玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸研究

L-蘋果酸作為一種重要的有機(jī)酸，在食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用和重要的作用。本研究以玉米秸稈水解液為原料，對L-蘋果酸產(chǎn)生菌米曲霉進(jìn)行了定向馴化，篩選出一株具有較高水解液毒性耐受能力及較高L-蘋果酸生產(chǎn)強(qiáng)度的馴化菌株C-28，對該菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選優(yōu)化，優(yōu)化后L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到84.7g/L，在5L發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵放大試驗(yàn)，發(fā)酵84hL-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到85.89g/L。

L-蘋果酸是一種重要的有機(jī)酸，化學(xué)式為C4H6O6，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，常用作食品酸味劑、抗氧化劑和酸度調(diào)節(jié)劑，還被廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

玉米秸稈是一種來自農(nóng)業(yè)廢棄物的可再生資源，對其進(jìn)行有效利用可以減少農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用，同時(shí)可以減少對傳統(tǒng)糧食作物的需求，緩解糧食危機(jī)。通過將玉米秸稈水解進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸，不僅可以生產(chǎn)有機(jī)酸產(chǎn)品，還可以利用其中的化學(xué)能作為生物能源，起到替代化石能源的作用，減少對可再生能源的依賴。米曲霉自身能夠表達(dá)水解生物質(zhì)的酶，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素等廉價(jià)生物質(zhì)資源的高值化轉(zhuǎn)化。本研究采用菌種定向馴化的方式，對L-蘋果酸生產(chǎn)菌株米曲霉進(jìn)行馴化選育，篩選耐高濃度玉米秸稈水解液的菌株，并通過發(fā)酵條件的優(yōu)化提高菌株發(fā)酵L-蘋果酸的產(chǎn)量。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

米曲霉（Aspergillus oryzae）A001，由新拓洋生物工程有限公司保存。玉米秸稈水解液，玉米秸稈經(jīng)酸解預(yù)處理、干燥、酶解、補(bǔ)料、抽濾、濃縮等過程，制備成高濃度玉米秸稈水解液。經(jīng)測定，其中含有葡萄糖：90.1g/L，木糖14.27g/L，纖維二糖4.42 g/L，阿拉伯糖0.89g/L，總還原糖109.7g/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：去皮鮮土豆200g煮沸約30min，過濾，在清液中加入20g葡萄糖、3g K2HPO4、1.5g MgSO4·7H2O、20g瓊脂粉定容至1L，自然pH。

秸稈水解液-產(chǎn)孢培養(yǎng)基：產(chǎn)孢培養(yǎng)基中葡萄糖更換為：玉米秸稈水解液220mL。

種液培養(yǎng)基：30g/L葡萄糖，6g/L胰蛋白胨，0.56g/L KH2PO4，0.56g/L K2HPO4，0.75g/L NaH2PO4·2H2O，0.75g/L Na2HPO4。

馴化培養(yǎng)基：6g/L胰蛋白胨，0.56g/L KH2PO4，0.56g/L K2HPO4，0.75g/L NaH2PO4·2H2O，0.75g/L Na2HPO4，玉米秸稈水解液30%-100%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：110g/L葡萄糖，12g/L胰蛋白胨，0.15g/L KH2PO4，0.196g/L K2HPO4·3H2O，70g/L CaCO3。

玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：12g/L胰蛋白胨，0.15mg/L KH2PO4，0.196g/L K2HPO4·3H2O，70g/L CaCO3。玉米秸稈水解液40%-100%。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件：115℃，20min，其中葡萄糖/玉米秸稈水解液單獨(dú)滅菌后與其余組分混合。

1.1.3 試劑

L-蘋果酸、木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品：Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-88C，上海知楚儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（LS-75HD，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent1260，SantaClara，CA，USA）；SBA-40E生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；5L發(fā)酵罐（上海楚怡生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

生孢培養(yǎng)：從融化的冷凍管中吸取適量孢子液，接種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，34℃，培養(yǎng)4-6天。

種子培養(yǎng)：培養(yǎng)成熟的斜面中加入適量無菌水洗下孢子，過濾后制成一定濃度的孢子懸液。將孢子懸液接種于裝液量為30mL的250mL三角瓶中，使孢子終濃度為1.5×106個(gè)/mL，37℃，200rpm，培養(yǎng)14h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：吸取5mL種液于250mL發(fā)酵搖瓶中，裝液量40mL，30℃，200rpm培養(yǎng)6天。

1.2.2 馴化篩選方法

將制備好的孢子懸液接種于馴化培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)14h，之后每12h采用液液轉(zhuǎn)接的方式傳代一次，每轉(zhuǎn)接3次，取新鮮菌液接種秸稈水解液-產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板，挑選生長快的菌落，制備孢子懸液，按以上步驟循環(huán)持續(xù)馴化，當(dāng)馴化培養(yǎng)基中生物量達(dá)到種液培養(yǎng)基中生物量水平時(shí)提高馴化培養(yǎng)基中水解液含量。

經(jīng)過若干代馴化后，將菌液涂布秸稈水解液-產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板，挑選出若干生長優(yōu)良的單菌落，分別接種于斜面培養(yǎng)基，待斜面孢子成熟后，進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子長好后接種玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，從中篩選產(chǎn)酸較高的菌株。

1.2.3 分析方法

葡萄糖的測定：樣品14000rpm離心5min，上清液稀釋后生物傳感分析儀進(jìn)行檢測。有機(jī)酸含量的測定：待測發(fā)酵液加入等體積2NHCl以溶解未消耗完的CaCO3和沉淀的有機(jī)酸，離心去菌體，濾液稀釋數(shù)倍后經(jīng)0.22um水系膜過濾后待測。采用高效液相色譜法，有機(jī)酸檢測柱，流動(dòng)相為5mM稀硫酸，柱溫60℃，流速0.6mL/min，紫外檢測器，波長為210nm。生物量測定：取適量發(fā)酵液加入等體積2NHCl，用濾紙過濾，再用去離子水洗滌菌體3遍，抽濾后65℃烘干至恒重，稱重法測定生物量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 玉米秸稈水解液發(fā)酵菌株的篩選

在玉米秸稈水解液中，除葡萄糖外，還含有木糖、阿拉伯糖，以及乙酸、糠醛、酚類物質(zhì)等發(fā)酵抑制物。如果毒性超過菌種的耐受能力，其生長與生理代謝將會受到影響，最終使得目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵受抑制而無法進(jìn)行。經(jīng)過30代的馴化，篩選出31株菌株進(jìn)行玉米秸稈水解液搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，L-蘋果酸產(chǎn)量較高的菌株有C-28、C-22、C-19，分別為67.3g/L、66.69g/L、66.02g/L，均高于出發(fā)菌株的32.01g/L。其中，C-28的糖酸轉(zhuǎn)化率最高，為81%，是出發(fā)菌株的1.62倍，因此選定C-28為玉米秸稈水解液發(fā)酵出發(fā)菌株。

2.2 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)考察不同氮源對100%玉米秸稈水解液發(fā)酵L-蘋果酸產(chǎn)量的影響。按照含氮量進(jìn)行折算，以大豆蛋白胨、豆粕粉、黃豆粉、玉米漿、酵母浸粉、尿素、硫酸銨等量替換培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，分別配制培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，以豆粕粉為氮源時(shí)，L-蘋果酸產(chǎn)量最高，其次是胰蛋白胨和大豆蛋白胨，而其它幾種氮源黃豆粉、酵母浸粉、硫酸銨和尿素產(chǎn)量較低，特別是硫酸銨和尿素明顯不利于L-蘋果酸的合成，因此確定氮源為豆粕粉。

2.3 CaCO3質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸的影響

碳酸鈣在米曲霉發(fā)酵L-蘋果酸的過程中起著重要的作用，包括調(diào)節(jié)pH值、提供碳源、增加穩(wěn)定性和改善產(chǎn)品質(zhì)量等方面，有助于提高L-蘋果酸的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L的CaCO3進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可知，CaCO3質(zhì)量濃度為80g/L時(shí)L-蘋果酸的產(chǎn)量最高為84.7g/L，隨著CaCO3質(zhì)量濃度的增加，L-蘋果酸產(chǎn)量沒有增加，且對葡萄糖得率呈下降趨勢，因此確定CaCO3質(zhì)量濃度為80g/L。

2.4 5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵放大試驗(yàn)

經(jīng)過搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，進(jìn)一步在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在米曲霉發(fā)酵12h后，L-蘋果酸開始大量產(chǎn)生，48-60hL-蘋果酸生成速率達(dá)到最大，84h葡萄糖消耗完，L-蘋果酸的產(chǎn)量達(dá)到最高值85.89g/L，此時(shí)L-蘋果酸生成速率為1.02g／（L·h）。

結(jié)論

通過對L-蘋果酸產(chǎn)生菌米曲霉的定向馴化，篩選出一株具有較高水解液毒性耐受能力及較高蘋果酸生產(chǎn)強(qiáng)度的馴化菌株C-28，對該菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到84.7g/L，在5L發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵放大試驗(yàn)，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到85.89g/L。利用玉米秸稈水解液作為發(fā)酵原料生產(chǎn)L-蘋果酸不僅有利于資源利用和能源生產(chǎn)，還可以緩解糧食危機(jī)，同時(shí)符合環(huán)境友好的生產(chǎn)理念，具有重要的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

作者簡介

楊林（1982.10-），男，漢族，河北保定人，本科，工程師；研究方向：發(fā)酵工程。

*通訊作者

張建國（1972.11-），男，漢族，河南駐馬店人，本科，高級工程師；研究方向：生物化工。