堆肥對煙草黑脛病的防效及作用機(jī)理研究

摘要：為明確堆肥對煙草黑脛病的生防效果，進(jìn)而揭示其抑菌防病機(jī)理，以蘑菇渣、滸苔粉、玉米秸稈、凹凸棒和生物炭按照不同組合制備的4種堆肥為研究對象，采用菌絲生長速率法分析堆肥浸提液對煙草黑脛病菌的抑制效果，并進(jìn)一步通過掃描電鏡觀察菌體超微結(jié)構(gòu)；采用盆栽試驗(yàn)，考察4種堆肥對煙草黑脛病的防治效果，并從煙草植物防御酶活性、土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性的角度揭示防治機(jī)理。結(jié)果表明，4種堆肥浸提液原液對病原菌菌絲生長均有明顯的抑制作用，最高抑制率達(dá)85.54%，且電鏡結(jié)果顯示菌絲體受到嚴(yán)重破壞，而高溫滅菌液幾乎無抑制效果。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，堆肥處理顯著促進(jìn)了煙株的生長發(fā)育，最大葉長、最大葉寬和最大葉面積顯著增加；降低了煙草黑脛病的發(fā)生率和病情指數(shù)，其中堆肥A（蘑菇渣+滸苔粉+秸稈+凹凸棒）和AB（蘑菇渣+滸苔粉+秸稈+凹凸棒+生物炭）防效可達(dá)100%；改善了土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性，有效提高土壤pH值、速效磷含量、速效鉀含量，提升土壤脲酶和酸性磷酸酶活性。綜上所述，堆肥處理可通過抑制病原菌生長、改善土壤理化性質(zhì)和調(diào)節(jié)土壤酶活性，有效控制煙草黑脛病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：堆肥；煙草黑脛?。慌柙栽囼?yàn)；生物防治；作用機(jī)理

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0153-07

收稿日期：2023-09-01

基金項(xiàng)目：中國煙草總公司云南省公司重大項(xiàng)目（編號：2023530000241017）。

作者簡介：陳淑童（2001—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊『z疫與防治研究。E-mail：stchen0531@163.com。

通信作者：沈廣材，男，碩士，助理農(nóng)藝師，主要從事煙葉生產(chǎn)研究。E-mail：sgczdy910@163.com。

煙草黑脛病是由土傳卵菌寄生疫霉煙草致病變種（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的維管束病害［1］。該病在眾多煙區(qū)均有發(fā)生，不僅造成了嚴(yán)重的損失且防治難度較大。過去多年中，選育抗病品種、輪作和施用化學(xué)殺菌劑等已被廣泛證明其防治的有效性，然而，隨著現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)要求升級，這些措施的局限性逐漸顯現(xiàn)，亟待尋求一種更加環(huán)保、高效的防治策略［2］。

土壤有機(jī)改良可以在目前集約化的耕作制度下，通過有效影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)來提高土壤肥力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)防治病害和改良土壤的雙重功能［3］。作為土壤改良的主要策略之一，堆肥處理不僅可以綠色無害化處理有機(jī)廢棄物，還可以防控土傳病害，對于經(jīng)濟(jì)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義［4-5］。已有大量研究表明，堆肥及其浸提液可以抑制多種病原真菌和細(xì)菌，尤其對土傳病害具有顯著的防治效果［6-9］。未來農(nóng)業(yè)發(fā)展需要綜合的策略來幫助防御植物病害，因而堆肥及其浸提液的抗菌防病研究已發(fā)展為廢棄物資源化利用以及綠色生態(tài)植保等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

鑒于此，本研究以蘑菇渣、滸苔粉、玉米秸稈、凹凸棒和生物炭按照不同組合制備的4種堆肥為研究對象，通過體內(nèi)和體外2種試驗(yàn)方法揭示其對煙草黑脛病的生防效果，以期為堆肥在植物土傳病害防治方面的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試堆肥經(jīng)好氧堆制而成，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。堆肥各處理及成分包括：CK0：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈，A：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+凹凸棒，B：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+生物炭，AB：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+凹凸棒+生物炭。4種堆肥的主要理化性質(zhì)見表1。以不添加堆肥處理為對照（CK）。供試土壤為取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所即墨試驗(yàn)基地的大田土與育苗基質(zhì)（質(zhì)量比為7 ∶3）混合后的土壤，基本理化性質(zhì)為［10］：pH值 5.26，速效磷含量1.95 mg/kg，速效鉀含量308.44 mg/kg，銨態(tài)氮含量239.63 mg/kg，硝態(tài)氮含量114.03 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量107.79 g/kg。供試煙草品種為小黃金1025，供試菌株為煙草疫霉（P. nicotianae），均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。供試培養(yǎng)基為燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基，1 000 mL 反滲透（RO）水加30 g燕麥煮沸20～30 min，雙層紗布過濾得濾液，定容至 1 000 mL，加入18 g瓊脂粉，攪拌均勻后121 ℃高溫滅菌 20 min，轉(zhuǎn)移至65 ℃烘箱備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 堆肥浸提液體外抑菌試驗(yàn)

取4 g堆肥按 1 ∶5（質(zhì)量體積比）加入20 mL RO 水置于搖床于 28 ℃ 150 r/min 振蕩12 h后用200目篩絹過濾，得到的濾液即為原液，放置于4 ℃冰箱備用。為同時(shí)考慮堆肥中微生物的作用，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了滅菌處理液：將上述得到的原液取部分置于50 mL錐形瓶中，121 ℃ 滅菌20 min制得滅菌處理液。

抑菌試驗(yàn)采用菌絲生長速率法［11］。取預(yù)先制備好并在65 ℃烘箱中保存的OA培養(yǎng)基10 mL，精確吸取0.1 mL堆肥浸提液加到培養(yǎng)基中，輕輕搖晃混勻后倒入培養(yǎng)皿中。對照采用等量滅菌水代替堆肥浸提液。待培養(yǎng)基凝固后，將煙草黑脛病菌菌餅樣品接入OA板中心，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組菌絲長至4/5平板時(shí)，用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

菌落直徑=測量菌落直徑-0.5 cm；

菌絲生長相對抑制率=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑×100%。

1.2.2 盆栽試驗(yàn)

將堆肥按照2%比例（質(zhì)量比）與盆栽土混合后，再與菌谷混勻（3 g菌谷，160 g土壤）作為病土。選取生長一致的煙苗傷根處理后移栽至花盆中，每盆1株，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理12株煙苗，重復(fù)3次。

1.3 調(diào)查內(nèi)容與方法

1.3.1 掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)

為了直觀地了解體外抑菌試驗(yàn)中煙草黑脛病菌的受抑制方式，通過掃描電鏡做進(jìn)一步觀察。分別在對照組和原液組的菌落邊緣切取若干個(gè)體積為0.5 cm3的樣品，置于2.5%戊二醛溶液固定后，將樣品送至青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，對樣品進(jìn)行鍍膜處理，用于掃描電鏡觀察并獲取照片。

1.3.2 發(fā)病情況調(diào)查

移栽后，每隔1 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防效。煙草黑脛病分級標(biāo)準(zhǔn)見表2。

發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)調(diào)查總株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×該病級值）調(diào)查總株數(shù)×最高級值×100；

防效=對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)對照組病情指數(shù)×100%。

1.3.3 農(nóng)藝性狀調(diào)查

每個(gè)處理選取3株代表性煙株，根據(jù)YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》標(biāo)準(zhǔn)測定株高、葉片數(shù)、最大葉長、最大葉寬及最大葉面積。

1.3.4 植物防御酶活性及丙二醛含量測定

取相同部位的葉片，每個(gè)處理取3張，液氮快速冷凍后采用全自動樣品快速研磨儀將葉片磨成粉末，稱取0.1 g左右樣品置于2 mL離心管中，保存在-80 ℃冰箱中待測。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量均按照試劑盒上的方法測量，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3.5 土壤理化性質(zhì)和酶活性的測定

取盆栽土自然風(fēng)干后過40目篩，測定土壤理化性質(zhì)，包括pH值（雷磁PHS-3C pH 計(jì)）、有機(jī)質(zhì)含量（重鉻酸鉀容量法）、速效鉀含量（NH4OAc浸提-火焰光度計(jì)法）以及銨態(tài)氮、速效磷含量（SKALAR SAN++連續(xù)流動注射分析儀）；測定土壤酶活性，包括土壤酸性磷酸酶（S-ACP）和土壤脲酶（S-UE）。2種酶活性測定均采用試劑盒法，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans 新復(fù)極差法，α=0.05），并用Excel 2019進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同堆肥浸提液對煙草黑脛病病原菌的抑制作用

煙草黑脛病病原菌在含有不同處理液的培養(yǎng)基中生長狀況如圖1所示，堆肥浸提液對菌絲生長的抑制作用總結(jié)在表3中。不同堆肥浸提液均表現(xiàn)出了相同的抑制規(guī)律，即菌絲在原液中生長受到的抑制顯著強(qiáng)于高溫滅菌液；且不同堆肥原液的抑制效果存在差異，其中堆肥AB浸提液的抑制效果最好，抑制率達(dá)85.54%。結(jié)果表明，堆肥浸提液原液明顯抑制煙草黑脛病菌生長，浸提液經(jīng)過高溫滅菌處理后，其中含有的微生物被破壞殺死，導(dǎo)致浸提液失去抑制功能，而原液中的微生物可能通過競爭、寄生以及拮抗等作用對煙草黑脛病菌起到抑制效果。

2.2 掃描電鏡分析堆肥浸提液對煙草黑脛病病原菌的抑制方式

結(jié)果表明，對照組的菌絲體形態(tài)正常、健康飽滿、勻質(zhì)光滑，菌絲表面沒有明顯的破損、凹陷和干癟等現(xiàn)象（圖2-A）；在堆肥浸提液原液處理下菌絲體發(fā)生斷裂，菌絲萎縮、粗細(xì)不均，菌絲表面被細(xì)菌附著并發(fā)生明顯破損（圖2-B），且部分菌絲體扭曲變形、干癟凹陷成片狀，內(nèi)容物已經(jīng)基本泄漏（圖2-C）。

2.3 不同堆肥處理對盆栽煙草的防病促生效果

2.3.1 對煙草黑脛病的防控效果

由表4可以看出，與CK相比，施用堆肥降低了煙草黑脛病的發(fā)病率及病情指數(shù)，對煙草黑脛病具有一定程度的防控效果。堆肥A和AB這2個(gè)處理發(fā)病率均為0%，防效達(dá)100.00%；其他處理出現(xiàn)不同程度的發(fā)病，CK0處理發(fā)病率較低，為8.33%，較CK降低了85.72%，防效可達(dá)84.21%；B處理發(fā)病率較CK降低了28.56%，防效為19.30%。可見添加堆肥能有效減輕黑脛病的發(fā)生程度，但不同配方的堆肥對煙草黑脛病的控制效果存在一定程度的差異。

2.3.2 對盆栽煙草生長狀況的影響

由表5可知，不同堆肥處理與CK相比，株高和葉片數(shù)差異不顯著，但對葉片數(shù)的促進(jìn)作用要強(qiáng)于株高，效果較好的處理為CK0、A和AB，較CK分別提高了28.42%、53.58%和28.42%。堆肥處理后最大葉長、最大葉寬和最大葉面積較CK顯著增加，增幅分別為34.65%～57.35%、25.28%～51.66%和70.15%～138.91%。添加堆肥對煙株的農(nóng)藝性狀有明顯的改善作用；在各堆肥處理中，以CK0處理的煙株長勢最好，促生效果最為明顯。

2.4 不同堆肥處理對煙株葉片內(nèi)防御酶活性及丙二醛含量的影響

2.4.1 對SOD活性的影響

SOD被認(rèn)為是一種重要的自由基清除劑，它能夠維持機(jī)體的代謝平衡，并可在植物和病原體之間的識別過程中提供初始抗性信號［12-13］。圖3結(jié)果顯示，與CK相比，添加堆肥處理的煙株葉片內(nèi)SOD活性顯著降低，其中A處理降幅最大，為63.28%；其次為CK0處理和AB處理，分別下降60.57%和38.82%；在各堆肥處理中，B處理SOD活性最高，仍比CK下降24.33%。結(jié)合表3中發(fā)病率和病情指數(shù)數(shù)據(jù)，推測在CK和B處理中，煙草黑脛病病原菌侵染煙株后導(dǎo)致自由基積累，促使SOD表達(dá)用于清除自由基；而CK0、A和AB處理中SOD活性較低，可能由于堆肥很好地抵御了病原菌的入侵，減輕了病菌對煙株的傷害。

2.4.2 對POD活性的影響

POD在植物體內(nèi)廣泛存在，它能夠促進(jìn)木質(zhì)素、植物生長激素和酚類化合物的生成，使細(xì)胞壁增厚來抵御病原菌的入侵，是植物抗病有關(guān)的防御酶［13-14］。由圖3可知，CK受病原菌脅迫嚴(yán)重，POD活性顯著升高，達(dá) 2 994.37 U/g；添加堆肥處理的POD活性顯著降低，降幅為62.37%～78.22%，其中A處理POD活性最低，為652.28 U/g，其次為AB處理，POD活性為807.94 U/g，CK0、B處理POD活性分別為 1 126.64、1 045.93 U/g。結(jié)合表3，推測出現(xiàn)這類情況的原因與SOD相似，即堆肥通過對病原菌的抑制作用，抵御了病菌入侵煙株。

2.4.3 對MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的關(guān)鍵產(chǎn)物之一，其生成會加重膜的破壞，因此可利用MDA來反映膜脂過氧化的程度，并間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性［15］。MDA含量越高，說明植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度高，從而表明細(xì)胞膜受到的傷害越嚴(yán)重。圖3結(jié)果顯示，未添加堆肥處理的煙株葉片中MDA含量最高，達(dá) 5.81 nmol/g，說明CK葉片細(xì)胞膜受到的損傷最嚴(yán)重；添加堆肥處理的葉片中MDA含量均顯著低于CK，且A處理下MDA含量最低，為3.69 nmol/g，較CK下降了36.49%；CK0、B和AB處理MDA含量較CK分別下降了28.03%、21.94%和17.81%。說明添加堆肥顯著抑制了煙株體內(nèi)細(xì)胞膜脂過氧化過程，減少了細(xì)胞受到的傷害。綜合上述指標(biāo)，可知堆肥A的抗病效果最明顯。

2.5 不同堆肥處理對土壤理化性質(zhì)及酶活性的影響

2.5.1 對理化性質(zhì)的影響

從表6可以看出，堆肥處理對土壤理化性質(zhì)影響顯著。相比CK，堆肥處理土壤pH值和速效鉀含量分別增加6.25%～9.63%和33.93%～62.23%，且2個(gè)指標(biāo)均在AB處理下增幅最大。堆肥處理提升速效磷含量效果明顯，在CK0處理下可提高147.21%。各堆肥處理的有機(jī)質(zhì)含量與CK相比差異不顯著。這也表明堆肥處理下煙株農(nóng)藝性狀改善與土壤中磷、鉀等營養(yǎng)元素含量升高有關(guān)。

2.5.2 對酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷的酶類，是評價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向和強(qiáng)度的重要指標(biāo)［16］。由圖4可知，各堆肥處理S-ACP活性均高于CK，分別提高12.45%、2.06%、20.90%、1.11%，主要是由于施用堆肥后積累的大量磷反應(yīng)底物刺激土壤微生物分泌了較多的酸性磷酸酶［17］。土壤脲酶活性增強(qiáng)能有效促進(jìn)土壤中的有機(jī)氮向無機(jī)氮轉(zhuǎn)化［18］。與CK相比，S-UE 活性在CK0和A處理下分別提高20.78%和19.55%；B處理提高了13.00%。AB處理較CK沒有提高，可能是由于AB堆肥中本身含有大量的銨態(tài)氮，含量為829.98 mg/kg。

3 討論與結(jié)論

有研究表明，堆肥浸提液中的拮抗微生物通過競爭、寄生、分泌抗生素等方式對病原菌起抑制作用［7］。此外，浸提液中含有的酚類物質(zhì)、揮發(fā)性脂肪酸以及氨等化合物也具有直接毒性，能夠?qū)Σ≡a(chǎn)生不利影響［19］。本試驗(yàn)設(shè)置堆肥原液和高溫滅菌液2種處理，可以有效地區(qū)分是生物因素還是非生物因素起作用，以便更好地了解堆肥抑菌機(jī)理。Koné等的研究也表明，由多種商業(yè)堆肥制成的提取液能顯著抑制致病疫霉等多種病原菌的生長，經(jīng)高溫滅菌后則喪失了抑制效果，本研究結(jié)果與之一致，由此推斷堆肥浸提液中含有的微生物是抑制病原菌的先決條件［20］。結(jié)合掃描電鏡結(jié)果可知，堆肥浸提液中的微生物對煙草黑脛病病原菌的抑制作用具體表現(xiàn)為造成病原菌菌絲變形、斷裂，菌絲壁穿洞引起內(nèi)含物質(zhì)泄漏。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，施用堆肥能夠顯著促進(jìn)煙株的生長和發(fā)育，最大葉寬、最大葉長和最大葉面積等農(nóng)藝指標(biāo)均顯著增加，說明堆肥對煙株的發(fā)育具有很好的促生效果。任小利等關(guān)于堆肥對煙草、茄子、番茄等作物的促生增產(chǎn)效果研究也證實(shí)此結(jié)論：施用堆肥后，堆肥中本身含有的營養(yǎng)物質(zhì)提高了作物產(chǎn)量形成的能力，且堆肥施用后影響了根際土壤微生物區(qū)系，減少了病原菌數(shù)量，增加了功能菌數(shù)量，從而進(jìn)一步提高了肥料的利用效率［21-23］。施用堆肥可以有效地防控?zé)煵莺诿劜?，但不同堆肥的抑制效果存在差異，其中A和AB處理效果最好，CK0次之，B處理最差，可能是由于堆肥B處理中加入的生物炭對土壤微生物的生長產(chǎn)生了不利影響，比如在某些情況下會揮發(fā)苯等有毒物質(zhì)［24-25］。SOD、POD活性與植物抗病性有關(guān)，MDA含量反映細(xì)胞受損程度。本研究結(jié)果表明，施用堆肥后SOD和POD活性均顯著低于CK，說明施加堆肥顯著抑制了土壤中病原菌的生長繁殖，使病原菌無法成為優(yōu)勢菌，很難遷移到煙株根系完成侵染，煙株沒有受到病原菌損害，故防御酶活性較低；而CK處理的MDA含量最高恰好印證了這一解釋。堆肥的抑病機(jī)理不僅體現(xiàn)在為植物生長提供充足的養(yǎng)分和影響微生物群落的構(gòu)成，還體現(xiàn)在能夠有效地改善植物生長發(fā)育的環(huán)境條件和土壤的生態(tài)環(huán)境［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，堆肥中含有較高的氮、磷、鉀及其他營養(yǎng)元素，能夠明顯提高土壤養(yǎng)分含量，促進(jìn)煙株的生長，且提高了土壤的pH值，改善土壤酸化程度。施用堆肥后，土壤中酸性磷酸酶和脲酶活性提高，兩者均由參與養(yǎng)分循環(huán)的細(xì)菌分泌，說明施肥后促進(jìn)土壤細(xì)菌對肥料養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，張建華等的研究也證明了此觀點(diǎn)［8，27］。本研究有效探討了堆肥防控?zé)煵莺诿劜〉臋C(jī)制，但添加堆肥對根際土壤微生物多樣性和結(jié)構(gòu)的影響有待進(jìn)一步探索。

堆肥的施用對防控?zé)煵莺诿劜【哂辛己眯Ч?，其機(jī)理可以總結(jié)為以下幾點(diǎn)：堆肥中含有的微生物嚴(yán)重抑制了煙草黑脛病病原菌的生長，使其難以侵染煙株；堆肥的施用改善了土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)了煙株生長發(fā)育，提高了其抗逆境脅迫的能力；堆肥的施用提高了土壤酶活性，促進(jìn)了肥料轉(zhuǎn)化，有效提高了煙株的生長速率。在實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)考慮堆肥原料復(fù)雜性以及病原菌多樣性，從而對土傳病害的綠色防控更有針對性和預(yù)見性。

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