西藏牦牛源牛支原體T10株全基因組測(cè)序及其序列分析

摘 要： 旨在進(jìn)一步完善牛支原體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，闡明其生物學(xué)功能和遺傳進(jìn)化關(guān)系，對(duì)西藏牦牛源牛支原體T10株進(jìn)行了全基因組測(cè)序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)T10株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，利用生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行基因組特征分析和利用基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與國(guó)內(nèi)外分離株進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系比對(duì)?；驕y(cè)序結(jié)果顯示，T10株全基因組大小為987 812 bp，GC含量為29.27%，預(yù)測(cè)到822個(gè)編碼基因，編碼基因總長(zhǎng)度為709 129 bp；通過(guò)功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，注釋到與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因22個(gè)，碳水化合物酶相關(guān)基因7個(gè)、糖基轉(zhuǎn)移酶類相關(guān)基因4個(gè)，分泌蛋白基因相關(guān)43個(gè)、T3SS效應(yīng)蛋白相關(guān)基因51個(gè)，病原與宿主互作相關(guān)基因28個(gè)，細(xì)菌毒力相關(guān)基因14個(gè)，抗性相關(guān)基因10個(gè)；通過(guò)比較基因組學(xué)分析結(jié)果顯示，T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均存在氨基酸突變和基因片段的插入或缺失，以及基因家族數(shù)量的差異，其中基因家族數(shù)量差異在8～32個(gè)。通過(guò)遺傳進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示：T10與HB0801、16M、Hubei-1、CQ-W70、NM2012、Ningxia-1、08M、JF4278、KG4397和PG45均在同一分支，但與PG1、PG2處于不同分支，其中與HB0801親緣關(guān)系最近，與PG45親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究不僅完善了牛支原體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，詳細(xì)闡述了與致病性相關(guān)基因，還充分闡明了T10株以及與國(guó)內(nèi)外其他牛支原體之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，明確了T10株基本基因組信息以及與國(guó)內(nèi)外菌株親緣關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)行致病機(jī)制以及疫苗研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 牦牛；牛支原體；全基因組測(cè)序；基因功能注釋；比較基因組

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2154-14

收稿日期：2023-09-21

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（XZ202001ZY0046N）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系”項(xiàng)目（CARS-37）；西藏農(nóng)牧學(xué)院研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YJS2023-20）

作者簡(jiǎn)介：羅 婷（1999-），女，河北邢臺(tái)人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原及分子生物學(xué)的研究，E-mail： win2021shan@163.com

*通信作者：牛家強(qiáng)，主要從事動(dòng)物病原及分子生物學(xué)的研究，E-mail： lznjq@163.com

Whole Genome Sequencing and Sequence Analysis on T10 of Mycoplasma bovis Strain

from Yaks in Xizang

LUO" Ting， HAN" Zhu， XU" Yefen， CAI" Lin， SUOLANG" Sizhu， XU" Jinhua，

NIU" Jiaqiang*

（

Provincial Key Laboratory of Xizang Plateau Animal Epidemic Disease Research， College of

Animal Science， Xizang Agriculture and Animal Husbandry University，

Linzhi 860000，" China）

Abstract： This study aims to further improve the complete genome database of Mycoplasma bovis， elucidate its biological characteristics and genetic evolution relationship， the whole genome sequencing and sequence analysis of Mycoplasma bovis T10 strain derived from Xizang yaks were conducted. The entire genome of T10 strain was sequenced using the Nanopore and Illumina PE150 sequencing platforms， and the genomic characteristics were analyzed using bioinformatics. Genetic phylogenetic trees were used to compare genetic evolution relationships with domestic and foreign isolates. The gene sequencing results showed that the total genome size of T10 strain was 987 812 bp， with a GC content of 29.27%. It was predicted that 822 coding genes were present， with a total length of 709 129 bp; According to the annotation results of the functional database， 22 genes related to membrane transport proteins， 7 genes related to carbohydrate enzymes， 4 genes related to glycosyltransferases， 43 genes related to secretion proteins， 51 genes related to T3SS effector proteins， 28 genes related to pathogen host interaction， 14 genes related to bacterial virulence， and 10 genes related to resistance were annotated; Through comparative genomic analysis， it was found that T10 and 08M， CQ-W70， Hubei-1， Ningxia-1， and PG45 all exhibit amino acid mutations and gene fragment insertions or deletions， as well as differences in the number of gene families， with a difference in the number of gene families ranging from 8 to 32. The results of genetic evolution analysis show that T10 is in the same branch as HB0801， 16M， Hubei-1， CQ-W70， NM2012， Ningxia-1， 08M， JF4278， KG4397， and PG45， but in different branches from PG1 and PG2. Among them， T10 has the closest genetic relationship with HB0801 and the farther genetic relationship with PG45. This study not only improved the complete genome database of Mycoplasma bovis and elaborated on the genes related to pathogenicity， but also fully elucidated the genetic evolution relationship between T10 strain and other Mycoplasma bovis strains at home and abroad. It clarified the basic genome information of T10 strain and its genetic relationship with domestic and foreign strains， providing a theoretical basis for future research on pathogenic mechanism vaccines.

Key words： yak; Mycoplasma bovis; whole-genome sequencing; gene function annotation; comparative genomics

*Corresponding author：" NIU Jiaqiang， E-mail： lznjq@163.com

牛支原體（Mycoplasma bovis，M. bovis）是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的重要病原體之一，可通過(guò)呼吸道、生殖道、消化道、近距離接觸等途徑進(jìn)行傳播，引起犢牛肺炎、角膜結(jié)膜炎、中耳炎、關(guān)節(jié)炎、奶牛乳腺炎和生殖道炎等多種疾?。?］。牛支原體單純感染一般不表現(xiàn)臨床癥狀，但會(huì)降低牛的機(jī)體抵抗力，臨床中常與多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida， Pm）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica， Mh）、牛呼吸道合胞病毒（bovine respiratory syncytial virus， BRSV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhiontracheitis virus， IBRV）等病原體發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染［2］，可引發(fā)牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex， BRDC）。自1961年Hale［3］首次從美國(guó)患乳腺炎的病牛中分離出牛支原體以來(lái)，牛支原體病開(kāi)始在美洲及丹麥、荷蘭、瑞士等歐洲國(guó)家相繼出現(xiàn)［4-7］。直到2008年石磊［8］和辛九慶［9］對(duì)牛呼吸道疾病主要病原確診為牛支原體以來(lái)，該病相繼在重慶、寧夏、內(nèi)蒙、新疆等地均有發(fā)現(xiàn)［10-13］。

近年來(lái)，眾多學(xué)者對(duì)西藏牦牛感染牛支原體狀況進(jìn)行了一系列研究［14］，尤其在2017—2019年間，牛家強(qiáng)團(tuán)隊(duì)對(duì)我國(guó)牦牛主產(chǎn)區(qū)感染牛支原體情況進(jìn)行了較為系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，牛支原體感染較為普遍［15］，從陽(yáng)性牛群中成功分離到10株牛支原體（暫命名為西藏牦牛源牛支原體）［16］，對(duì)其進(jìn)行了培養(yǎng)特性和生長(zhǎng)特性的研究，發(fā)現(xiàn)分離株在添加10%馬血清的培養(yǎng)基更適合生長(zhǎng)，培養(yǎng)24～36 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期［17］。并對(duì)分離株進(jìn)行了藥物敏感性及其耐藥機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)分離株對(duì)氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素存在不同程度的耐藥，存在兩個(gè)及兩個(gè)以上基因位點(diǎn)的氨基酸同時(shí)發(fā)生突變，則會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)［18］。也進(jìn)行了雞胚、家兔和牦牛的致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了典型的臨床癥狀和病理變化［19-21］。通過(guò)小鼠免疫原性研究，發(fā)現(xiàn)分離株可引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答［19］。經(jīng)家兔肺臟組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組miRNA基因數(shù)量及功能均存在差異［20］。

作者開(kāi)展本研究旨在進(jìn)一步追溯其傳染來(lái)源，全面掌握T10株基因組基本特征，明確遺傳進(jìn)化關(guān)系，了解與國(guó)內(nèi)外其他牛支原體之間的遺傳多樣性，從而完善牛支原體基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為牛支原體病致病機(jī)制與疫苗研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本試驗(yàn)測(cè)序用菌株為本團(tuán)隊(duì)成員前期經(jīng)分離鑒定所獲得的牦牛源牛支原體T10株，-80℃保存。其他菌株08M（GenBank：CP019639.1）、16M（GenBank：CP038861.1）、CQ-W70（GenBank：CP005933.1）、Hubei-1（GenBank：CP002513.1）、HB0801（GenBank：CP002058.1）、NM2012（GenBank：CP011348.1）、Ningxia-1（GenBank：CP023663.1）、PG1（GenBank：BX293980.2）、PG2（GenBank：CU179680.1）、KG4397（GenBank：AP019558.1）、JF4278（GenBank：LT578453.1）和PG45（GenBank：CP002188.1）的基因組序列均來(lái)源于NCBI。

1.2 菌株基因組總DNA的提取

將T10株在液體培養(yǎng)基中［16］按1∶10的比例傳代培養(yǎng)3代，穩(wěn)定生長(zhǎng)后，再按照1∶100的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至500 mL。采用煮沸離心法提取牛支原體基因組總DNA，送至諾禾致源生物有限公司進(jìn)行牛支原體全基因組測(cè)序及其序列分析。

1.3 樣品合格性檢測(cè)

采用SDS或STE法對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行提取，再利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品進(jìn)行純度和完整性檢測(cè)，用Qubit進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.4 基因組的序列測(cè)定與分析

合格樣品進(jìn)行Nanopore和Illumina PE150測(cè)序，測(cè)序后原始數(shù)據(jù)按照以下步驟進(jìn)行分析：原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因組組裝，使用GeneMarkS［22］（Version4.17）、RepeatMasker［23］（Versionopen-4.0.5）、TRF［24］（Tandem Repeats Finder， Version 4.07b）、tRNAscan-SE［25］、rRNAmmer［26］、IslandPath-DIOMB［27］、phiSpy［28］軟件分別預(yù)測(cè)基因組的編碼基因、非編碼RNA、基因島、重復(fù)序列和前噬菌體，進(jìn)行基因組組分分析。使用GO（Gene Ontology）［29］、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）［30］、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）［31］數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因組功能進(jìn)行注釋，再使用TCDB（Transporter Classification Database）［32］、CAZY（Carbohydrate-Active enZYmes Database）［33］、PHI（Pathogen Host Interactions Database）［34］和VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）［35］數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因組中耐藥基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用CRISPR［36］digger（Version 1.0）軟件對(duì)T10基因組進(jìn)行基因圈圖制作，并進(jìn)行基因組可視化分析。

1.5 比較基因組學(xué)分析

采用MUM mer［37］（Version 3.22）和LASTZ［38］（Version 1.02.00）分別進(jìn)行SNP、Indel和SV注釋與統(tǒng)計(jì)。采用OrthoFinder［39］（Version 2.5.4b）軟件對(duì)樣本的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行基因家族聚類分析。采用Tree best（Version 1.9.2）（Neighbor-Joining， NJ）或PHYML（Maximum likelihood， ML）（Version v3.0）軟件構(gòu)建物種遺傳進(jìn)化樹(shù)，使用iTOL對(duì)構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化分析［40］。

2 結(jié) 果

2.1 T10株基因組基本特征分析

T10株基因組大小為987 812 bp，基因組GC含量為29.27%，預(yù)測(cè)到編碼基因有822個(gè)，串聯(lián)重復(fù)序列有114個(gè)，tRNA基因有34個(gè)，rRNA基因有6個(gè)，還預(yù)測(cè)到T10存在5個(gè)基因島和6個(gè)前噬菌體（表1），并且繪制了T10的基因組圈圖（圖1）。T10全基因組數(shù)據(jù)已上傳至NCBI，登錄號(hào)為CP062195.1。

2.2 基因功能注釋分析

2.2.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果

GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分為三大類，分別是細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程。在GO分析中，在細(xì)胞組分中，與細(xì)胞和細(xì)胞部件相關(guān)的基因最多，各有304個(gè)。在分子功能中，與催化活性有關(guān)的基因最多，共有532個(gè)；與結(jié)合相關(guān)的基因有438個(gè)。在生物過(guò)程中，與代謝過(guò)程相關(guān)的基因最多，有562個(gè)；與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的基因有546個(gè)（圖2A）。

2.2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果

在KEGG分析中，在細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝和生物體系統(tǒng)的26個(gè)通路中均得到基因注釋結(jié)果。其中在細(xì)胞功能中，與原核細(xì)胞群落相關(guān)基因有11個(gè)。在環(huán)境信息處理功能中預(yù)測(cè)到與膜傳輸通路相關(guān)基因數(shù)有23個(gè)。并且在遺傳信息處理功能中，與翻譯有關(guān)的基因數(shù)目最多，共有60個(gè)基因。還在人類疾病功能中，與癌癥相關(guān)基因數(shù)有9個(gè)。另外，在新陳代謝功能碳水化合物代謝通路相關(guān)的基因有33個(gè)；與核苷酸代謝通路相關(guān)的基因有29個(gè)；與復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因有27個(gè)；與能量代謝通路相關(guān)的基因有26個(gè)。除此之外，在生物體系統(tǒng)中，與內(nèi)分泌和老化系統(tǒng)相關(guān)基因有3個(gè)（圖2B）。

2.2.3 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果

在COG蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析中，與翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的基因最多，共有97個(gè)；與復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)的基因有30個(gè)；與碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)的基因有26個(gè)；與核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)的基因有21個(gè)（圖2C）。

2.3 特定基因功能注釋

2.3.1 TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果

在TCDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析中，共注釋到22個(gè)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，其中第一級(jí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果中初級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體基因有18個(gè)；通道/孔基因2個(gè)；群轉(zhuǎn)運(yùn)體及轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子相關(guān)基因各1個(gè)（圖3A）。

2.3.2 CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果

在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)分析中，共注釋到7個(gè)與碳水化合物酶相關(guān)的基因。其中有4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶類的基因，2個(gè)糖苷水解酶的基因和1個(gè)與碳水化合物結(jié)合組件相關(guān)的基因（圖3B）。

2.3.3 分泌蛋白及T3SS效應(yīng)蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果

在分泌蛋白分析中，共預(yù)測(cè)到具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的蛋白58個(gè)，具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白240個(gè)，綜合預(yù)測(cè)為分泌蛋白有43個(gè)。在822個(gè)編碼基因中，預(yù)測(cè)到T3SS效應(yīng)蛋白基因51個(gè)。

2.3.4 PHI數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

在PHI分析中，共注釋到28個(gè)病原與宿主互作相關(guān)的基因，其中存在20個(gè)導(dǎo)致病原體致病能力減弱的基因；2個(gè)抗藥基因；2個(gè)致死因子；2個(gè)對(duì)病原體致病性沒(méi)有影響的基因；1個(gè)藥物敏感基因；1個(gè)導(dǎo)致病原體致病能力喪失的基因（圖3C）。

2.3.5 VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

在VFDB分析中，預(yù)測(cè)T10存在EF-Tu、LOS、ClpE、MOMP、Lipoate protein ligase A1等14個(gè)潛在毒力基因。其中EF-Tu和LOS基因與黏附功能有關(guān)。

2.3.6 CARD數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

在CARD分析中，注釋到gyrB、macB、bcrA、sav1866、tetB、tetA、lmrC、lmrD、efrA和efrB10個(gè)抗性基因。

2.4 比較基因組分析

2.4.1 牛支原體的基本特征比較分析

本研究將T10與GenBank公布的7個(gè)牛支原體菌株進(jìn)行了基本特征信息比較，T10基本特征與國(guó)際參考株P(guān)G45相似，在rRNA數(shù)量中與CQ-W70和Hubei-1存在差異（表2）。

2.4.2 SNP注釋與統(tǒng)計(jì)

通過(guò)SNP注釋與統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均存在SNP變異。T10與08M相比，基因區(qū)內(nèi)非同義突變有49個(gè)SNP位點(diǎn)；與CQ-W70相比，在基因區(qū)內(nèi)非同義突變有62個(gè)SNP位點(diǎn)；與Hubei-1相比，在基因區(qū)內(nèi)非同義突變有55個(gè)SNP位點(diǎn)；與Ningxia-1相比，在基因區(qū)內(nèi)非同義突變有70個(gè)SNP位點(diǎn)；與PG45相比，在基因區(qū)內(nèi)非同義突變有3 090個(gè)SNP位點(diǎn)，分別導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸發(fā)生改變（表3）。

2.4.3 InDel注釋與統(tǒng)計(jì)

InDel是指基因組中小片段的插入和缺失序列。通過(guò)InDel注釋與統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1均存在位于CDS中間的插入或缺失，其中Hubei-1的插入缺失數(shù)量較多。還與PG45在位于CDS中間的插入或缺失存在21個(gè)插入或缺失序列，并且還在位于終止密碼子的插入和起始密碼子的缺失各1個(gè)序列（表4）。

2.4.4 SV（Structural Variation）注釋與統(tǒng)計(jì)

結(jié)構(gòu)性變異（Structural Variation，SV）指基因組水平上大片段的插入、缺失、倒置、易位等序列。T10與08M、Hubei-1在結(jié)構(gòu)上存在大片段的插入/缺失區(qū)域；與CQ-W70、Ningxia-1存在大片段的插入/缺失和易位兼倒置區(qū)域；與PG45存在大片段的插入/缺失，還存在易位、倒置和易位兼倒置區(qū)域（圖4）。

2.4.5 基因家族分析

通過(guò)基因家族分析，發(fā)現(xiàn)T10有822個(gè)編碼基因，有757個(gè)基因家族，有812個(gè)基因家族中的基因。T10存在10個(gè)未參與聚類的基因，并且T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45中均存在未參與聚類的家族基因，但PG45在未被聚類到任何家族的基因方面的數(shù)目最多。除此之外，未發(fā)現(xiàn)T10存在特有基因家族，而Hubei-1存在1個(gè)特有基因家族，3個(gè)特有基因家族中含有的基因（表5）。

2.4.6 遺傳進(jìn)化分析

遺傳進(jìn)化樹(shù)是具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹(shù)。T10的基因組序列與HB0801、16M、Hubei-1、CQ-W70、NM2012、Ningxia-1、08M、JF4278、KG4397和PG45均處于同一分支上，且與HB0801親緣關(guān)系最近，與PG1和PG2處于不同的分支（圖5）。

3 討 論

本研究對(duì)T10株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定，對(duì)該基因組的基本特征進(jìn)行了分析，并與國(guó)內(nèi)外菌株進(jìn)行了比較基因組分析。發(fā)現(xiàn)T10基因組由987 812 bp的堿基組成，其中GC%含量為29.27%，T10基因組大小比PG45［41］減少了15 592 bp，與NM2012［42］最相似；GC%含量比PG45減少了0.04%，與08M［43］的GC%含量一致。預(yù)測(cè)到T10株存在非編碼RNA包括34個(gè)tRNA，6個(gè)rRNA，其中包括5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA各2個(gè)，與PG45預(yù)測(cè)結(jié)果一致；基因島與病原機(jī)理、生物體的適應(yīng)性等多種生物功能相關(guān)，T10預(yù)測(cè)到5個(gè)基因島；前噬菌體能增強(qiáng)菌體的黏附性，協(xié)助菌體逃避宿主的防御，與菌體毒力有關(guān)，T10預(yù)測(cè)到6個(gè)前噬菌體。

牛支原體常寄生在牛體內(nèi)，它需要通過(guò)影響牛的代謝過(guò)程和翻譯來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)、維持自身生存和實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。在基因功能注釋分析中，T10主要在代謝過(guò)程和翻譯相關(guān)基因的富集程度最高。因此，牛支原體主要通過(guò)代謝、翻譯相關(guān)途徑來(lái)滿足其生存需求。研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶可以介導(dǎo)甘油糖脂的合成，而甘油糖脂是支原體膜的結(jié)構(gòu)成分，對(duì)膜的性質(zhì)和穩(wěn)定性起著重要作用［44］。糖苷水解酶可以水解各種含糖化合物中的糖苷鍵，在生物體的糖基化方面發(fā)揮重要作用。在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，T10注釋到4個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶類基因，2個(gè)糖苷水解酶基因。因此糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶對(duì)牛支原體的代謝活動(dòng)有重要作用。

牛支原體是一種導(dǎo)致牛呼吸系統(tǒng)感染的病原體，它感染時(shí)會(huì)通過(guò)多種不同的基因來(lái)改變宿主細(xì)胞的功能，以利于自身的生存和繁殖［45］。本研究通過(guò)PHI分析，預(yù)測(cè)T10具有GAPDH、secA、lplA1、pdhB、glyA、FbaA等20個(gè)導(dǎo)致致病機(jī)制減弱的基因，2個(gè)GyrA抗藥基因和導(dǎo)致病原體致病能力喪失的nifS基因。有研究表明甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）除了在糖酵解中的作用外，還與病原體的毒力有關(guān)，并且由于其細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是定殖在致病性和非致病性正常菌群的組織黏附素［46］。Perez-Casal等［47］分離了牛支原體編碼GAPDH的gap基因，并表明用牛支原體定殖的牛能夠?qū)APDH產(chǎn)生免疫反應(yīng)，為后續(xù)開(kāi)發(fā)有效的牛支原體疫苗提供方向。GyrA基因表達(dá)DNA促旋酶A亞基，在DNA復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，本團(tuán)隊(duì)在研究氟喹諾酮類抗生素耐藥機(jī)制中，將GyrA作為該類藥物的靶位基因進(jìn)行檢測(cè)［18］。nifS是一種磷酸吡哆醛結(jié)合酶，催化L-半胱氨酸脫硫產(chǎn)生L-丙氨酸和硫［48］，nifS已被證實(shí)參與幽門螺桿菌的重要毒力特征的調(diào)節(jié)，其失活對(duì)幽門螺桿菌的生長(zhǎng)具有重要影響［49］。但還未在牛支原體中得到證實(shí)，因此后續(xù)可以對(duì)該基因進(jìn)行驗(yàn)證是否會(huì)導(dǎo)致病原體致病能力喪失。通過(guò)VFDB分析，預(yù)測(cè)T10存在EF-Tu、LOS、ClpE、MOMP、Lipoate protein ligase A1等14個(gè)潛在毒力基因，其中EF-Tu是具有黏附因子的特征，并誘導(dǎo)促炎［50］；LOS基因參與免疫系統(tǒng)逃避，附著于上皮組織，是促炎反應(yīng)的重要介質(zhì)［51］。在HB0801中預(yù)測(cè)到一個(gè)潛在毒力基因，即VSP Y1。T10株與HB0801［52］株相比，其潛在毒力因子種類和數(shù)量不同，但是具體對(duì)動(dòng)物的致病性還需要通過(guò)臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。在CARD分析中，注釋到gyrB、macB、tetB、tetA、lmrC、lmrD等10個(gè)抗性基因，其中tetB、tetA基因?qū)λ沫h(huán)素具有抗性；MacB基因?qū)Υ蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素具有抗性；GyrB基因?qū)ΨZ酮類抗生素具有抗性；lmrC、lmrD基因?qū)α挚擅顾鼐哂锌剐?。前期本團(tuán)隊(duì)已對(duì)氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行藥物敏感性驗(yàn)證，藥物敏感性結(jié)果顯示T10對(duì)這兩類藥物均存在耐藥。可能與臨床不規(guī)范使用抗生素有關(guān)，也可能是其他菌株耐藥基因的平行轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的，因此這對(duì)該菌株以后的臨床治療具有指導(dǎo)意義。

為了探究T10的來(lái)源，選取了國(guó)內(nèi)4個(gè)不同地區(qū)的菌株分別為08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和國(guó)際參考株P(guān)G45進(jìn)行了比較基因組分析?；蚪M可塑性是通過(guò)三種水平基因轉(zhuǎn)移過(guò)程產(chǎn)生的，主要是通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合三種方式進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）和InDel的變異是影響基因功能和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。SNP是在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換等。學(xué)者Qi等［52］對(duì)HB0801和Hubei-1的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共存在122個(gè)SNP位點(diǎn)。在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)注釋發(fā)現(xiàn)，T10株與Hubei-1［53］在基因區(qū)發(fā)生的單個(gè)核苷酸的變異有66個(gè)位點(diǎn)，與PG45［41］在基因區(qū)發(fā)生的單個(gè)核苷酸的變異數(shù)量最多；與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45相比，在基因區(qū)內(nèi)發(fā)生非同義突變各有49、62、55、70和3 090個(gè)SNP位點(diǎn)。發(fā)生非同義突變會(huì)引起蛋白質(zhì)的形態(tài)、功能和酶催化活性發(fā)生改變。InDel是基因組中小片段的插入和缺失序列。預(yù)測(cè)到T10株與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均在位于CDS中間的插入或缺失序列。另外，還與PG45存在位于終止密碼子的插入和起始密碼子的缺失序列。這些基因組中小片段插入或缺失會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，對(duì)后續(xù)研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能具有重要意義?；蚣易迨呛饬考易鍍?nèi)具有相似的結(jié)構(gòu)和功能的一組基因。T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45在所有基因家族個(gè)數(shù)比較相近，與Hubei-1的基因家族個(gè)數(shù)最為接近，由此可見(jiàn)，T10與Hubei-1具有共同來(lái)源，另外T10還發(fā)現(xiàn)存在10個(gè)未被聚類到的基因，其中5個(gè)基因未被注釋到，其他5個(gè)基因分別與假定蛋白、脂蛋白、鋅依賴性醇脫氫酶等功能有關(guān)。脂蛋白是牛支原體膜上一種能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，使得免疫細(xì)胞凋亡或者死亡的蛋白質(zhì)［54］。由此可見(jiàn)，脂蛋白與其感染性有關(guān)。鋅依賴性醇脫氫酶（Zinc-dependent alcohol dehydrogenase）是生物體內(nèi)參與氧化還原的催化劑，存在兩個(gè)形狀不同的活性位點(diǎn)，其決定了酶的底物范圍和選擇性，但未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道該酶與感染性相關(guān)，若需了解其感染性可后續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證［55］。通過(guò)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)T10與08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均在同一分支且親緣關(guān)系很近，這些探究為追溯T10株來(lái)源提供研究方向。

4 結(jié) 論

本研究分析了牛支原體T10株的完整基因組信息，并與國(guó)內(nèi)外其他牛支原體進(jìn)行了比較，從而進(jìn)一步完善了牛支原體的基因數(shù)據(jù)庫(kù)。闡明了T10株的生物學(xué)特性與遺傳進(jìn)化關(guān)系，其中，對(duì)T10株的致病性和耐藥性進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，為今后開(kāi)展牛支原體病的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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（編輯 "白永平）