神經(jīng)元型一氧化氮合酶在腦功能性疾病中的研究進展

【摘要】 神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）是神經(jīng)系統(tǒng)中一種新近被認識的關(guān)鍵調(diào)控酶，與多種腦功能性疾病密切相關(guān)，其自身活性的平衡在腦功能性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。因此，外源性nNOS的干預(yù)治療可以在一定程度上改善某些腦功能性疾病。未來的研究將基于新的化合物，深入研究nNOS選擇性抑制劑，以期改善腦功能性疾病的治療效果。本文重點綜述了nNOS在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及最新進展。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)元型一氧化氮合酶；腦功能性疾??；抑制劑

【中圖分類號】 R651 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2024）04-0448-04

Research progress of neuronal nitric oxide synthase in brain functional disorders GAN Xiaokui， SONG Xiaowei， MENG Fan， ZHANG Ming， FANG Yiming， ZHOU Qigang， HUANG Baosheng. Department of Neurosurgery， Sir Run Run Hospital， Nanjing Medical University， 211112 Nanjing， China

Corresponding author： HUANG Baosheng

Abstract： Neuronal nitric oxide synthase（nNOS） is a recently known key regulatory enzyme in the nervous system， which is closely related to a variety of brain functional disorders. The balance of nNOS activity plays an important role in the occurrence and development of brain functional disorders. Therefore， the intervention of exogenous nNOS can improve some brain functional disorders to a certain extent. Future studies， based on new compounds， will further investigate selective nNOS inhibitors with a view to improving the therapeutic effect of brain functional disorders. This review clarifies the role and latest progress of nNOS in the nervous system.

Key words： neuronal nitric oxide synthase; brain functional disorder; inhibitor

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20171064）；南京市醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金項目（YKK19167）

作者單位：211112 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院神經(jīng)外科（甘小葵，張明，方一鳴，黃保勝）；南通市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（宋校偉）；南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理學(xué)系（孟帆，周其岡）

通信作者：黃保勝

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種雙原子、短壽命的神經(jīng)遞質(zhì)，作為信號分子參與心腦系統(tǒng)、炎癥、血管舒張和血管通透性等諸多生理病理的調(diào)控^[1]。盡管在人體內(nèi)多個器官中適量的NO被證明是有益的，但在神經(jīng)系統(tǒng)中，過量的NO產(chǎn)生可能引發(fā)神經(jīng)元毒性和死亡，從而導(dǎo)致諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病^[1]。因此，調(diào)控NO的生成對治療部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。

一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）以L-精氨酸為底物，輔以分子氧、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸和四氫生物蝶呤等，最終產(chǎn)生NO^[2]。在哺乳動物細胞中，存在著三種截然不同的異構(gòu)體NOS，包括神經(jīng)元型NOS（neuronal nitric-oxide synthase， nNOS）、誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS）和內(nèi)皮型NOS （endothelial NOS，eNOS），nNOS亞型在中樞及外周神經(jīng)細胞中被首次發(fā)現(xiàn)并占據(jù)主要分布，iNOS在多種細胞和組織中存在，eNOS則是在血管內(nèi)皮細胞中表達^[2]。盡管iNOS在神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達，但是nNOS存在于大腦的多個腦區(qū)中，如海馬、小腦和大腦皮質(zhì)等區(qū)域^[3]，是NO在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的主要前體酶。NO的異常產(chǎn)生是導(dǎo)致部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的潛在因素，而nNOS則是解決這個問題的重要一環(huán)，因此本文對nNOS在目前相關(guān)腦功能性疾病中的作用進行綜述，希望有助于后續(xù)進一步研究其在相應(yīng)腦功能性疾病中的詳細機制以及治療。

1 nNOS的結(jié)構(gòu)與功能

nNOS在體內(nèi)分別以單體和二聚體的形式存在，只有后者具有活性。無活性的nNOS單體（分子量為160.8 kDa，含有1 434個氨基酸）包含一個氧合酶結(jié)構(gòu)域（催化或N端）和一個還原酶結(jié)構(gòu)域（C端），N端結(jié)構(gòu)域可以與四氫生物蝶呤巰基連接的血紅素（氧化還原輔因子）、L-精氨酸和鋅離子結(jié)合；C端結(jié)構(gòu)域包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸的結(jié)合位點^[3]?；钚詎NOS酶是同型二聚體，兩個單體通過二聚體活化將各自N端氧合酶結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)蛋白結(jié)合序列連接在一起，形成具有活性的酶^[4]。nNOS在多個腦區(qū)中均有表達，主要定位于神經(jīng)元的細胞質(zhì)中，也偶有分布于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞核中^[5]。對nNOS的結(jié)構(gòu)深入了解才能夠?qū)λ幬锏脑O(shè)計具有參考意義，因此相當一部分抑制劑的設(shè)計都充分考慮了nNOS的結(jié)構(gòu)。

近年來，越來越多的報道證實了nNOS在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，nNOS參與學(xué)習、記憶、神經(jīng)發(fā)生以及血壓中樞等調(diào)控功能^[6]；而在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，nNOS則主要與平滑肌活動的調(diào)節(jié)有關(guān)。nNOS的功能異常所導(dǎo)致的下游異常NO信號可能導(dǎo)致多種功能性神經(jīng)疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、癲癇等^[7]。作為NO在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要來源，nNOS的調(diào)節(jié)作用值得重視。

2 nNOS與腦功能性疾病

在神經(jīng)系統(tǒng)中，nNOS產(chǎn)生的NO可以作用于許多靶酶和蛋白質(zhì)，適當?shù)腘O生成才能發(fā)揮正常的生理功能。如果這種穩(wěn)定的狀態(tài)被打破，則會造成一系列神經(jīng)系統(tǒng)的病變，從而使得nNOS參與到中樞系統(tǒng)的一些腦功能性疾病的病理中。

2.1 nNOS與癲癇 癲癇是一種危害了十分之一世界人口的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它能夠影響大腦的多個分區(qū)。目前受廣泛認可的癲癇發(fā)生機制是中樞興奮與抑制的失衡，理論上nNOS陽性的抑制性中間神經(jīng)元缺失會打破這個平衡從而導(dǎo)致神經(jīng)元的過度興奮，最終誘發(fā)癲癇^[8]。已有相關(guān)證據(jù)表明，nNOS參與了癲癇發(fā)生，在電刺激誘導(dǎo)的癲癇小鼠模型和紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中，海馬中nNOS的表達水平均明顯升高^[9-10]。同樣的，在人腦皮質(zhì)的致癇灶中也檢測到神經(jīng)元表達nNOS明顯高于對照正常人腦組織^[11]。由此推測，癲癇發(fā)作早期抑制性中間神經(jīng)元可能會代償性地上調(diào)nNOS來抑制癲癇，但在癲癇的長期致病中可能就涉及nNOS產(chǎn)生過量NO導(dǎo)致神經(jīng)毒性。以上研究提示了nNOS在癲癇中的重要作用，但是目前對于nNOS在癲癇中的確切作用和潛在機制尚不清楚。Méndez-Armenta等^[12]發(fā)現(xiàn)，在癲癇海馬中nNOS的功能失調(diào)會引起活性氧和活性氮的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致過度氧化應(yīng)激破壞線粒體的正常功能，最終致使神經(jīng)元死亡，證明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致癲癇的可能機制之一。Zhu等^[13]發(fā)現(xiàn)，在戊四氮誘導(dǎo)的癲癇模型中，nNOS產(chǎn)生的NO與超氧陰離子快速反應(yīng)生成大量具有神經(jīng)毒性的過氧亞硝酸鹽，引起海馬體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進一步證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和癲癇之間的關(guān)聯(lián)。這兩種機制都參與到癲癇所導(dǎo)致的進行性神經(jīng)退行性病變過程中，因此現(xiàn)階段的抗癲癇治療策略也可以根據(jù)nNOS與癲癇致病之間的關(guān)系來設(shè)計新的藥物。

2.2 nNOS與帕金森病（Parkinson’s disease，PD） PD是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性死亡為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。正常情況下，在成年大鼠腦內(nèi)尾狀核、殼核、伏隔核的多巴胺能神經(jīng)元末梢觀察到nNOS的中等表達，而黑質(zhì)區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元的表達水平則明顯低于以上腦區(qū)^[14]。在PD患者的腦組織中進一步發(fā)現(xiàn)，丘腦底核、黑質(zhì)紋狀體這些腦區(qū)中的nNOS呈現(xiàn)出高表達趨勢，提示了nNOS在PD黑質(zhì)紋狀體多巴胺能通路的上調(diào)中起到重要作用^[15]。以上研究說明，nNOS的表達及功能與PD的發(fā)病機制相關(guān)。黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元具有N-甲基-D-天冬氨酸受體，接受來自大腦皮質(zhì)和丘腦底核的谷氨酸輸入，當興奮性氨基酸受體被激活后引起Ca²⁺內(nèi)流，繼而激活nNOS生成NO，導(dǎo)致具有神經(jīng)毒性的過氧亞硝酸鹽的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致PD黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的損傷和凋亡^[16]。具體nNOS在PD中的致病機制還需要進一步研究，考慮到過度激活的nNOS和隨后過量產(chǎn)生的NO可能推動PD的病理，選擇性抑制nNOS可能為PD的治療提供了新的思路。

2.3 nNOS與阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD） AD是一種以認知功能下降為特征的神經(jīng)退行性疾病，其特征性改變?yōu)樯窠?jīng)元變性丟失和淀粉樣斑塊形成。大量研究發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦中β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生和過度堆積導(dǎo)致了AD特征性纏結(jié)神經(jīng)元的形成以及炎癥變化、神經(jīng)退行性變等一系列病理改變，證實了β-淀粉樣蛋白在AD形成和發(fā)展中的重要角色^[17]。Thorns等^[18]發(fā)現(xiàn)，在AD患者的纏結(jié)神經(jīng)元中，nNOS的表達顯著增加，這表明nNOS可能涉及在AD病理過程中大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的死亡和突觸丟失。而在關(guān)于β-淀粉樣蛋白局部輸注的相關(guān)研究中，β-淀粉樣蛋白的沉積可誘導(dǎo)Ca²⁺內(nèi)流到細胞內(nèi)基質(zhì)，從而增強nNOS活性，導(dǎo)致NO過度產(chǎn)生，并伴有相關(guān)的神經(jīng)毒性、認知障礙和空間記憶損害^[19]，這提示著nNOS與β-淀粉樣蛋白共同作用可能參與到AD的病理過程中。已經(jīng)有研究證實了一種存在于腦組織中的細胞周期蛋白依賴性激酶-5的失調(diào)和β-淀粉樣蛋白協(xié)同作用促使AD發(fā)生^[20]。而nNOS的二聚化會促使細胞周期蛋白依賴性激酶-5磷酸化^[21]，因此當nNOS二聚化被破壞，可能導(dǎo)致CDK5的異常激活，最終促進AD的進展。此外，nNOS二聚體的破壞也會產(chǎn)生活性氧引起氧化應(yīng)激反應(yīng)以及過氧亞硝酸鹽生成引起的神經(jīng)元死亡^[2]，在AD中起著重要的病理作用。由于nNOS產(chǎn)生的NO能夠調(diào)節(jié)血管張力，nNOS功能失調(diào)導(dǎo)致NO合成障礙會引起腦血流量的減少，從而影響中樞神經(jīng)細胞的葡萄糖和氧供應(yīng)，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白沉積增加，可能進一步加重AD的進展^[22]。因此對nNOS在AD致病中的詳細機制進行深入研究，有望以nNOS為靶點找到治療AD的方法。

2.4 nNOS與亨廷頓舞蹈?。℉untington’s disease，HD） HD是一種以運動功能障礙、認知障礙和精神障礙為特征的致命神經(jīng)退行性疾病。該病是由于4號染色體上的基因異常引發(fā)了CAG片段擴增，從而導(dǎo)致亨廷頓蛋白中聚谷氨酰胺鏈延伸所引起的^[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HD小鼠的紋狀體和小腦中觀察到nNOS表達和活性降低，且在nNOS基因缺失的小鼠中HD病情進展更快，這些足以說明nNOS在HD病理中的重要作用^[24]。但是，這個結(jié)果與nNOS在癲癇、PD、AD等疾病中的表達恰恰相反。Deckel等^[25]發(fā)現(xiàn)，在HD小鼠中使用nNOS抑制劑阻斷nNOS活性后，導(dǎo)致過氧亞硝酸鹽生成增加，從而導(dǎo)致HD的快速進展。這些結(jié)果表明，nNOS功能異?？赡茱@著促進HD中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)退行性病變，提示著從nNOS入手來對抗HD進展的可能性，后續(xù)仍需進一步深入研究其在HD中的詳細致病機制，在此基礎(chǔ)上研發(fā)藥物起到治療HD的作用。

2.5 nNOS與神經(jīng)性疼痛（neuropathic pain，NP） NP是由于感覺神經(jīng)系統(tǒng)病變引起一種常見慢性疼痛，包括三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和中風后疼痛等，對患者的生活質(zhì)量造成了極大損害^[26]。它的特征包括對有害刺激的反應(yīng)增強、對非有害刺激的異常反應(yīng)和自發(fā)性疼痛。Boettger等^[27]發(fā)現(xiàn)，nNOS基因缺失的小鼠對疼痛的反應(yīng)更加耐受，其表現(xiàn)出的疼痛行為較正常小鼠明顯減少；在給損傷的野生型動物使用nNOS抑制劑后，也極大地緩解了它們的NP^[28]，這表明nNOS在介導(dǎo)NP中起到重要作用。如何控制和改善NP則需進一步研究其潛在機制，可能有以下幾種作用方式。首先，nNOS可以通過生成過氧亞硝酸鹽增強N-甲基-D-天冬氨酸受體的磷酸化，從而導(dǎo)致中樞敏化，參與持續(xù)性疼痛的維持^[29]。此外，nNOS還可以通過調(diào)控包括趨化因子在內(nèi)的炎癥介質(zhì)表達，作用在感覺神經(jīng)元上的趨化因子受體，從而使負責疼痛傳導(dǎo)的C-纖維敏化，最終導(dǎo)致痛覺過敏^[30]。其下游產(chǎn)物NO的過量產(chǎn)生和環(huán)磷酸鳥苷的合成在炎性疼痛和NP中也發(fā)揮著一定作用^[31]，nNOS通過調(diào)節(jié)NO的生成參與到NP中去。綜上，充分證實了nNOS在NP中發(fā)揮的作用，因此nNOS可以作為NP的一個潛在治療靶點。

3 nNOS的選擇性抑制劑

鑒于nNOS過度產(chǎn)生的NO在眾多腦功能性疾病中的作用，nNOS是一個值得進一步關(guān)注的重要治療靶點。目前已經(jīng)研究出一些選擇性nNOS抑制劑，主要方法包括利用精氨酸模擬物作為競爭性nNOS抑制劑等，接下來將對幾種常見的抑制劑進行簡單介紹。

3.1 7-硝基吲哚（7-nitroindazole，7-NI） 作為最早發(fā)現(xiàn)的選擇性抑制NOS的化合物之一，7-NI對nNOS的抑制是否具有選擇性仍有異議。在體外研究中，7-NI與nNOS和eNOS均能結(jié)合，但在活體細胞中，7-NI對腦組織中的nNOS有抑制作用，對完整血管中的eNOS活性沒有影響^[32]。盡管在體外，7-NI與NOS的結(jié)合沒有特異性選擇其中一種分型，但在動物體內(nèi)則具有nNOS選擇性抑制作用。在動物實驗中，戊四唑（pentylenetetrazole，PTZ）點燃癲癇小鼠模型中海馬齒狀回新生神經(jīng)元的增殖和存活顯著增強；然而，在使用7-NI抑制nNOS的活性后，明顯抑制了齒狀回新生神經(jīng)元的增殖和存活^[33]。目前，將7-NI應(yīng)用于人體內(nèi)探究其作用的實驗尚未大量開展，在一項關(guān)于人體溫度的血管調(diào)節(jié)實驗中，研究者使用了皮內(nèi)微透析的方式進行7-NI給藥治療，這種技術(shù)可以允許7-NI發(fā)揮純粹的局部作用，而沒有全身作用的風險^[34]。因此能否利用該項技術(shù)，還是開發(fā)新的技術(shù)將7-NI特異性輸入到腦功能性疾病的病變腦區(qū)起到治療作用，還需要進一步探索。

3.2 S-methyl-L-thiocitrulline（SMTC） SMTC是一種合成的L-精氨酸類似物，對nNOS和eNOS均有很強的選擇性，但是對腦組織中nNOS的特異性是血管內(nèi)皮中eNOS的17倍^[35]。研究發(fā)現(xiàn)，SMTC能夠穿過血腦屏障發(fā)揮抑制中樞nNOS的作用，在使用SMTC抑制nNOS后可以引起人腦神經(jīng)血管耦合反應(yīng)性的降低^[36]，而神經(jīng)血管耦合功能的異常則會引起一些功能性神經(jīng)退行性變。因此，通過合理利用SMTC對nNOS的抑制功能有望起到治療相關(guān)功能神經(jīng)退行性變的效果。

3.3 N（ω）-propyl-L-arginine（L-NPA） L-NPA作為L-精氨酸類似物也是nNOS的一種高選擇性抑制劑，其對nNOS的抑制性分別是eNOS和iNOS的149倍和3 158倍^[37]。研究者使用L-NPA治療紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇小鼠，發(fā)現(xiàn)可降低驚厥樣運動發(fā)作的嚴重程度和持續(xù)時間以及癲癇持續(xù)狀態(tài)期間癲癇樣棘波的頻率^[38]。這說明，L-NPA有治療癲癇的潛力，但能否應(yīng)用到人體來進行癲癇的治療還待進一步研究。

3.4 2-氨基喹啉類抑制劑 2-氨基喹啉類藥物具有生物可用的nNOS抑制劑的前景，但其對人體內(nèi)nNOS的抑制能力較低，并且與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的其他靶標有顯著的結(jié)合，這就導(dǎo)致其會產(chǎn)生多種不良后果。Cinelli等^[39]一直基于2-氨基喹啉支架進行抑制劑的設(shè)計與合成；該團隊研發(fā)的第一代氨基喹啉類是具有良好藥代動力學(xué)的nNOS抑制劑，但其在人體中對nNOS的選擇性明顯低于eNOS，這就造成了藥物的脫靶；第二代抑制劑雖然減少了脫靶結(jié)合，但是其在藥物腸道吸收利用不佳，且對人體nNOS和eNOS具有同樣低選擇性；最新一代的抑制劑則通過加入部分化學(xué)基團后，明顯增強了對人體nNOS的作用效果，也改善了脫靶和腸道滲透性特性。其能否運用到人體中起到治療相關(guān)疾病還有待進一步研究。

3.5 基于2-氨基吡啶支架的選擇性nNOS抑制劑 除了以上這些藥物以外，Do等^[40]在基于NOS結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計和片段跳躍的指導(dǎo)下，通過2-氨基吡啶支架設(shè)計出一系列選擇性nNOS抑制劑，但是存在部分藥代動力學(xué)的缺陷。設(shè)計具有改善藥代動力學(xué)特性的強效nNOS抑制劑至關(guān)重要，該抑制劑需要同時兼具高亞型選擇性和強血腦屏障滲透性的效果，這樣既能減少作用于eNOS和iNOS所帶來的副作用，也能利用到神經(jīng)系統(tǒng)中起到治療效果。

4 結(jié) 語

綜上所述，nNOS的功能異常與部分腦功能性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，同時nNOS及其產(chǎn)物NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用是非常復(fù)雜的，因此充分了解其在多種神經(jīng)疾病中的作用機制對疾病治療具有指導(dǎo)意義。目前階段設(shè)計和發(fā)現(xiàn)的化合物雖然能夠選擇性抑制nNOS的功能，但還存在血腦屏障滲透性差、副作用多等缺陷。因此以nNOS為針對性靶點進行藥物的研發(fā)，有望治療相關(guān)腦功能性疾病。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：甘小葵、宋校偉負責起草文章，查閱文獻及分析；孟帆、周其岡負責文獻內(nèi)容的總結(jié)；張明、方一鳴負責查閱文獻和機制的總結(jié)；黃保勝負責課題監(jiān)管和指導(dǎo)，文章的審閱和修訂。

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（收稿2023-03-16 修回2023-07-01）