基于活細(xì)胞的微生物砷離子傳感器的性能拓展與優(yōu)化

摘要 在全細(xì)胞微生物傳感器的開發(fā)中，細(xì)胞的代謝活性狀態(tài)和信號輸出形式等因素會直接影響傳感器的穩(wěn)定性和可重復(fù)性等性能，給傳感器的應(yīng)用開發(fā)中標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立帶來了挑戰(zhàn)。本研究選擇基于Replication protein L（RepL）信號放大器的砷離子傳感器為研究對象，探究了不同條件對砷離子傳感器的檢測性能的影響。研究結(jié)果表明，細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境、生長狀態(tài)（如不同的生長期）、報告子的類型以及誘導(dǎo)時長等均會對砷離子傳感器的檢測性能產(chǎn)生顯著影響。傳感器在不同培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性差別較大，其中在LB培養(yǎng)基中展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。同時，不同生長期的細(xì)胞也展現(xiàn)出不同的檢測性能優(yōu)勢：在平臺生長期的細(xì)胞中，傳感器的檢測靈敏度和線性度更佳；在對數(shù)期的細(xì)胞中，檢出限更低。此外，傳感器的響應(yīng)存在最優(yōu)的誘導(dǎo)時長，過長或過短的誘導(dǎo)時間都會影響傳感器的響應(yīng)，本研究中砷離子傳感器的最佳誘導(dǎo)時間約為2～3 h。通過對3 種熒光蛋白報告子的對比研究發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白的選取對傳感器檢出限的影響不大（均在5～10 μg/L 范圍內(nèi)），但會顯著改變傳感器的響應(yīng)時間（從40 min 到2 h）；同時，熒光蛋白的發(fā)光亮度越高，傳感器響應(yīng)越快。本研究結(jié)果表明，可以根據(jù)不同的需求選取不同狀態(tài)的細(xì)胞，以最大限度優(yōu)化細(xì)胞傳感器的檢測性能，拓展傳感器的應(yīng)用空間。本研究結(jié)果為微生物傳感器在實(shí)際檢測中的應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 砷離子微生物傳感器；培養(yǎng)基；細(xì)菌生長階段；熒光蛋白報告基因；響應(yīng)時間

近年來，得益于合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展[1]，越來越多的微生物細(xì)胞活體傳感器被開發(fā)出來[2]。這些微生物傳感器通過在細(xì)胞膜上或細(xì)胞質(zhì)中引入受體蛋白，使其能夠與特定的化學(xué)物質(zhì)或重金屬離子結(jié)合[3]。然后，通過信號傳導(dǎo)級聯(lián)效應(yīng)[4-5]，最終改變報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，實(shí)現(xiàn)長期檢測。與傳統(tǒng)的化學(xué)和生化檢測方法不同，合成生物學(xué)的微生物傳感器檢測方法直接涉及活細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)活動。鑒于活細(xì)胞生物傳感器的信號輸出依賴于細(xì)胞一系列的生理過程，盡管微生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)比傳統(tǒng)檢測方法更低的檢出限或更高的靈敏度，但由于基因表達(dá)過程的復(fù)雜性，如轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，影響其檢測結(jié)果的變量遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)的檢測方法。

目前，大多數(shù)微生物活細(xì)胞傳感器的研究側(cè)重于特定分子環(huán)路的設(shè)計以及對環(huán)路元件等細(xì)節(jié)的優(yōu)化，通常忽視了微生物本身的生理狀態(tài)對用于檢測的分子環(huán)路的信號輸出可能產(chǎn)生的影響。同時，基因表達(dá)在不同階段的調(diào)控會在一定程度上影響微生物傳感器的穩(wěn)定性，也為微生物傳感器實(shí)際檢測中標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)?？紤]到上述因素的復(fù)雜性和多樣性，并處于實(shí)時動態(tài)變化之中，無法通過控制變量的方式逐一研究其對設(shè)計的分子環(huán)路的影響，因此，可以將微生物的宏觀表型，如生長速度和生理狀態(tài)等，作為這些因素的總和，并將其作為單一變量，測試其對微生物傳感器的影響。同時，通過改變輸出信號端的報告基因，可以研究輸入信號端和輸出信號端之間的關(guān)系，以降低這些宏觀因素對微生物傳感器的影響，從而為進(jìn)一步優(yōu)化微生物傳感器的檢測性能提供切實(shí)可行且簡便的方法。

本研究利用基于Replication protein L（RepL）信號放大器[6-8]的砷離子傳感器作為研究對象，對影響微生物傳感器性能的參數(shù)進(jìn)行了詳細(xì)研究。Rep L 是噬菌體P1 DNA L 復(fù)制子（Replicon L）內(nèi)部的一個長度為281 個氨基酸的開放閱讀框編碼蛋白質(zhì)。在裂解周期（Lytic cycle）內(nèi)，該蛋白可與L 復(fù)制子相互作用，完成噬菌體DNA 的復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)噬菌體增殖[9]。由于Rep L 基因位于As3+誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子之后，因而可以通過改變As3+濃度實(shí)現(xiàn)對Rep L 蛋白的表達(dá)控制；Rep L 蛋白可與位于其DNA 序列內(nèi)的復(fù)制起始位點(diǎn)OriL 結(jié)合，調(diào)控工作質(zhì)粒的拷貝數(shù)，通過基因數(shù)目的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)As3+響應(yīng)信號的放大（示意圖見電子版文后支持信息圖S1）。通過對3 組以不同熒光蛋白作為輸出信號的細(xì)胞傳感器進(jìn)行對比測試，考察了不同的信號輸出形式和操作條件對傳感器性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Arhat 96 梯度PCR 儀（莫納生物科技有限公司）；SPARKTM 多功能微孔板檢測儀（瑞士TECAN 公司）；Sigma 3K15 臺式高速離心機(jī)（德國Sigma 公司）；NanoDropTMOne/OneC 微量紫外可見光分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）；PTX-JA210S 分析天平（華志電子科技有限公司）；IS-RSDS 恒溫振蕩器（美國CRYSTAL 公司）；D1008E 掌上離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）；Micro Pulser 電穿孔儀（美國BIO RAD 公司）。

質(zhì)粒pMT012[10]和pMT018[10]由本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建， pASQ_mCherry 質(zhì)粒是以pMT012 為載體改造而來（具體構(gòu)建過程見電子版文后支持信息）。分別將以上3 個質(zhì)粒通過熱激的方法轉(zhuǎn)化至DH5α的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，得到3 種細(xì)胞傳感器菌株DH5α（pMT012）、DH5α（pMT018）和DH5α（pASQ_mCherry），將3 種菌株細(xì)胞于–80 ℃凍存，待用。

SalI（1080S）和SphI（1246S）Restriction Enzyme（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）；DpnI RestractionEndonuclease（美國New England Biolabs 公司）；T4 DNA ligase（EL0011）、GeneJET Plasmid MiniPrep Kit（K0502）、GeneJET PCR Purification Kit（K0702）和GeneJET Gel Extration Ki（K0691）（美國賽默飛世爾科技公司）；2 × Phanta Flash Master Mix PCR kit（P510，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；As3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司）；氨芐青霉素儲存液（100 mg/mL， A1170）、硫酸卡那霉素（K1030）、胰蛋白胨OXOID（LP0042K）、瓊脂粉（A8190）、酵母提取物（Y8020）和DH5α感受態(tài)細(xì)胞（C1100）（北京索萊寶科技有限公司）；1×PBS 緩沖液（G4202-100ML，武漢塞維爾生物科技有限公司）；PCR 引物pASQ vet F（5′-GCGTCGACATATTTTCCTCCTGGAAAGCTTCATTAC-3′）、pASQ vct R（5′-ACGCGCATGCTAACGACTCAGGCTGCTACTG-3′）、pASQ mCherry F（5′-GCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAAC-3′）和pASQ mCherry R（5′-ACGCGCATGCTTACTTATACAGCTCGTCCATGCCGCCGGT-3′）（吉林省庫美生物科技有限公司）。如無特殊說明，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基于不同報告子和培養(yǎng)基條件的測試

將–80 ℃凍存的DH5α（pMT012）、DH5α（pMT018）和DH5α（pASQ_mCherry）菌株取出，分別在含有卡那霉素的瓊脂平板上劃線，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜以獲取單克隆。第2 天，分別從培養(yǎng)平板上挑取3 種菌株的單克隆，接種到含有硫酸卡那霉素的5 ml LB 液體培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。測定3 種菌液在600 nm 的光密度（OD600）值，然后分別稀釋、轉(zhuǎn)接到2 mL 新鮮的LB 培養(yǎng)基、EZ-Rich 培養(yǎng)基和M9 培養(yǎng)基中，至OD600≈0.01， 37 °C 恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)2～3 h，直到菌液的OD600≈0.4，即大腸桿菌處于指數(shù)/對數(shù)生長期。取適量As3+標(biāo)準(zhǔn)儲存液分別添加到上述菌液中，使As3+終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10、30、50、80 和100 μg/L，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，使菌株在As3+刺激下產(chǎn)生響應(yīng)。

1.2.2 基于細(xì)菌不同生長狀態(tài)的測試

在瓊脂平板上挑選pMT012、pMT018 和pASQ_mCherry 的單克隆菌落，加入到含有硫酸卡那霉素的LB、EZ-Rich和M9液體培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。對于遲滯期（Lag phase）與平臺期（Stationary phase）進(jìn)行的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，分別將上述過夜培養(yǎng)的菌液在新鮮培養(yǎng)基中稀釋至OD600≈0.01 和1，并按照預(yù)先設(shè)定的As3+濃度梯度加入As3+標(biāo)準(zhǔn)儲存液， 37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)5 h， 取出樣本測試其熒光強(qiáng)度。對數(shù)期誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過程和條件與1.2.1 節(jié)相同。

1.2.3 基于不同誘導(dǎo)時長的測試

首先在pMT012、pMT018 和pASQ_mCherry 瓊脂平板上挑取單個菌落，接種到含硫酸卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中， 37 ℃恒溫?fù)u床（250 r/min）培養(yǎng)過夜。分別在新鮮的LB、EZ-Rich 和M9 液體培養(yǎng)基中稀釋至OD600≈0.01，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h， 或者至菌液的OD600≈0.4。然后，加入適量的As3+標(biāo)準(zhǔn)液至其終濃度為10 μg/L， 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)的第10 min、20 min、40 min、1 h、2 h、3 h 和5 h 的時間點(diǎn)分別取出相應(yīng)的菌液，進(jìn)行后續(xù)的測試。

1.2.4 熒光測試

每種測試條件下的細(xì)菌菌液各取出500 μL， 以13000 r/min 離心1 min， 棄上清液，收集菌體；加入500 μL PBS 緩沖液進(jìn)行洗滌， 13000 r/min 離心1 min，棄上清液；采用適量的PBS 緩沖液重懸細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)菌終濃度為OD600≈0.2～0.8。

取200 μL 重懸菌液加入到96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定不同條件下細(xì)菌的OD600 和熒光強(qiáng)度值，以PBS 緩沖液作為對照。對于GFP 和sfGFP，激發(fā)波長為475 nm，檢測515 nm 處的熒光強(qiáng)度值作為輸出信號。對于mCherry，激發(fā)波長為560 nm， 檢測610 nm 處的熒光強(qiáng)度值作為輸出信號。各實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)基條件下As3+的響應(yīng)

對比了3 種菌株（DH5α（pMT012）、DH5α（pMT018）和DH5α（pASQ_mCherry））在3 種培養(yǎng)基（LB、M9 和EZ rich）中對不同濃度As3+的響應(yīng)。圖1A 為DH5α（pASQ_mCherry）菌株在3 種培養(yǎng)基中的生長曲線，細(xì)胞在M9 中的生長速度遠(yuǎn)低于另外兩種培養(yǎng)基，因?yàn)镸9 是貧乏培養(yǎng)基，細(xì)胞在其中生長速度較慢；在豐富培養(yǎng)基LB 和EZ-Rich 中細(xì)胞均展現(xiàn)出較快的生長和繁殖速度。其它兩個菌株也表現(xiàn)出了相同的趨勢。

圖1B～1D 顯示了3 種菌株分別在不同的培養(yǎng)基中對不同濃度As3+的響應(yīng)情況。結(jié)果表明， 3 種菌株在不同的生長環(huán)境中均在一定濃度區(qū)間內(nèi)具有線性響應(yīng)，但是不同培養(yǎng)基中的線性范圍差異較大。不同培養(yǎng)條件下3 種報告子的線性擬合結(jié)果見表1， DH5α（pMT012）菌株在LB 和EZ-Rich 中的線性范圍較寬，分別為1～80 μg/L 和10～100 μg/L，但是在M9 中的線性范圍明顯變窄，只有30～100 μg/L；DH5α（pASQ_mCherry）展現(xiàn)出類似的趨勢；而DH5α（pMT018）菌株的結(jié)果有所不同，在EZ-Rich 培養(yǎng)基中顯示出較窄的線性范圍。上述結(jié)果說明，傳感器檢測的線性范圍與培養(yǎng)基和報告基因的性質(zhì)均密切相關(guān)。綜上，不同菌株在LB 培養(yǎng)基中的線性范圍變化較小，在其它兩種培養(yǎng)基中，線性范圍在不同報告基因的傳感器中變化較大。

3 種菌株在M9 培養(yǎng)基中對As3+的檢出限高于LB 和EZ-Rich，推斷可能是由于M9 屬于貧乏培養(yǎng)基，整體的蛋白合成和DNA 復(fù)制等過程處于較低水平，在較低濃度（如1 μg/L）As3+的誘導(dǎo)下，難以產(chǎn)生足夠的質(zhì)?？截悢?shù)，最終導(dǎo)致熒光強(qiáng)度較低。DH5α（pMT012）和DH5α（pMT018）菌株在LB 中表現(xiàn)出更穩(wěn)定的線性區(qū)間（1～80 μg/L）和斜率（約14500）。與LB 相比， DH5α（pMT012）菌株在EZ-Rich 中展現(xiàn)出相對更高的靈敏度， DH5α（pASQ_mCherry）菌株的檢測范圍更寬，但檢測靈敏度很低，而DH5α（pMT018）的檢測靈敏度和線性范圍位于兩者之間。這些結(jié)果表明，盡管EZ-Rich 培養(yǎng)基成分更簡單，理論上背景熒光信號應(yīng)更低，但在3 種菌株中呈現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。這可能因?yàn)榕c基于天然提取物的LB 培養(yǎng)基相比，由多種無機(jī)鹽組成的EZ-Rich 培養(yǎng)基成分相對簡單，由于細(xì)菌內(nèi)部生理狀態(tài)之間存在隨機(jī)差異，成分相對簡單的EZ-Rich 培養(yǎng)基可能會放大這種差異。與此相反， LB 培養(yǎng)基由于營養(yǎng)成分更復(fù)雜和豐富，掩蓋了細(xì)菌群體內(nèi)部生理狀態(tài)之間的隨機(jī)差異，因此呈現(xiàn)出更穩(wěn)定的測試性能。

2.2 細(xì)菌在不同生長狀態(tài)下對As3+的響應(yīng)

細(xì)菌在培養(yǎng)過程中的生長通常分為遲滯期（Lag phase）、對數(shù)期（Exponential phase）、平臺期（Stationaryphase）和衰亡期（Decline phase）4個階段[11]，其中，前3個階段為活細(xì)胞最重要的時期。以往的研究中，微生物傳感器大多集中在細(xì)菌的對數(shù)期進(jìn)行檢測[12]，目前還沒有對其它2 個時期的檢測性能進(jìn)行研究的報道。

本研究分別對3 種菌株的不同的生長階段的菌體細(xì)胞對As3+的響應(yīng)進(jìn)行了對比研究（圖2 和電子版文后支持信息S2）。結(jié)果表明，傳感器在細(xì)菌不同生長階段對As3+的響應(yīng)明顯不同，并且這種差異在3 種菌株中表現(xiàn)出一些共性（電子版文后支持信息S2）。首先，在遲滯期誘導(dǎo)的細(xì)菌均表現(xiàn)出很低的熒光信號響應(yīng)，并且與菌株和培養(yǎng)基條件無關(guān)。遲滯期的細(xì)菌代謝活躍，大量合成細(xì)菌分裂所需的酶類、ATP以及其它細(xì)胞成分，為細(xì)菌分裂做準(zhǔn)備，這一時期細(xì)菌的主要任務(wù)是積累物質(zhì)和能量，對環(huán)境的刺激不太敏感[11]，因此，遲滯期的細(xì)菌不適合用于檢測。在LB 和EZ-Rich 培養(yǎng)基中， 3 種菌株的平臺期誘導(dǎo)組相對于指數(shù)生長期組表現(xiàn)出更好的線性特性和更高的熒光信號。對比擬合曲線的斜率發(fā)現(xiàn)，在較高濃度范圍（10～100 μg/L）內(nèi)， LB 和EZ-Rich 中平臺期的細(xì)菌響應(yīng)靈敏度明顯高于對數(shù)期。然而，在M9 培養(yǎng)基中卻展現(xiàn)出了完全不同的結(jié)果， M9 培養(yǎng)基中平臺期的響應(yīng)與對數(shù)期基本一致（如DH5α（pMT012））或更差（如DH5α（pMT018）和DH5α（pASQ_mCherry））。這可能是因?yàn)镸9 培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長環(huán)境營養(yǎng)缺乏，處于半饑餓狀態(tài)，細(xì)菌的生理狀態(tài)與平臺期處于饑餓狀態(tài)的細(xì)菌相似。因此，對數(shù)期與平臺期細(xì)菌生理狀態(tài)和代謝活性相差較小，傳感器對As3+的響應(yīng)也更接近。

對比3 種菌株分別在不同生長階段誘導(dǎo)的線性曲線方程的相關(guān)系數(shù)（R2，圖2A～2C，以及電子版文后支持信息表S1）可知，平臺期細(xì)菌傳感器在其線性范圍內(nèi)普遍表現(xiàn)出更優(yōu)異的線性響應(yīng)，穩(wěn)定性較好；遲滯期和對數(shù)期的細(xì)菌的線性響應(yīng)程度隨培養(yǎng)基和報告子的改變均會發(fā)生變化，并且在某些條件下線性響應(yīng)很差，這種現(xiàn)象在遲滯期尤為明顯，進(jìn)一步證實(shí)了遲滯期的細(xì)菌不適合作為微生物傳感器用于實(shí)際檢測。采用擬合線性曲線的斜率（k）表征細(xì)菌傳感器在其線性范圍內(nèi)的靈敏度（圖2D～2F，電子版文后支持信息表S1），在兩種豐富培養(yǎng)基中， 3 種菌株的平臺期細(xì)菌的檢測靈敏度也均遠(yuǎn)高于其它兩個生長階段的細(xì)菌，進(jìn)一步顯示了利用平臺期細(xì)菌改善傳感器性能的巨大潛力。

雖然平臺期的細(xì)菌具有更好的線性響應(yīng)和更高的靈敏度，但是其線性范圍明顯比對數(shù)期和遲滯期的細(xì)菌更窄。推測這可能因?yàn)樵谶t滯期或者對數(shù)生長期，細(xì)菌的大部分蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)用于與生長相關(guān)的基因表達(dá)，如各種rRNA 和核糖體大小亞基蛋白等[13]；而在平臺期的細(xì)菌，由于生長速度下降，細(xì)菌內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)可以表達(dá)更多與生長無關(guān)的基因和蛋白質(zhì)，這可能導(dǎo)致平臺期的檢出限較高。此外，由于平臺期營養(yǎng)物質(zhì)逐漸缺乏，細(xì)菌更容易進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)[14]，從而導(dǎo)致包括金屬離子外排蛋白質(zhì)[15]的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步影響其在低濃度條件下的檢測性能。

2.3 不同誘導(dǎo)時長條件下As3+的響應(yīng)

本研究測試了3 種菌株在不同誘導(dǎo)時長內(nèi)對10 μg/L As3+的響應(yīng)，結(jié)果如圖3 所示， 3 種菌株在LB培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出了更靈敏的響應(yīng)和更高的熒光強(qiáng)度，在5 h 內(nèi)均表現(xiàn)出穩(wěn)定的高表達(dá)，這可能是由于LB 培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，能夠長時間支持熒光蛋白的高表達(dá)。與此相反， EZ-Rich 和M9 培養(yǎng)基中熒光信號相對較弱，并且隨著誘導(dǎo)時間延長，信號增強(qiáng)程度較小，甚至在DH5α（pASQ_mCherry）菌株中誘導(dǎo)2 h 后出現(xiàn)了熒光信號下降的趨勢。此外， DH5α（pASQ_mCherry）在EZ-Rich 中的響應(yīng)低于在LB 和M9 中的響應(yīng)。3 種菌株在所有培養(yǎng)基中誘導(dǎo)2～3 h 條件下，砷離子傳感器均表現(xiàn)出較高的信號響應(yīng)，表明此傳感器最佳誘導(dǎo)時長約為2～3 h。上述結(jié)果表明，傳感器的響應(yīng)時間均在數(shù)小時內(nèi)，誘導(dǎo)時間并非越長越好，實(shí)際檢測中應(yīng)根據(jù)具體的傳感器和培養(yǎng)環(huán)境選擇最佳的誘導(dǎo)時長。

2.4 不同報告基因響應(yīng)的對比

不同熒光蛋白的發(fā)光性質(zhì)（包括量子效率、發(fā)光亮度和成熟時間等）存在較大的差異，選取不同的熒光蛋白作為輸出信號是否會影響傳感器的性能，目前還沒有明確的研究結(jié)論。本研究對基于3 種報告子（GFP、sfGFP 和mCherry）的細(xì)胞傳感器進(jìn)行了對比。鑒于3 種熒光蛋白報告子的發(fā)光性質(zhì)相差較大，對3 種菌株的相對熒光強(qiáng)度（即不同As3+濃度下各菌株的熒光強(qiáng)度I 與[As3+]=0 時的熒光強(qiáng)度I0 的比值）進(jìn)行對比（圖4）。結(jié)果表明，不同的熒光蛋白的亮度差別較大， mCherry 的發(fā)光亮度遠(yuǎn)低于GFP 和sfGFP，但是， DH5α（pASQ_mCherry）響應(yīng)的最低濃度與其它兩個菌株差異較小，均在5 μg/L 時具有較明顯的響應(yīng)。此外，盡管3 種菌株在不同的培養(yǎng)基中的響應(yīng)程度存在差異，但這種差異不具有規(guī)律性，在LB 中DH5α（pASQ_mCherry）的響應(yīng)程度更大， EZ-Rich 中DH5α（pMT018）的響應(yīng)更明顯，而M9 中DH5α（pMT012）和DH5α（pASQ_mCherry）均表現(xiàn)出較強(qiáng)的信號響應(yīng)。這種差異可能是檢測誤差或細(xì)菌生理活性等因素導(dǎo)致的隨機(jī)變化。以上結(jié)果表明，發(fā)光強(qiáng)且發(fā)光效率高的熒光蛋白不一定具有更優(yōu)的信號響應(yīng)。

通過與上述圖3 結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)， 3 種不同報告子菌株的響應(yīng)時間不同，在菌株DH5α（pMT018）和DH5α（pMT012）中， As3+誘導(dǎo)20～40 min 時， LB 和EZ-Rich 中培養(yǎng)的pMT018 菌株已經(jīng)開始出現(xiàn)響應(yīng)，而在LB 中生長的DH5α（pASQ_mCherry）需要60～120 min 時才出現(xiàn)明顯的響應(yīng)，這可能與GFP 和mCherry的發(fā)光亮度和量子產(chǎn)率存在很大差異有關(guān)。與GFP 相比， mCherry 的發(fā)光效率和亮度較差[16]，這說明選擇熒光蛋白作為報告子時，熒光蛋白的發(fā)光性能至關(guān)重要，在傳感器可選擇的范圍內(nèi)應(yīng)盡量選擇量子產(chǎn)率和熒光亮度較高的蛋白。熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯和折疊等步驟，其中，折疊過程占據(jù)了大部分時間，該過程通常稱為蛋白質(zhì)的成熟時間，只有正確折疊的成熟熒光蛋白分子才會產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)。DH5α（pMT012）和DH5α（pMT018）菌株的報告子熒光蛋白分別為sfGFP 和GFP，兩者最大的區(qū)別在于成熟時間。熒光蛋白的成熟時間可能會影響傳感器的響應(yīng)速度，但本研究結(jié)果表明，雖然sfGFP 的成熟時間（幾分鐘）比GFP（～40 min）短很多[17]，但快的成熟速度并未明顯縮短傳感器的響應(yīng)時間。因此，傳感器的響應(yīng)時間不僅與報告蛋白的折疊速度有關(guān)，還可能受報告子蛋白和傳感器調(diào)控環(huán)路中轉(zhuǎn)錄因子的成熟速度共同影響，為提高傳感器的響應(yīng)速度，需要同時縮短二者的成熟時間。

3 結(jié)論

對比了3 種菌株（DH5α（pMT012）、DH5α（pMT018）和DH5α（pASQ_mCherry））在不同的宏觀因素（如生長環(huán)境、細(xì)菌生長狀態(tài)和As3+誘導(dǎo)時長）條件下，基于Rep L 放大環(huán)路的微生物傳感器的檢測性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些宏觀因素對于微生物活細(xì)胞傳感器的檢測性能具有顯著影響。采用LB 培養(yǎng)基可獲得更穩(wěn)定的測試效果，平臺期的細(xì)菌在較高濃度（5～100 μg/L）As3+的誘導(dǎo)下具有更好的線性響應(yīng)和靈敏度。在實(shí)際樣品的檢測過程中，可根據(jù)檢測需要合理選擇測試條件。同時，考察了不同的熒光蛋白作為輸出信號對傳感器性能的影響。熒光蛋白的發(fā)光性質(zhì)對傳感器的性能（尤其是響應(yīng)速度）至關(guān)重要，采用量子效率和發(fā)光亮度高的熒光蛋白會縮短傳感器的響應(yīng)時間，這為開發(fā)快速響應(yīng)的微生物傳感器提供了理論依據(jù)和可行性策略。由于生物系統(tǒng)自身的復(fù)雜性，影響基因表達(dá)的因素多種多樣，難以確定某個具體因素。但是，作為宏觀表型的細(xì)菌生長狀態(tài)可作為降低這些因素影響的重要參考，為優(yōu)化微生物傳感器的檢測性能提供切實(shí)可行和簡單便捷的方法，在微生物傳感器的應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的建立方面具有重要意義。

References

[1] MENG F， ELLIS T. Nat. Commun. ， 2020， 11（1）： 5174.

[2] KIM H J， JEONG H， LEE S. Anal. Bioanal. Chem. ， 2018， 410： 1191-1203.

[3] BONTIDEAN I， BERGGREN C， JOHANSSON G， CS?REGI E， MATTIASSON B， LLOYD J R， JAKEMAN K J， BROWNN L. Anal. Chem. ， 1998， 70（19）： 4162-4169.

[4] TYSON J J， CHEN K C， NOVAK B. Curr. Opin. Cell Biol. ， 2003， 15（2）： 221-231.

[5] ALON U. Nat. Rev. Genet. ， 2007， 8（6）： 450-461.

[6] GARDIOL D， GRAMAJO H C， HIRSCHBEIN L， MENDOZA D. Gene， 1993， 123（1）： 39-44.

[7] ONGENAE V， AZEREDO J， KROPINSKI A M， ROZEN D， BRIEGEL A， CLAESSEN D. Sci. Rep. ， 2022， 12（1）： 17785.

[8] MOCHIZUKI S， HIRATSU K， SUWA M， ISHII T， SUGINO F， YAMADA K， KINASHI H. Mol. Microbiol. ， 2003， 48（6）：1501-1510.

[9] HANSEN E B. J. Mol. Biol. ， 1989， 207（1）： 135-149.

[10] LI J， CUI M， ZHAO J， WANG J， FANG X. Biosens. Bioelectron. ， 2023， 221： 114937.

[11] PELEG M， CORRADINI M G. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. ， 2011， 51（10）： 917-945.

[12] BEREZA-MALCOLM L T， MANN G L， FRANKS A E. ACS Synth. Biol. ， 2015， 4（5）： 535-546.

[13] DRYSELIUS R， IZUTSU K， HONDA T， IIDA T. BMC Genom. ， 2008， 9（1）： 559.

[14] VOGT S L， SERAPIO-PALACIOS A， WOODWARD S E， SANTOS A S， DE VRIES S P， DAIGNEAULT M C，BRANDMEIER L V， GRANT A J， MASKELL D J， ALLEN-VERCOE E. Gut Microbes， 2023， 15（1）： 2190303.

[15] DAS S， DASH H R， CHAKRABORTY J. Appl. Microbiol. Biotechnol. ， 2016， 100（7）： 2967-2984.

[16] PADILLA-PARRA S， AUDUGé N， LALUCQUE H， MEVEL J C， COPPEY-MOISAN M， TRAMIER M. Biophys. J. ， 2009，97（8）： 2368-2376.

[17] SHASHKOVA S， WOLLMAN A J， HOHMANN S， LEAKE M C. Bio-protoc. ， 2018， 8（2）： e2710.