基于非靶向代謝組學(xué)挖掘兩種日糧模式下蛋雞回腸代謝物的差異

張應(yīng)胡 秦緒光 馬麗 王皓杰 胡玲 田光明

摘要：為探究飼喂基礎(chǔ)日糧（CON）和含5.0%益生菌發(fā)酵飼料（PFF）2種日糧條件下蛋雞回腸內(nèi)容物代謝物差異，采用液相色譜-質(zhì)譜和非靶向代謝組學(xué)相結(jié)合的方法，檢測(cè)2種日糧條件下蛋雞回腸中代謝產(chǎn)物，通過(guò)差異代謝物篩選和KEGG富集分析，篩選出蛋雞回腸中的差異代謝物及代謝通路。結(jié)果表明，與CON組相比，PFF組中膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸等膽汁酸含量顯著降低，異亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-谷氨酸-纈氨酸-谷氨酸、亮氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-賴(lài)氨酸等小肽含量顯著增加；KEGG通路富集分析表明，代謝物主要與膽汁分泌、初級(jí)膽汁酸生物合成等通路相關(guān)，初級(jí)膽汁酸在宿主脂質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的消化代謝、抗氧化狀態(tài)、膽固醇代謝和宿主-微生物相互作用中發(fā)揮重要作用。蛋雞日糧中添加益生菌發(fā)酵飼料可通過(guò)改變腸道代謝產(chǎn)物來(lái)改善腸道吸收功能。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵飼料；蛋雞；回腸代謝產(chǎn)物；非靶向代謝組學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.5? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0213-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.035 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Exploring the differences in ileal metabolites of laying hens under two different dietary patterns based on non targeted metabolomics

ZHANG Ying-hu1， QIN Xu-guang2， MA Li1， WANG Hao-jie1， HU Ling1， TIAN Guang-ming1

（1.College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou? 434025， Hubei， China； 2.Rizhao Animal Disease Prevention and Control Center， Rizhao? 276826， Shandong， China）

Abstract： To investigate the differences in metabolites in the ileum contents of laying hens fed with two different dietary conditions： basal diet （CON） and fermented feed containing 5.0% probiotics （PFF），a combination of liquid chromatography-mass spectrometry and non targeted metabolomics was used to detect metabolites in the ileum of laying hens under two different dietary conditions. Differential metabolite screening and KEGG enrichment analysis were performed to screen for differential metabolites and metabolic pathways in the ileum of laying hens. The results showed that compared with the CON group， the content of bile acids such as bile acid， taurine goose deoxycholic acid， and goose deoxycholic acid in the PFF group was significantly reduced， while the content of small peptides such as isoleucine-leucine-glycine-alanine， phenylalanine-glutamate-valine-glutamate， and leucine-tyrosine-threonine-lysine was significantly increased；KEGG pathway enrichment analysis showed that metabolites were mainly related to pathways such as bile secretion and primary bile acid biosynthesis. Primary bile acids played important roles in the digestion and metabolism of host lipids and lipophilic substances， antioxidant status， cholesterol metabolism， and host-microbial interactions. Adding probiotic fermented feed to the diet of laying hens could improve intestinal absorption function by altering intestinal metabolites.

Key words：fermented feed； laying hens； ileal metabolites； non-targeted metabolomics

蛋雞養(yǎng)殖是中國(guó)畜禽行業(yè)的重要組成部分。然而，在集約化養(yǎng)殖中蛋雞運(yùn)動(dòng)受限，導(dǎo)致蛋雞腸道代謝性能下降，降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收效率，進(jìn)而降低了生產(chǎn)性能。育雛期是蛋雞養(yǎng)殖的關(guān)鍵時(shí)期，該時(shí)期的蛋雞與其他畜禽相比消化道較短，未完全發(fā)育的腸道免疫力較弱，腸道消化吸收與屏障功能易受影響。有研究表明，飼喂益生菌發(fā)酵飼料能夠減少抗生素的使用，提高畜禽生產(chǎn)性能、機(jī)體免疫力及產(chǎn)品品質(zhì)等［1，2］。目前，發(fā)酵飼料在蛋雞中的研究集中在生產(chǎn)性能、血清指標(biāo)、腸道組織形態(tài)及腸道微生物菌群等方面［3，4］，而益生菌發(fā)酵飼料如何影響蛋雞腸道代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究較少。

代謝組學(xué)可以對(duì)生物體液、細(xì)胞和組織中的代謝物進(jìn)行分析，通常用作生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的工具［5］。腸道代謝物能夠調(diào)控機(jī)體新陳代謝和炎癥反應(yīng)等，通過(guò)對(duì)代謝物的定性、定量及差異分析，有助于尋找代謝物與生物過(guò)程之間的聯(lián)系［6］。近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜禽行業(yè)，Huang等［7］基于血清代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)飼喂發(fā)酵飼料仔豬血清中的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和乳酸水平顯著升高。Chen等［8］利用非靶向和靶向代謝組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-去甲亮氨酸可以作為雞腸炎沙門(mén)氏菌污染的生物標(biāo)志物。然而，使用代謝組學(xué)進(jìn)行蛋雞腸道代謝物研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）結(jié)合非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，以飼喂基礎(chǔ)日糧（CON）和含5.0%益生菌的發(fā)酵飼料（PFF）2組蛋雞回腸內(nèi)容物為試驗(yàn)材料，通過(guò)篩選找出差異代謝物，并對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路分析。旨在探究益生菌發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞腸道代謝產(chǎn)物的影響及相關(guān)代謝通路的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

選擇體重相近的1日齡蛋雞（京粉1號(hào)）180只，隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只，雞舍光照和溫度根據(jù)養(yǎng)殖指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行調(diào)整，蛋雞自由飲水采食。對(duì)照組（CON）飼喂基礎(chǔ)日糧（基礎(chǔ)日糧成分如表1、表2所示），試驗(yàn)組（PFF）將5.0%基礎(chǔ)日糧替換為益生菌發(fā)酵飼料，參考Guo等［9］的方法制備益生菌發(fā)酵飼料。試驗(yàn)第42天，在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選擇1只雞。將雛雞頸椎脫臼法安樂(lè)死，收集2～3 g回腸內(nèi)容物至凍存管中，液氮速凍，-80 ℃存儲(chǔ)，以備下一步分析。

1.2 回腸內(nèi)容物代謝組檢測(cè)與分析

1.2.1 樣本處理與檢測(cè) 冰上解凍樣品，取20 mg樣品加入400 μL 70%甲醇水內(nèi)標(biāo)提取液，渦旋3 min，冰浴超聲波10 min，渦旋1 min，于-20 ℃靜置30 min后離心去除沉淀。取上清液在4 ℃ 12 000 r/min條件下離心3 min，取200 μL上清液進(jìn)行LC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；采用二元流動(dòng)相洗脫，流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫方法如表3所示。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析 通過(guò)ProteoWizard軟件將LC-MS獲取的原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzML格式。用XCMS程序分別進(jìn)行峰提取、峰對(duì)準(zhǔn)和保留時(shí)間校正。采用支持向量回歸（SVR）方法對(duì)峰面積進(jìn)行校正。過(guò)濾每組樣品中檢出率低于50%的峰，并通過(guò)檢索實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)、綜合公共數(shù)據(jù)庫(kù)、AI數(shù)據(jù)庫(kù)及metDNA方法得到代謝物鑒定信息。

以變量投影重要性（Variable importance in projection，VIP）和差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）為條件進(jìn)行差異代謝物的篩選（VIP≥1，|Log2FC|≥1.0）。使用KEGG Compound數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行標(biāo)注，然后映射到KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道代謝產(chǎn)物總覽

本試驗(yàn)選取2組共12個(gè)樣品進(jìn)行代謝研究，共檢測(cè)到8 125個(gè)代謝物，正、負(fù)離子模式下分別有? ? 4 697、3 428個(gè)代謝物。對(duì)所有的代謝化合物進(jìn)行分類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，正離子模式下主要為氨基酸及其代謝產(chǎn)物（24.78%）、苯及其取代衍生物（14.12%）、雜環(huán)化合物（13.31%）、有機(jī)酸及其衍生物（7.45%）等；負(fù)離子模式下主要為苯及其取代衍生物（15.61%）、氨基酸及其代謝產(chǎn)物（14.47%）、雜環(huán)化合物（14.00%）、有機(jī)酸及其衍生物（11.41%）等（圖1）。

2.2 差異代謝物結(jié)果的判斷

OPLS-DA模型分析結(jié)果如圖2所示，通過(guò)200次的隨機(jī)組合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)正離子模式下模型R2X=0.457、Q2=0.675、R2Y=1.000，負(fù)離子模式下模型R2X=0.448、Q2=0.658、R2Y=1.000。2個(gè)模式下的Q2都大于0.500，表明模型有效；R2Y的P都低于0.005，表明該模型可根據(jù)VIP分析篩選差異代謝物。

2.3 差異代謝物火山圖

利用t檢驗(yàn)和變異系數(shù)法比較2組代謝產(chǎn)物之間的差異，在VIP+FC雙重篩選條件下，對(duì)正、負(fù)離子模式下檢測(cè)到的所有代謝物進(jìn)行差異分析，采用火山圖進(jìn)行可視化展示（圖3），CON組和PFF組在正、負(fù)離子模式下篩選出的差異表達(dá)代謝物分別為337、253個(gè)，其中正離子模式下差異代謝物有93個(gè)上調(diào)、244個(gè)下調(diào)，負(fù)離子模式下差異代謝物有44個(gè)上調(diào)、209個(gè)下調(diào)，部分差異代謝物如表4所示。

2.4 差異代謝物KEGG富集分析

對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG pathway富集分析，P越接近于0，表示富集越顯著，圖中點(diǎn)的大小代表富集到相應(yīng)通路上的差異代謝物個(gè)數(shù)。由圖4可知，正離子模式下的差異基因顯著富集在初級(jí)膽汁酸生物合成（Primary bile acid biosynthesis）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、類(lèi)固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）等KEGG信號(hào)通路。負(fù)離子模式下的差異代謝物顯著富集在初級(jí)膽汁酸生物合成（Primary bile acid biosynthesis）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、膽汁分泌（Bile secretion）等KEGG信號(hào)通路。綜合分析發(fā)現(xiàn)，在正、負(fù)離子下膽汁酸相關(guān)差異代謝物顯著下降，并顯著富集在初級(jí)膽汁酸生物合成、膽汁分泌等KEGG信號(hào)通路。

3 討論

本研究對(duì)飼喂基礎(chǔ)日糧和發(fā)酵飼料的2組蛋雞回腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行代謝組比較分析。結(jié)果顯示，發(fā)酵飼料組蛋雞腸道中590個(gè)代謝物發(fā)生顯著變化，其中，正、負(fù)離子模式下篩選出的差異表達(dá)代謝物分別為337、253個(gè)。KEGG通路富集分析表明，代謝物主要與膽汁分泌、初級(jí)膽汁酸生物合成等通路相關(guān)。初級(jí)膽汁酸在宿主脂質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的消化代謝、抗氧化狀態(tài)、膽固醇代謝和宿主-微生物相互作用中發(fā)揮重要作用。膽汁酸可與細(xì)胞質(zhì)G蛋白偶聯(lián)受體TGR5（TGR5/M-bar）和核法尼醇X受體（FXR）結(jié)合調(diào)節(jié)脂肪、葡萄糖和能量消耗的代謝［10］。Yang等［11］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)飲食、糞便微生物菌群移植等方式調(diào)控膽汁酸、腸道菌群可以緩解炎癥性腸病，表明腸道菌群和膽汁酸在腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥中起著關(guān)鍵作用。本研究中，富集于膽汁分泌、初級(jí)膽汁酸生物合成通路的膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰岷匡@著下降，且蛋雞未出現(xiàn)消瘦、消化不良等癥狀?？赡茉蚴窃囼?yàn)對(duì)象為健康蛋雞，其腸道處于正常狀態(tài)，沒(méi)有炎癥發(fā)生，同時(shí)發(fā)酵飼料中益生菌可助力營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化，因此膽汁酸分泌低于CON組，但其具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)PFF組中氨基酸及其代謝產(chǎn)物相比CON組差異顯著。氨基酸在生物體中合成蛋白質(zhì)不可或缺，并可影響代謝生理學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)，在宿主與微生物互作中充當(dāng)重要的角色。腸道微生物合成氨基酸是促進(jìn)宿主氨基酸穩(wěn)態(tài)的重要方式，Lin等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群可以合成多種營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸，這是氨基酸穩(wěn)態(tài)的潛在調(diào)節(jié)因素。谷氨酸、精氨酸、脯氨酸可以在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化，并發(fā)揮重要作用的生理作用［13］，例如，日糧丙氨酸補(bǔ)充劑改善了肉雞的生長(zhǎng)性能和肌肽含量，改善了抗氧化能力和肉質(zhì)，上調(diào)了肌肽合成相關(guān)酶的基因表達(dá)［14］。谷氨酸在提高家禽生長(zhǎng)性能、生產(chǎn)性能及飼料效率方面作用顯著［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PFF組蛋雞腸道中的異亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-谷氨酸-纈氨酸-谷氨酸、亮氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-賴(lài)氨酸等物質(zhì)顯著上調(diào)，表明飼喂發(fā)酵飼料可以增加回腸中氨基酸含量，從而促進(jìn)蛋雞生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能。

4 小結(jié)

本研究運(yùn)用非靶向代謝組學(xué)結(jié)合LC-MS的方法，研究了2種日糧模式下蛋雞腸道內(nèi)容物代謝產(chǎn)物的變化。結(jié)果表明，飼喂發(fā)酵飼料減少了蛋雞回腸內(nèi)容物膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、鵝去氧膽酸等膽汁酸含量，增加了回腸中氨基酸的含量。

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