線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因變異影響綿羊顆粒細(xì)胞凋亡生理機(jī)制研究

摘 要： 本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊線粒體tRNA-Lys基因（T7719G）變異與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，并降低了顆粒細(xì)胞凋亡率，為此，開展了該變異影響顆粒細(xì)胞凋亡生理機(jī)制的研究。本研究選取G、T基因型綿羊各3只，屠宰后取卵巢組織培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞生理指標(biāo)檢測試驗分為兩組，每組3個重復(fù)，分別檢測線粒體基因組拷貝數(shù)，線粒體呼吸酶復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅱ、復(fù)合物Ⅲ、復(fù)合物Ⅳ、復(fù)合物Ⅴ活性，線粒體耗氧量和胞外產(chǎn)酸能力、ROS產(chǎn)量、ATP水平和膜電位，以及tRNA-Lys總量和氨酰化水平，13個mtDNA編碼多肽蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，G基因型顆粒細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)與T基因型差異極顯著（Plt;0.01），為T基因型的1.78倍。G基因型細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅲ活性是T型細(xì)胞的1.25倍（Plt;0.05），表明G基因型細(xì)胞氧化呼吸功能增強(qiáng)。G基因型顆粒細(xì)胞線粒體耗氧量、ATP偶聯(lián)耗氧量比T基因型細(xì)胞分別提高了6.84%（Plt;0.05）和15.46%（Plt;0.01），G基因型細(xì)胞糖酵解能力顯著降低（Plt;0.01），活性氧含量水平顯著降低了34%，ATP含量明顯上升，為T基因型的1.25倍（Plt;0.05），線粒體膜電位顯著上升，為T基因型的1.24倍（Plt;0.01）；G基因型細(xì)胞tRNA-Lys總量顯著提高50%（Plt;0.01），氨酰化tRNA-Lys比例較T型細(xì)胞提高33.4%（Plt;0.01）。線粒體基因組編碼的13個多肽（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、CtyB、COⅠ、COⅡ、COⅢ、ATP6、ATP8）表達(dá)水平均顯著提高（Plt;0.05）。初步解析了線粒體tRNA-Lys（T7719G）變異影響綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的生理機(jī)制，即tRNA-Lys（T7719G）變異影響tRNA-Lys穩(wěn)態(tài)和氨酰化水平，影響mtDNA 編碼的多肽翻譯效率，同時引起拷貝數(shù)、ATP水平、ROS含量和部分酶活性變化，進(jìn)而改變線粒體能量代謝功能和細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞： 線粒體；tRNA-Lys基因；顆粒細(xì)胞；生理功能

中圖分類號：S826.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2011-11

收稿日期：2023-11-24

基金項目：河北省自然科學(xué)基金項目（C2020204001）

作者簡介：呂世琪（1997-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士生，主要從事綿羊遺傳育種研究，E-mail：157542096@qq.com

*通信作者：陳曉勇，主要從事綿羊遺傳育種與繁殖領(lǐng)域研究，E-mail： chenxiaoyong-2000@163.com

Study on the Physiological Mechanism of Mitochondrial tRNA-Lys（T7719G）

Gene Variation Affecting Apoptosis of Ovine Granulosa Cell

L Shiqi， ZHOU" Rongyan， TIAN" Shujun， CHEN" Xiaoyong*

（College of Animal Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071000，" China）

Abstract：" The previous studies have found that mitochondrial tRNA-Lys（T7719G） variation was associated with litter size， which decreased the apoptosis of granulosa cells in Small-tailed Han sheep. Therefore， the physiological mechanism of mitochondrial tRNA-Lys（T7719G） variation on granulosus cell apoptosis was explored. Three sheep were selected with G and T genotypes respectively， and slaughtered for ovarian tissue culture of granulosa cells. The detection experiment of granule cells physiological function were divided into two groups with 3 replicates in each group. Mitochondrial genome copy number， mitochondrial respiratory enzyme complex Ⅰ， complex Ⅱ， complex Ⅲ， complex Ⅳ and complex Ⅴ activities were detected， respectively. Mitochondrial oxygen consumption and extracellular acid production capacity， ROS production， ATP level and membrane potential， as well as total tRNA-Lys and aminoacylation level， expression level of 13 mtDNA-encoded polypeptide proteins were detected.

The results showed that the mitochondrial copy number of G genotype granulosa cells was significantly different from that of T genotype （Plt;0.01）， which was 1.78 times that of T genotype. The activity of mitochondrial complex III in G genotype cells was 1.25 times higher than that in T type cells （Plt;0.05）， indicating that the oxidative respiratory function of G genotype cells was enhanced. The mitochondrial oxygen consumption and ATP-coupled oxygen consumption of G genotype granulosa cells were 6.84% （Plt;0.05） and 15.46% （Plt;0.01） higher than those of T genotype cells， respectively. The glycolysis ability of G genotype cells was significantly decreased （Plt;0.01）， the level of reactive oxygen species was significantly decreased by 34%， the ATP content was significantly increased， which was 1.25 times that of T genotype （Plt;0.05）， and the mitochondrial membrane potential was significantly increased， which was 1.24 times that of T genotype （Plt;0.01）.

Total tRNA-Lys was significantly increased by 50% （Plt;0.01） in G genotype cells， and the proportion of amylated tRNA-Lys was increased by 33.4% （Plt;0.01） compared to T genotype cells. The expression levels of all 13 polypeptides encoded by the mitochondrial genome （ND1， ND2， ND3， ND4， ND4L， ND5， ND6， CtyB， COⅠ， COⅡ， COⅢ， ATP6， ATP8） were significantly increased （Plt;0.05）. The physiological mechanism of mitochondrial tRNA-Lys（T7719G） variation affecting ovine granulosa cell apoptosis was initially analyzed， that is， tRNA-Lys（T7719G） variation affected tRNA-Lys homeostasis and aminoacylation level， affected the translation efficiency of mtDNA-encoded peptides， and caused changes in copy number， ATP level， ROS content， and some enzyme activities， and then the energy metabolism function of mitochondria and apoptosis were changed.

Key words： mitochondrion; tRNA-Lys gene; granulosa cells; physiological functions

*Corresponding author：CHEN Xiaoyong， E-mail： chenxiaoyong-2000@163.com

長期以來綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀主要集中在細(xì)胞核染色體基因遺傳效應(yīng)領(lǐng)域，細(xì)胞核外的線粒體基因遺傳效應(yīng)研究則較少。研究報道豬產(chǎn)仔數(shù)不僅與卵母細(xì)胞數(shù)量高度相關(guān)，而且與線粒體DNA多態(tài)性［1］及線粒體tRNA-Lys變異顯著相關(guān)［2］。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊線粒體tRNA-Lys基因（T7719G）變異與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)（Plt;0.05）［3］。顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成成分，可分泌多種卵泡發(fā)育的所需因子調(diào)控卵母細(xì)胞的生長、分化和成熟［4-6］，其生理功能直接影響卵泡的發(fā)育和閉鎖。綿羊一生中大約有106個卵泡，而大部分的卵泡會在體內(nèi)發(fā)生閉鎖，喪失排卵和激素釋放的功能［7］，引起卵泡閉鎖的主要原因是顆粒細(xì)胞的凋亡［8］。可見，線粒體tRNA-Lys基因（T7719G）變異可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)。

線粒體是細(xì)胞核外具有自身DNA（mtDNA）的細(xì)胞器，mtDNA編碼的多肽是氧化磷酸化復(fù)合酶I、II、IV的組成成分，因此，mtDNA對于細(xì)胞呼吸和能量產(chǎn)生非常重要［9-10］。研究報道m(xù)t-tRNA突變會影響二級結(jié)構(gòu)、穩(wěn)態(tài)水平［11］，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體蛋白合成及呼吸鏈缺陷，同時引起mt-tRNA分子成熟不正常、降低與同源氨基酸結(jié)合及識別相應(yīng)密碼子的能力［12-13］。很多研究報道m(xù)t-tRNA突變不僅導(dǎo)致自身穩(wěn)態(tài)和氨?；浇档?，同時引發(fā)線粒體疾病。如線粒體肌病腦病伴乳酸中毒及中風(fēng)樣發(fā)作疾病雜交細(xì)胞中mt-tRNALeu（UUR）和氨?；饔镁档?0%以上［14-15］。研究表明人線粒體tRNA突變導(dǎo)致氧氣消耗速率降低、呼吸復(fù)合物酶活性和ATP水平降低、膜電位改變、活性氧（ROS）水平升高，導(dǎo)致線粒體功能缺陷［16-17］，同時引起細(xì)胞凋亡［18］。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體tRNA-Lys（T7719G）變異影響綿羊顆粒細(xì)胞凋亡，其生理機(jī)制尚不清楚。為此，本研究開展線粒體tRNA-Lys（T7719G）基因變異對綿羊顆粒細(xì)胞生理功能及其分子機(jī)制的影響研究，為線粒體基因變異與細(xì)胞生理功能關(guān)系研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

卵巢來源于河北省保定市瑞麗屠宰場。屠宰后取卵巢組織用溫生理鹽水沖洗并用75%酒精噴灑消毒后，放于含有1%雙抗和37 ℃生理鹽水的保溫壺中，在4 h內(nèi)送至實驗室進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)綿羊線粒體基因組序列（GenBank：AF010406），設(shè)計擴(kuò)增含有tRNA-Lys（T7719G）位點序列的引物，引物序列：

上游引物：5′-CTACGGTCAATGCTCAGAA-3′；下游引物：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′。該引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 組織采集與DNA提取

按照組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）說明書進(jìn)行DNA提取，通過紫外分光光度計測定DNA樣品在260 nm、280 nm處的OD值，計算DNA含量和OD260 nm/OD280 nm的比值，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.4 PCR測序檢測變異

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中電泳電壓為100 V，電流為100 mA，時間為30 min。利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，分析鑒定基因型。測序結(jié)果通過DNAMAN軟件對其數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，運用Oligo 7 Primer Analysis Software將試驗綿羊序列與綿羊線粒體基因組標(biāo)準(zhǔn)序列（GenBank：AF010406）進(jìn)行比對分析。

1.5 顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)

選取G、T基因型母羊各3只，采集雙側(cè)卵巢并使用生理鹽水、75%酒精清洗，切割適當(dāng)大小卵泡并在超凈臺中收集卵泡液，加入10%胎牛血清、1%雙抗和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，將不同基因型每只母羊雙側(cè)卵巢顆粒細(xì)胞在 37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況并進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.6 細(xì)胞檢測

1.6.1 線粒體tRNA穩(wěn)態(tài)及氨?；綑z測

使用AngleGene公司線粒體分離試劑盒進(jìn)行線粒體分離，TRIzol Plus RNA 純化試劑盒進(jìn)行RNA提取。使用的地高辛標(biāo)記的線粒體tRNA-Lys以及核基因編碼的線粒體5S RNA 寡核苷酸探針相關(guān)信息如表1所示。參考文獻(xiàn)［19］進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和雜交試驗。

1.6.2 顆粒細(xì)胞ATP水平檢測

使用發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）測定細(xì)胞的ATP產(chǎn)生水平，檢測其熒光信號，記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.6.3 線粒體膜電位測定

應(yīng)用JC-10熒光染料（Abcam）并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位水平。按照J(rèn)C-10檢測試劑盒說明操作，上鏡檢測，紅綠熒光強(qiáng)度比代表線粒體膜電位水平。

1.6.4 線粒體耗氧量（OCR）和胞外產(chǎn)酸能力（ECAR）測定

將不同基因型的顆粒細(xì)胞分別以每孔約1.8×104個鋪板到細(xì)胞培養(yǎng)微孔板中，于室溫1 h后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入1.5 μmol·L-1寡霉素、0.5 μmol·L-1羰基-氰-對-三氟甲氧基本腙、復(fù)合體Ⅰ抑制劑魚藤酮（0.5 μmol·L-1）和復(fù)合體Ⅲ抑制劑抗霉素A（0.5 μmol·L-1），通過CyQuANT Cell Proliferation Assay Kit檢測孔中的細(xì)胞數(shù)。通過計算得到不同基因型顆粒細(xì)胞的基礎(chǔ)OCR、ATP偶聯(lián)OCR、質(zhì)子漏OCR、最大OCR、緩沖OCR、非線粒體OCR的6個參數(shù)。通過檢測培養(yǎng)基pH變化從而反映顆粒細(xì)胞ECAR，分別加入葡萄糖、寡霉素和2-脫氧葡萄糖，通過CyQuANT Cell Proliferation Assay Kit檢測孔中的細(xì)胞數(shù)，得到細(xì)胞的基礎(chǔ)糖酵解能力、細(xì)胞的最大糖酵解能力、非糖酵解產(chǎn)酸值。

1.6.5 呼吸復(fù)合物酶活性檢測

采用GENMED試劑盒檢測動物線粒體呼吸酶復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅱ、復(fù)合物Ⅲ、復(fù)合物Ⅳ、復(fù)合物Ⅴ活性。使用酶標(biāo)儀讀取光吸收值。

1.6.6 細(xì)胞活性氧（ROS）含量檢測

取出培養(yǎng)好的顆粒細(xì)胞，PBS清洗2～3次重懸細(xì)胞，加入1 mL含有100μmol·L-1 DCFH-DA的PBS，室溫培養(yǎng)20 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照。

1.6.7 qRT-PCR測定線粒體基因組拷貝數(shù)

根據(jù)綿羊線粒體基因組序列（GenBank：AF010406.1），采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設(shè)計覆蓋綿羊線粒體基因組序列引物，引物序列如表2所示，qRT-PCR反應(yīng)體系：SDW 8.0 μL，Power SYBR Green Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA1.0 μL；反應(yīng)程序：95℃1min；95℃15s，63℃ 25s，55℃ 15s，95℃ 15s。根據(jù)mtDNA特異引物用于定量顆粒細(xì)胞的mtDNA含量，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因作為內(nèi)參基因，各個基因的相對表達(dá)水平以2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過計算線粒體DNA與核DNA的豐度比值（mtDNA/nDNA）來反映樣品的mtDNA拷貝數(shù)。

1.6.8 Western blot檢測編碼蛋白表達(dá)水平

使用線粒體分離試劑盒進(jìn)行線粒體分離，參考BCA蛋白定量試劑盒中實驗說明書，對所制取的13個蛋白（ND1、ND2、ND4、ND5、DN6、ND4L、COI、COII、COIII、Ctyb、ATP6、ATP8、COX IV）。參考文獻(xiàn)［19］的Western blot方法檢測顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體編碼相關(guān)蛋白表達(dá)水平。其中一抗為山羊抗鼠、二抗為山羊抗兔。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果均為重復(fù)3次的數(shù)據(jù)，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，對均值進(jìn)行差異性比較，*Plt;0.05為差異顯著，**Plt;0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體基因組拷貝數(shù)

為明確不同基因型顆粒細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)，采用熒光定量PCR檢測每株細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)。如圖1所示，G基因型顆粒細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)與T基因型差異極顯著（Plt;0.01），為T基因型細(xì)胞的1.78倍。

2.2 線粒體呼吸復(fù)合物酶活性

提取顆粒細(xì)胞中線粒體蛋白，檢測其中線粒體呼吸酶復(fù)合物Ⅰ、復(fù)合物Ⅱ、復(fù)合物Ⅲ、復(fù)合物Ⅳ、復(fù)合物Ⅴ的表達(dá)水平。結(jié)果表明G基因型細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅲ活性是T型細(xì)胞的1.25倍（Plt;0.05），兩組間差異顯著，T基因型細(xì)胞與G型細(xì)胞復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性均無顯著差異（圖2），表明G基因型細(xì)胞氧化呼吸功能增強(qiáng)。

2.3 線粒體耗氧量（OCR）和胞外產(chǎn)酸能力（ECAR）產(chǎn)量

檢測G、T兩種基因型顆粒細(xì)胞分析氧耗速率的差異，如圖3所示，攜帶G基因型顆粒細(xì)胞與T基因型相比基礎(chǔ)OCR、ATP偶聯(lián)OCR分別提高了6.84%（Plt;0.05）和15.46%（Plt;0.01），而最大OCR、緩沖OCR分別降低了14.75%（Plt;0.01）、32.82%（Plt;0.01），質(zhì)子漏OCR和非線粒體OCR并沒有顯著差異（Pgt;0.05）。

胞外酸化速率可以反映糖酵解水平。對不同基因型分組處理的細(xì)胞加入葡萄糖、寡霉素和2-DG，檢測基礎(chǔ)糖酵解能力、最大糖酵解能力和糖酵解潛力部分。結(jié)果表明，G基因型糖酵解能力顯著降低（Plt;0.01）（圖4），起到保護(hù)線粒體的作用。

2.4 線粒體活性氧（ROS）產(chǎn)量

氧化呼吸鏈復(fù)合體亞基下調(diào)會抑制線粒體氧化呼吸鏈并發(fā)生障礙，從而會增加ROS的產(chǎn)生，因此檢測G、T兩種基因型顆粒細(xì)胞ROS的生成。結(jié)果表明，G基因型細(xì)胞ROS水平較T基因型細(xì)胞顯著降低，平均降低了34%（圖5），表現(xiàn)出更好的抗氧化作用。

2.5 線粒體ATP水平

為檢測不同基因型氧化磷酸化能力，采用熒光素/熒光素酶測定法檢測ATP產(chǎn)量。如圖6所示，G基因型組ATP含量明顯上升，為T基因型的1.25倍（Plt;0.05）。

2.6 線粒體膜電位

線粒體膜電位的改變往往是細(xì)胞凋亡的征兆。過量產(chǎn)生的ROS和線粒體膜電位的下降觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JC-10染色后檢測細(xì)胞熒光值，觀察G、T兩種基因型線粒體膜電位的變化。結(jié)果表明，G基因型細(xì)胞線粒體膜電位為T基因型的1.24倍（Plt;0.01，圖7）。

2.7 線粒體tRNA-Lys生理狀態(tài)

為確定T7719G變異是否對線粒體tRNA-Lys的代謝產(chǎn)生影響，提取G、T兩種基因型的線粒體tRNA，與地高辛標(biāo)記的線粒體tRNA-Lys以及核基因編碼的線粒體5S RNA 寡核苷酸探針進(jìn)行Northern雜交。比較不同基因型顆粒細(xì)胞tRNA-Lys的穩(wěn)態(tài)水平。如圖8所示，以細(xì)胞自身tRNA-5S作為參照，G基因型顆粒細(xì)胞較T基因型tRNA-Lys總量顯著提高50%（Plt;0.01）。

氨?；痶RNA與未氨?；膖RNA經(jīng)酸性-尿素變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離后，與地高辛標(biāo)記的線粒體tRNA-Lys寡核苷酸探針進(jìn)行Northern雜交，根據(jù)遷移速度，檢測線粒體tRNA氨?；?。結(jié)果表明，無論是否氨?；珿基因型細(xì)胞在凝膠中的遷移速度明顯高于T基因型樣品（圖9A），G基因型細(xì)胞氨?；痶RNA-Lys比例較T型細(xì)胞提高33.4%（Plt;0.01，圖9B）。因此，G型細(xì)胞含有賴氨酸的多肽翻譯效率可能會提高。

2.8 線粒體基因編碼蛋白質(zhì)表達(dá)水平

為了探究蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)是否與線粒體7719位點的變異相關(guān)，提取G、T基因型顆粒細(xì)胞蛋白，用Western blot方法檢測NADH脫氫酶（復(fù)合體I）的ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6亞基；細(xì)胞色素C還原酶（復(fù)合體Ⅲ）的細(xì)胞色素B亞基（CtyB）；細(xì)胞色素C氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞基：COⅠ、COⅡ、COⅢ；ATP合成酶的ATP6、ATP8兩個亞基。結(jié)果表明（圖10）：以COXⅣ為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，G基因型細(xì)胞線粒體編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著升高（Plt;0.05）。

3 討 論

在蛋白質(zhì)翻譯過程中，線粒體tRNA的D環(huán)與氨基酰tRNA合成酶結(jié)合，使氨基酸與受體位點連接，很多研究指出線粒體變異與其自身的生理狀態(tài)有關(guān)［19-22］，線粒體功能活性與二級結(jié)構(gòu)的D環(huán)和莖環(huán)息息相關(guān)，因此，D環(huán)被認(rèn)為是線粒體正常功能發(fā)揮至關(guān)重要的元素之一。D環(huán)變異可能導(dǎo)致線粒體功能受損，從而引起多種疾病。因此，了解D環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能對于闡明線粒體疾病的分子基礎(chǔ)和開發(fā)有效的治療策略至關(guān)重要?，F(xiàn)已證實T7719G變異會導(dǎo)致D環(huán)的U變?yōu)镚［23］，從而影響含有賴氨酸組成的蛋白質(zhì)合成效率，進(jìn)而影響一些由上述含有賴氨酸蛋白質(zhì)調(diào)控的表型性狀。在本研究中，G基因型顆粒細(xì)胞氨?；痶RNA的比例平均提高了33%，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，改善tRNA的穩(wěn)定性，使得tRNA-Lys水平提高了50%，進(jìn)而避免了線粒體蛋白缺陷。表明G型細(xì)胞中含有賴氨酸的多肽翻譯效率可能會提高。

線粒體是細(xì)胞中進(jìn)行氧化反應(yīng)并產(chǎn)生能量的主要細(xì)胞器，是細(xì)胞中的糖、脂質(zhì)、氨基酸與氧氣進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生能量的唯一場所［24］。在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中進(jìn)行的糖酵解反應(yīng)和在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行的三羧酸循環(huán)可以生成多種高能分子，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及還原型黃素二核苷酸（FADH2），然后通過氧化磷酸化作用釋放能量合成ATP［25］。線粒體tRNA-Lys 7719位點上的變異可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)能，特別是線粒體ATP的生成，與T基因型細(xì)胞相比提高了25%。線粒體膜電勢決定了細(xì)胞活力，反映了在氧化磷酸化和電子傳遞過程中，氫離子泵出線粒體內(nèi)膜的情況［26］。線粒體跨膜電位的降低是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的第一步，會引起線粒體膜通透性的增加，觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)的凋亡因子增加［27］。本研究中，攜帶G 基因型顆粒細(xì)胞的膜電位與對照組相比平均提高了24%，表明線粒體tRNA-Lys 變異對線粒體功能起到了調(diào)節(jié)作用。

當(dāng)線粒體功能發(fā)生障礙時，呼吸鏈中的氧化磷酸化水平降低，電子在傳遞過程中的泄漏［28］，尤其是復(fù)合體Ⅲ的損傷會造成更多電子的泄漏，伴隨著NADH或FADH2的呼吸作用，會生成大量的ROS［29］。作為細(xì)胞中重要的活性分子，ROS水平不同對細(xì)胞調(diào)控結(jié)果也不同［30］。在正常生理條件下，ROS作為多種信號通路的信號分子，具有信號刺激的作用，對細(xì)胞和機(jī)體維持正常功能發(fā)揮了重要作用［31］。相反濃度較高時，會氧化損傷DNA導(dǎo)致線粒體DNA斷鏈，干擾轉(zhuǎn)錄合成，對細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷；同時也會毒害細(xì)胞，破壞膜結(jié)構(gòu)，釋放細(xì)胞色素C導(dǎo)致凋亡［32］。當(dāng)線粒體中的ROS水平增加，線粒體結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)物質(zhì)如線粒體DNA分子，線粒體內(nèi)、外膜的磷脂分子，線粒體的酶會通過ROS被過氧化導(dǎo)致拷貝數(shù)異常，線粒體氧化磷酸化功能受到相應(yīng)的干擾，引發(fā)相應(yīng)的功能障礙，導(dǎo)致ATP合成水平降低［33］。線粒體功能紊亂的增加反過來又導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生增多，繼續(xù)上述的過程并最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織的死亡［34］。本研究中，G基因型顆粒細(xì)胞與T基因型相比，線粒體復(fù)合體Ⅲ活性及相應(yīng)的編碼蛋白表達(dá)水平得到改善，ROS的生成量減少，拷貝數(shù)增加。當(dāng)線粒體呼吸鏈活性被抑制，細(xì)胞及機(jī)體的活動所需的能量將依賴于糖酵解，當(dāng)糖酵解途徑過度被激活，將會抑制丙酮酸的代謝，從而造成細(xì)胞內(nèi)乳酸大量堆積。本研究中，G基因型變異組的糖酵解速率明顯下降，這一現(xiàn)象與前面線粒體膜電位、OCR的結(jié)果完全一致。

4 結(jié) 論

本研究初步解析了線粒體tRNA-Lys（T7719G）變異影響綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的生理機(jī)制，即tRNA-Lys（T7719G）變異影響tRNA-Lys穩(wěn)態(tài)和氨?；?，影響mtDNA 編碼的多肽翻譯效率，同時引起拷貝數(shù)、ATP水平、ROS含量和部分酶活性變化，進(jìn)而改變線粒體能量代謝功能和細(xì)胞凋亡。

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（編輯 郭云雁）