高海拔牛糞的堆肥發(fā)酵對其營養(yǎng)成分、微生物組成及耐藥性基因ARG豐度的影響

摘要：高海拔地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展迅速，牲畜糞污排放日漸增多，對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境有較大的威脅。因高海拔地區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候特點(diǎn)，如海拔高、氣候寒冷和晝夜溫差大等，導(dǎo)致高海拔地區(qū)糞污的資源化利用較難實(shí)現(xiàn)。因此，高海拔地區(qū)選擇適宜當(dāng)?shù)貤l件的糞污處理模式是糞污的資源化利用關(guān)鍵。本研究將復(fù)合微生物添加至糞污混合物，再應(yīng)用智能化膜系統(tǒng)的堆肥方式，以期揭示復(fù)合微生物及智能化膜對牛糞資源化利用的效率及相關(guān)耐藥基因的影響。結(jié)果表明，應(yīng)用復(fù)合微生物的智能化膜堆肥發(fā)酵后明顯提高牛糞有效鉀含量。此外，16S測序結(jié)果表明，與當(dāng)?shù)氐拇鎯ε＜S（NF）、土壤（LL）和新鮮牦牛糞（MN）相比，堆肥發(fā)酵后牛糞中噬幾丁質(zhì)菌、鞘氨醇桿菌等的豐度明顯上調(diào)，而不動桿菌、金黃桿菌和波波桿菌等出現(xiàn)明顯下調(diào)。16S基因組檢測結(jié)果表明，堆肥發(fā)酵后抗生素的耐藥性明顯下降，qPCR結(jié)果證實(shí)，其中喹諾酮類耐藥基因qnrD和qnrS，四環(huán)素類耐藥基因tetW出現(xiàn)明顯下調(diào)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測結(jié)果表明，復(fù)合微生物的智能化膜堆肥發(fā)酵后明顯提高，5-羥戊二酸、D-阿爾法氨基丁酸、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂等的含量。本研究結(jié)果為高海拔牛糞資源化利用推進(jìn)和資源化利用過程中控制耐藥性基因ARG傳播提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高海拔；牛糞；堆肥發(fā)酵；ARG

中圖分類號：S141.4；X713 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）14-0244-09

收稿日期：2023-06-25

基金項(xiàng)目：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東西部合作項(xiàng)目（編號：DKBF-2022-15）。

作者簡介：李兆龍（1973—），男，福建福州人，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槟c道微生物及其應(yīng)用。E-mail：lizhaolong522@163.com。

高海拔地區(qū)的家畜主要是牦牛、羊和藏豬，近幾年規(guī)?；笈?、羊和藏豬養(yǎng)殖日漸增長，伴隨而來的是糞污排放量也日趨增加［1］。高海拔地區(qū)的牲畜糞污，長期以來大部分是未經(jīng)處理直接排至周圍環(huán)境中的，不僅生物肥效低，且污染了生態(tài)草場［2］。隨著夏季持續(xù)大量降雨，糞污直排又會導(dǎo)致生態(tài)水體的水污染，且糞便中的有機(jī)物腐爛后還導(dǎo)致蚊子和蒼蠅的繁殖，以及臭味的滋生。此外，牦牛、羊和藏豬糞便中含有大量的病原體、病毒和寄生蟲的蟲卵，容易導(dǎo)致各種疾病的傳播［3］。而糞便中的抗生素耐藥基因（ARG）是一種易被忽視的污染物，它們被動植物吸收，通過食物鏈進(jìn)入人體，會損害肝腎功能，破壞正常人體的免疫功能，危害公眾健康。規(guī)?；倪^多使用抗生素，造成了抗生素積累和超標(biāo)，進(jìn)一步促進(jìn)ARG在環(huán)境中的積累和傳播。因此，高海拔牲畜糞便的處理是亟需解決的問題［4-5］。

牲畜糞便中含有大量的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等作物所需營養(yǎng)物質(zhì)，是植物生長的良好肥料來源。在我國高海拔寒冷區(qū)域，植物生長的限制性元素是氮、磷等有機(jī)養(yǎng)分，土壤中有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)分解受到較大限制，養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)效率慢，導(dǎo)致植物正常生長及代謝所需的有機(jī)養(yǎng)分缺乏，而畜禽產(chǎn)生的糞便中含有大量的維持植物生長發(fā)育所需的有機(jī)養(yǎng)分如氮、磷、鉀等，其有機(jī)必需養(yǎng)分和微量有機(jī)質(zhì)對于保持土壤肥力，促進(jìn)植物的穩(wěn)定生長和保障穩(wěn)定的牧草產(chǎn)量等有重要的作用。因此，高海拔牲畜的糞便是改善當(dāng)?shù)刂脖坏奶烊环柿希?］。

腐熟的堆肥施至土壤中，可明顯提升土壤肥力，為作物生長提供豐富的營養(yǎng)，并盡可能減小土地退化的風(fēng)險(xiǎn)。腐熟的堆肥還可以殺滅其中大部分的有害菌和寄生蟲等，避免致病菌和微生物的傳播。腐熟的肥料堆肥可以減少糞便量，減少氣味的產(chǎn)生。而且在堆肥過程中，添加目標(biāo)微生物代謝活性的微生物制劑或抑制劑將調(diào)節(jié)微生物群落以控制畜禽糞污氣味。此外，堆肥顯著降低了牛糞中ARG和移動遺傳元件（MGE）的多樣性和相對豐度［7-8］。經(jīng)過糞便和堆肥處理的土壤中，抗生素抗性水平隨著時間的推移迅速下降，因此高海拔牲畜糞便的堆肥是減輕抗生素抗性傳播風(fēng)險(xiǎn)的有效方法之一［9］。

高海拔地區(qū)因氣候寒冷，晝夜溫差大，空氣稀薄，霜凍和雨雪期持續(xù)時間長的特殊自然地理?xiàng)l件，嚴(yán)重影響了糞污資源化利用。同時，由于我國高海拔地區(qū)的地形崎嶇復(fù)雜，農(nóng)牧戶較為分散且人口不容易集中，少數(shù)民族地區(qū)勞動力資源比較短缺，因此目前在中高海拔區(qū)域中的農(nóng)村糞污無害化收集及處理方面采取大規(guī)模的人力機(jī)械作業(yè)較少，相關(guān)的研究也較少，截至到目前高效而經(jīng)濟(jì)環(huán)保的牲畜糞污資源化利用模式尚未見大面積推廣應(yīng)用［1-2］。因此，本研究探討高海拔牛糞的堆肥發(fā)酵對其營養(yǎng)成分、微生物組成及耐藥性基因豐度的影響，以期為高海拔牛糞的資源化利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 復(fù)合微生物

本次試驗(yàn)中的復(fù)合微生物主要分離自西藏糞污資源化利用公司的堆場。

1.1.2 主要試劑和儀器

試驗(yàn)主要試劑有腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI）、瓊脂、酵母提取物、葡萄糖和蛋白胨等，購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司；引物合成及測序，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自福建有巢氏生物技術(shù)有限公司，Taq PCR Mix和DNA marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司。鼓風(fēng)干燥箱購自上海合恒儀器設(shè)備公司；qPCR儀購賽默飛世爾科技（中國）有限公司默飛世爾科；恒溫培養(yǎng)箱，購自福州達(dá)道儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，購自福州市美華生化儀器廠；電泳儀，購自北京萬昌生物科技有限公司；凱氏定氮儀，購自北京優(yōu)普通用科技有限公司；碳氮元素分析儀，購自美國哈希有限公司；原子吸收光譜儀，購自北京生化儀器廠；Bio-RadCFX96TM定量儀，購自美國伯樂公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

樣品于2022年采集自西藏自治區(qū)山南市，采集樣品分別有5種，分別是新鮮的牦牛糞便（MN）、存儲多年的牛糞（NF）、堆場的粉碎青稞殼及灌木（DC，輔料）、發(fā)酵好的牛糞及附屬材料混合物（FJ）、海拔4 500 m的土壤（LL）。整個樣品的采集設(shè)計(jì)以隨機(jī)6個點(diǎn)混為1個樣品，然后呈對角線布點(diǎn)法設(shè)置３個重復(fù)。先去除表面一層物質(zhì)，取樣深度為20 cm，置于無菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，將每個樣品隨機(jī)分成6份。其中1份自然風(fēng)干后用組織研磨儀研磨，然后用0.15 mm篩網(wǎng)過篩，后用于土壤理化性質(zhì)分析。其他保存在-80 ℃，供隨后試驗(yàn)用。

1.2.2 理化性質(zhì)測定

總有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀容量法測定，全氮含量采用凱氏定氮法測定。分別用重鉻酸鉀氧化-容量法測定土壤有機(jī)質(zhì)含量，靛酚藍(lán)比色法測定土壤銨態(tài)氮含量，氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量，碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法-測定土壤有效磷含量，堿熔-火焰光度法測土壤全鉀含量，乙酸銨浸提-火焰光度法測定土壤速效鉀含量，土壤碳氮元素分析儀測定全氮含量。

1.2.3 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

采用全式金基因組DNA試劑盒提取樣本的基因組DNA，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。根據(jù)測序區(qū)域作為目標(biāo)，用Prime 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以前面提取的基因組DNA為模板，使用高保真酶和相關(guān)Buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小及是否有非特異擴(kuò)增［10］；用Nanodrop檢測濃度；等量混樣后充分混勻，進(jìn)行膠回收，然后建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫進(jìn)行上機(jī)測序。將16S rRNA基因測序獲得的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN比對，獲得的結(jié)果根據(jù)氨基酸同源性，對齊長度進(jìn)行過濾。根據(jù)過濾結(jié)果，從NCBI下載命中的基因序列，并提交至抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對，比對結(jié)果同樣按照氨基酸同源性過濾，并被注釋為ARG序列，至此獲得樣品中的微生物及其攜帶的ARG情況［11-13］。

1.2.4 定量PCR

為進(jìn)一步評估發(fā)酵是否導(dǎo)致糞便ARG豐度降低，5個樣品分別采用qPCR檢測，針對8種常見的抗生素耐藥性的整合酶和轉(zhuǎn)座酶。試驗(yàn)在Bio-RadCFX96TM觸控系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)采用SYBR預(yù)混式ExTaqⅡ試劑盒（TaKaRa，日本）。qPCR引物序列見表1，以16S rRNA基因作為內(nèi)參，對每個樣本進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，以評估每個ARG的豐度。檢測限被設(shè)置為1個閾值周期（CT）為31℃。反應(yīng)混合物中包含每個引物0.3 μL（10 nmol/L），1 μL 10 ng模板DNA，10 μL絕對藍(lán)色SYBR綠色主混合物和8.4 μL無核酸酶水。整個擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95" ℃初始變性5 min，95 ℃變性10 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s。擴(kuò)增反應(yīng)后，生成了從60 ℃到95 ℃的熔體曲線，以估計(jì)特異性，測序引物見表1。

1.2.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)檢測分析

分別從DC組、FJ組、LL組、MN組、NF組，稱取20 mg樣品，每組取3份，共計(jì)15例樣本。分別加入1 000 μL提取液（甲醇 ∶乙腈 ∶水體積比為 2 ∶2 ∶1，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物）；35 Hz研磨處理4 min，冰浴超聲5 min；重復(fù)步驟2～3次；-40 ℃靜置 1 h；將樣品4 ℃，12 000 r/min（離心力13 800 g，半徑8.6 cm）離心15 min；取上清于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測；所有樣品再取等量上清混合成QC樣品，再使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離［14］。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL。質(zhì)譜儀在控制軟件（Xcalibur，Thermo）控制下進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集［15］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2022、SPSS 19.01進(jìn)行分析，直方圖采用GraphPadPrim 9.0.0軟件進(jìn)行繪制。16S rRNA和宏基因組數(shù)據(jù)分析采用MajorbioI-Sanger云平臺的免費(fèi)在線平臺（https：//www.i-sanger.com）進(jìn)行分析。在生物信息學(xué)網(wǎng)站（https：//psb.ugent.be/webtools/Venn/）上構(gòu)建了一個維恩圖。使用R “物理圖”包制作ARG和元蛋白質(zhì)組的熱圖。使用R包與微生物組之間進(jìn)行共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，并使用弗拉特曼雷因戈?duì)柕虏季炙惴ㄟM(jìn)行可視化。代謝組的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（v2.1）自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品的理化性質(zhì)

鉀和磷元素是自然界中植物生長必需的大量營養(yǎng)元素，對作物生長過程起著積極的作用，是土壤肥力差異的評價指標(biāo)［16］。為進(jìn)一步闡明高海拔地區(qū)牛糞發(fā)酵對牛糞理化性質(zhì)的影響，試驗(yàn)分別檢測各樣品的理化性質(zhì)，結(jié)果（圖1）表明，發(fā)酵組（FJ）的總磷含量和存儲多年的牛糞（NF）較為接近，新鮮牦牛糞（MN）的總磷量略有上漲，但差異不明顯；全鉀含量以堆場的粉碎青稞殼及灌木（DC）含量最高，其他4組差異不明顯；而有效鉀含量在發(fā)酵組則出現(xiàn)一定的增長，尤其與海拔4 500 m的土壤（LL）、DC組和NF組相比，差異較為明顯。DC組的總氮和氨態(tài)氮含量最低，其次是LL組，其他組差異不明顯。碳氮比用來評估土壤碳元素和氮元素營養(yǎng)是否平衡的關(guān)鍵指標(biāo)，相對于單獨(dú)的碳或氮含量更能評價土壤肥力。因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中選用合適碳氮比的肥料，對保持土壤肥效和促進(jìn)植物的生長有著重要作用。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，碳氮比則以DC組最高，發(fā)酵組次之。

2.2 發(fā)酵牛糞、牛糞、輔料和土壤微生物群落的豐度及多樣性

由表2可知， 發(fā)酵組直接觀察到的物種數(shù)量平均是2 258，遠(yuǎn)高于其他4組， 最低組是堆場的粉碎青稞殼及灌木。物種組成的豐富度和均勻度（香農(nóng)指數(shù)）發(fā)酵組平均為8.978，遠(yuǎn)高于其他4組，其次是存儲多年的牛糞（NF）和新鮮牦牛糞（MN）。群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度（辛普森指數(shù)）也是發(fā)酵組最好，其次是MN組。此外，發(fā)酵組的Chao1指數(shù)最大。FJ1～FJ3的譜系多樣性平均值為212.129，遠(yuǎn)高于其他各組。

主坐標(biāo)分析（PCoA）是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)。為探究發(fā)酵土壤微生物組成的差異，基于加權(quán)Unifrac距離和非加權(quán)Unifrac距離來進(jìn)行PCoA，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示。圖2中結(jié)果表示FJ組和DC組物種組成結(jié)構(gòu)較相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，MN、NF和LL組的群落差異很大，樣品距離較遠(yuǎn)。

2.3 發(fā)酵牛糞、牛糞、輔料和土壤優(yōu)勢微生物群落組成

不同分類水平可以具體地反映發(fā)酵牛糞和組成原料微生物群落結(jié)構(gòu)狀態(tài)。本研究分別在門分

類水平上選擇前10位和屬分類水平上選擇前20位進(jìn)行菌群的組成和分類分析。從圖3可以看出，發(fā)酵牛糞組門水平的優(yōu)勢菌主要是擬桿菌門和蛋白菌門，而擬桿菌門又以鞘氨醇桿菌、類黃體桿菌和噬幾丁質(zhì)菌為優(yōu)勢菌，蛋白菌門則以特里門菌、克里索利亞菌、太白山菌為優(yōu)勢菌。存儲多年的牛糞組則和發(fā)酵牛糞組較為相似。新鮮牦牛糞便門水平優(yōu)勢菌是放線菌門、擬桿菌門和蛋白菌門，其中擬桿菌門中的不動桿菌和蛋白菌門的噬細(xì)胞菌為優(yōu)勢菌。

2.4 發(fā)酵牛糞、牛糞、輔料和土壤ARG的組成和豐度

根據(jù)前面16S rRNA基因組數(shù)據(jù)顯示，在牛糞堆肥發(fā)酵后，ARG的數(shù)量出現(xiàn)明顯的下調(diào)（圖4），與存儲的牛糞和新鮮的牦牛糞相比，尤其在四環(huán)素耐藥基因tetA，喹諾酮類耐藥基因qnrA，大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因ermB、ermF和ermQ，表現(xiàn)最為明顯，差異顯著（Plt;0.05）。此外，研究中也發(fā)現(xiàn)，作為海拔 4 500 m 的土壤，喹諾酮類耐藥基因qnrD、大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因ermQ、磺胺類抗性基因sul1和sul2相對粉碎青稞殼及灌木有較高的ARG豐度，這可能和土壤中牦牛的放牧排放有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述的結(jié)果，通過qPCR實(shí)時定量測定堆肥樣品中ARG的動態(tài)變化，結(jié)果與之前的16S rRNA基因組數(shù)據(jù)大體相符合，存儲的牛糞和新鮮的牦牛糞經(jīng)發(fā)酵后，總體在四環(huán)素耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因和大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因的ARG呈現(xiàn)明顯的下調(diào)，只在磺胺類抗性基因sul1和環(huán)內(nèi)脂類抗性基因ermQ下調(diào)不是太明顯（圖5）。

2.5 發(fā)酵牛糞、牛糞、輔料和土壤的代謝物組成變化

土壤中的代謝物質(zhì)包括酸、堿、酶、激素等，是植物生長的關(guān)鍵物質(zhì)，在維持土壤的生態(tài)環(huán)境中起著重要作用。通過LC-MS測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵組5-羥戊二酸（5-aminopentanoic acid）、D-阿爾法氨基丁酸（D-alpha-aminobutyric acid）、磷脂酰乙醇胺（PE）、卵磷脂（PC）的豐度明顯高于其他4組（圖6）。牛糞組的代謝物與當(dāng)?shù)赝寥老嘟咏?。新鮮的牦牛糞便則與其他組呈現(xiàn)完全不一樣的組分，主要是哌丁酸（pipecolic acid）、油酸乙酯（ethyl oleate）、亞甲基丁二酸（itaconic acid）、咪唑丙烯酸（urocanic acid）、6-羥基-1H-吲哚-3-乙酰胺（6-hydroxy-1h-indole-3-acetamide）、胞核嘧啶（cytosine）、環(huán)磷酸鹽堿（giycerophosphochaline）、科尼吉醌A（koeniginequinone A）、氨基戊二醛（5-aminopentanal）、L-亮氨酸（leucyl-lsoleucine）有較高豐度。經(jīng)過一段時間的存儲牛糞的代謝物則是磷脂酰乙醇胺（PE）、維西呋喃A（vitisifuran A）、棕櫚酰溶血磷脂酰乙醇胺（lyso PE）、三聚氰胺（melamine）、葡糖苷酰鞘氨醇（glucosylceramide）、N-棕櫚酰神經(jīng)鞘氨醇（N-palmitoylsphingosine）、去葡萄糖桂竹香毒甙（desglucocheirotoxin）有較高豐度。

3 討論與結(jié)論

牛糞的堆肥發(fā)酵有利于牛糞的資源化利用。因?yàn)榕＜S含有較高氮、磷、鉀等作物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且氮、磷、鉀的比例和植物生長并不完全匹配，有效氮、磷、鉀含量并不高［17］。此外，牛糞中含有大量的有機(jī)質(zhì)和氮，未經(jīng)處理直接排放會導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)腐敗和惡臭，直接還田則會超過土壤的自我處理能力，導(dǎo)致土壤出現(xiàn)厭氧發(fā)酵，溫度升高并提高其中亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量，引起土壤性狀和功能發(fā)生畸變，降低土壤質(zhì)量，并引起作物、苗木和花卉的燒苗現(xiàn)象［18-19］。而將牛糞進(jìn)行堆肥發(fā)酵，會提高土壤pH值的穩(wěn)定性和土壤的團(tuán)聚性，會提高水溶性碳、有效氮、有效磷、有效鉀含量，同時會調(diào)整碳氮比例［20-22］。有研究表明，不同堆肥階段的牛糞中水溶性碳含量在總碳中的比例均超出40%，經(jīng)堆肥后水溶性有機(jī)碳所占比例呈顯著上升趨勢，腐熟階段的總碳和水溶性碳含量變化不顯著［23］。此外，有研究報(bào)道牛糞在堆肥發(fā)酵腐熟階段總磷、總氮和總鉀含量都會出現(xiàn)降低，但有效磷、氮和有效鉀含量則出現(xiàn)明顯提高［24］。本研究中的牛糞在發(fā)酵過后，總磷、總氮含量下調(diào)，有效鉀含量則提高，這是因?yàn)榘l(fā)酵后，微生物消耗了部分的磷、氮和鉀，但釋放了較多的有效鉀。

牛糞的堆肥發(fā)酵，也是土壤中微生物群落的豐度和組成發(fā)生變化的過程。堆肥發(fā)酵的本質(zhì)是堆肥體內(nèi)各種微生物發(fā)生多種生化反應(yīng)，因此整個堆肥過程是堆肥體內(nèi)的各種微生物消長、有機(jī)物消化分解、物質(zhì)間的轉(zhuǎn)化和合成的過程［20-21］。發(fā)酵主導(dǎo)了牛糞微生物的變化。牛糞中微生物主要來自堆肥物料中帶來的大量的微生物，同時還包括從外部環(huán)境獲得的微生物，如水、空氣中攜帶的以及堆肥體外各種微生物。隨著堆肥中各階段有機(jī)物質(zhì)的分解及代謝，堆肥體系中各種生理和生化指標(biāo)不斷變化，不同微生物豐度變化漲漲落落，獨(dú)立或者其他微生物協(xié)同參與堆肥體物料中有機(jī)物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，促進(jìn)堆肥的腐熟［24］。堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與堆肥的腐熟程度是密切相關(guān)的，因此研究堆肥過程中微生物群落組成變化，有助于我們深入了解整個堆肥過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化具體的生物學(xué)機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥發(fā)酵后，其微生物多樣性的超爾指數(shù)、物種和香農(nóng)指數(shù)分別提高16.0%、17.6%和7.9%，表明發(fā)酵過程增加了α多樣性指數(shù)，使微生物多樣性增加［25］。本研究中發(fā)現(xiàn)，和MN、NF組相比，發(fā)酵后的牛糞α多樣性指數(shù)是升高的，這個結(jié)果說明我們采用添加部分復(fù)合微生物的膜發(fā)酵系統(tǒng)，可以較好地進(jìn)行發(fā)酵。此外，因?yàn)樵诙逊蔬^程中，也添加了一定量的青稞殼和灌木，合適的碳氨比和堆場的防風(fēng)、保溫，提高了堆肥發(fā)酵中微生物的增殖， 部分因高海拔和低溫不好增殖的

微生物，在條件改善后也明顯增加，最終表現(xiàn)在牛糞堆肥發(fā)酵的生物多樣性增加。

牛糞的堆肥發(fā)酵，降低了牛糞的ARG豐度。我國作為抗生素生產(chǎn)大國，也是抗生素使用大國。抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，導(dǎo)致近幾年因抗生素殘留問題嚴(yán)重影響民眾的身心健康［26］。而作為糞便中的抗生素抗性基因，是一種易被忽視的污染物，同樣非常有害。高海拔地區(qū)的牛糞受傳統(tǒng)和自然環(huán)境的影響，牛糞的無害處理較少、較難，因此牛糞中抗生素的ARG污染威脅較為嚴(yán)重［26-27］。之前有研究開展了青藏高原牦牛糞便ARG檢測，結(jié)果表明四環(huán)素耐藥基因、磺胺類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因、鏈霉素類耐藥基因、氯霉素類耐藥基因等10種，都有較高的檢出量［28］。堆肥中的抗生素ARG主要受抗生素和抗性微生物影響，在堆肥發(fā)酵的過程它們會部分降解抗生素，同時也殺滅并抑制抗性微生物，最終引起ARG豐度的下降［29］。本研究中發(fā)現(xiàn)相較于2組牛糞、堆肥發(fā)酵后牛糞的ARG豐度出現(xiàn)較為明顯下調(diào)，但其大環(huán)內(nèi)脂類抗性基因豐度則還是高于青稞殼灌木混合物以及高海拔土壤。但至于牛糞的堆肥發(fā)酵中哪些微生物介導(dǎo)了ARG豐度的下調(diào)和抗生素的分解，尚需進(jìn)一步的研究。此外，本次研究中發(fā)現(xiàn)高海拔土壤的ARG豐度也是相對較低，這在側(cè)面說明高海拔地區(qū)可能受抗生素污染的程度相對較低。

牛糞堆肥發(fā)酵后代謝物種類和高豐度物質(zhì)與土壤較為接近。本次研究發(fā)現(xiàn)新鮮的牛糞和存儲一段時間的牛糞的代謝組分豐度較高，都是以胺、醇和醚等物質(zhì)為主，這與牧草和糧食經(jīng)胃腸道初步消化后釋放半分解的物質(zhì)相關(guān)，這些物質(zhì)與植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如部分酸、鹽等不太匹配［30］。牛糞經(jīng)過發(fā)酵后釋放的代謝物種類和較高豐度物質(zhì)與土壤較為接近，與植物的生長所需物質(zhì)較為接近。

本研究通過研究高海拔牛糞微生物堆肥發(fā)酵后，引起的理化性質(zhì)、微生物菌落組成、抗生素抗性基因及代謝組分變化，發(fā)現(xiàn)高海拔的牛糞應(yīng)用微生物堆肥發(fā)酵后牛糞中有效磷和有效鉀含量明顯升高。微生物的多樣性和豐度呈現(xiàn)上調(diào)，抗生素的耐藥基因豐度則明顯下降，代謝組分與土壤較為接近。 這些結(jié)果為高海拔牛糞的資源化利用提供了參考。

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