狀對(duì)納米粒佐劑效果的影響

納米粒形狀對(duì)其佐劑活性強(qiáng)弱也有一定的影響。納米粒形狀不同，導(dǎo)致不同納米粒和細(xì)胞膜接觸后形成的角度不同，被APC攝取的效率也不同。Niikura等［40］分別對(duì)圓球狀、橄欖球狀及棒狀納米粒進(jìn)行了APC細(xì)胞的攝取率檢測(cè)，結(jié)果顯示，棒狀或橄欖球狀納米粒豎直和細(xì)胞膜接觸時(shí)所產(chǎn)生的阻力最小，易被吞噬，但當(dāng)棒狀或橄欖球狀納米粒橫向接觸細(xì)胞膜時(shí)所產(chǎn)生的阻力要遠(yuǎn)大于圓球狀納米粒，且納米粒接觸細(xì)胞膜時(shí)，因表面張力的作用，使棒狀或橄欖球狀納米粒更容易以橫向方式和細(xì)胞膜接觸。因此相對(duì)棒狀或橄欖球狀納米粒，圓球狀更容易被APC攝?。?7］。因此，合理設(shè)計(jì)納米粒的形狀，對(duì)其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮有效的免疫效果具有重要意義。

5 納米錳佐劑的免疫途徑和誘發(fā)的免疫應(yīng)答類型

納米錳通過肌肉注射、皮下注射和鼻腔等途徑免疫，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫等（圖3）。

Zhang等［41］使用錳顆粒，將其在當(dāng)OH-/PO43-比例在1∶3和2∶1之間時(shí)，錳鹽呈果凍狀膠體（MnJ）。當(dāng)鼻內(nèi)給藥時(shí)，MnJ作為黏膜佐劑，誘導(dǎo)分泌高水平的IgA。經(jīng)鼻腔免疫的抗原會(huì)被鼻等相關(guān)淋巴組織清除，使得蛋白樣抗原無法通過上皮組織這一障礙，而通過將錳鹽制備成果凍狀膠體搭載的抗原，既可刺激M細(xì)胞吸收，同時(shí)激發(fā)和提高免疫反應(yīng)。另外，通過肌肉注射MnJ的方式免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在免疫反應(yīng)后2～4周，IgG滴度明顯提高，并于12周達(dá)到峰值，之后雖略有下降，但特異性IgG滴度仍較高。同時(shí)，該研究使用VSV、HS、VACA、H1N1等多種滅活抗原，結(jié)果顯示，所有被試抗原（包括T細(xì)胞依賴性抗原和T細(xì)胞非依賴性抗原）均表現(xiàn)出良好的佐劑作用，是一種有前景的佐劑候選物。

Gao等［27］用納米錳包裹OVA滅活抗原，制備得到的G5-pBA/OVA@Mn納米佐劑，通過肌肉注射方式免疫小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組在免疫前期抗體滴度相較于鋁佐劑組就有明顯提升，而在后期，錳佐劑組抗體滴度持續(xù)上升，其最大值為鋁佐劑組的16.4倍。另外該研究測(cè)試了G5-pBA/OVA@Mn是否可以被遞送到淋巴結(jié)，注射不同疫苗制劑24 h后，切除淋巴結(jié)，流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他疫苗組相比，G5-pBA/OVA@Mn治療后，在淋巴結(jié)中檢測(cè)到OVA-FITC的MFI明顯更高，這突出了該納米疫苗在淋巴結(jié)運(yùn)輸方面的優(yōu)勢(shì)。然后，在注射佐劑后第7天檢測(cè)了OVA特異性T細(xì)胞在脾細(xì)胞中的反應(yīng)。理想的疫苗遞送系統(tǒng)將有效激活CD8+和CD4+ T細(xì)胞［37］。G5-pBA/OVA@Mn處理顯著提高了特異性CD8+ T細(xì)胞的比例，分別比其它組別高出10倍之余。他們還通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)特異性T細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng)。結(jié)果表明，在G5-pBA/OVA@Mn處理的小鼠中，IFN-γ的分泌水平顯著增強(qiáng)， 在G5-pBA/OVA@Mn處理后IgG2a和IgG1的比例顯著提高，表明錳納米疫苗引發(fā)了Th1型免疫應(yīng)答。

Zhou等［39］使用納米錳佐劑，通過皮下免疫小鼠。在第22、35天收集血清，然后通過ELISA法測(cè)定特異性IgG抗體滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第22天，納米MnP誘導(dǎo)的IgG滴度比鋁佐劑誘導(dǎo)的抗IgG滴度高出12倍之多。在第35天，納米MnP誘導(dǎo)的抗IgG滴度明礬誘導(dǎo)的高7.3倍，比不加佐劑誘導(dǎo)的高出53倍。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)明礬佐劑相比，納米MnP可以作為一種更有效的佐劑來誘導(dǎo)強(qiáng)效的體液免疫。另外，他們采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）法和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISpot）檢測(cè)免疫小鼠。檢測(cè)表明，納米MnP佐劑組誘導(dǎo)了強(qiáng)大的細(xì)胞因子分泌活性（IFN-γ），這樣的結(jié)果表明錳納米佐劑產(chǎn)生了Th1型T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，證明它在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面也具有潛力。因此，明礬佐劑難以引起T淋巴細(xì)胞激活的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用，納米錳佐劑剛好解決這一問題。這些結(jié)果表明，納米MnP有可能取代傳統(tǒng)的明礬佐劑作為增強(qiáng)免疫反應(yīng)的有效佐劑，特別是在增強(qiáng)細(xì)胞免疫方面。

6 問題與展望

納米材料具有靶向腫瘤組織、反應(yīng)性釋放藥物以及優(yōu)越的光學(xué)、磁性等特性等優(yōu)點(diǎn)［42-45］。盡管有關(guān)錳納米粒的研究很多，也從多方面對(duì)錳納米粒的佐劑作用機(jī)制進(jìn)行了全面分析，但錳納米粒在實(shí)際應(yīng)用的過程中受限。主要原因總結(jié)以下幾點(diǎn)：（1）不同pH條件下納米顆粒的懸浮狀態(tài)不同，易沉降，保存時(shí)間各不相同；（2）不同劑量的錳佐劑具有細(xì)胞毒性，在一定程度上會(huì)引起小鼠體內(nèi)組織的炎癥反應(yīng)［45-46］；（3）無法做到納米粒和抗原分開保存使用［47］。

總之，現(xiàn)有應(yīng)用的佐劑難以實(shí)現(xiàn)功能化的修飾，而錳納米材料作為疫苗載體具備良好的生物相容性和穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。因此，針對(duì)錳納米粒進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和功能化修飾，以提高抗原的吸附效率、免疫細(xì)胞的攝取，從而強(qiáng)化細(xì)胞免疫和體液免疫，探索其在疫苗佐劑領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為其生物制品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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（編輯 白永平）