羊布魯氏菌的實驗室診斷及綜合防治措施實施探討

范冬梅 韋丹標(biāo) 阿依努爾·肉孜

DOI： 10.3969/j.issn.1003-1650.2024.18.035

布魯氏桿菌病屬于人畜共患傳染性疾病的范疇，不僅具有很強的傳染能力，而且傳播方式多種多樣，特別是在羊養(yǎng)殖管理過程中，一旦感染該種疾病將會對羊的健康生長造成影響，尤其是會對繁殖母羊的生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，嚴(yán)重影響到養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。近年來，隨著羊養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大，基層地區(qū)的很多養(yǎng)殖戶在對外引種過程中沒有執(zhí)行嚴(yán)格的檢疫規(guī)程，存在僥幸心理，導(dǎo)致布魯氏桿菌從外地引入的風(fēng)險極大增強，對本地區(qū)羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重危害。為切實保障羊布魯氏桿菌病的防控成效和防治質(zhì)量，在養(yǎng)殖管理期間就需要提高重視程度，注重加強布魯氏桿菌病的科學(xué)診斷，通過科學(xué)的病原分離鑒定，及時確定病情，然后實施綜合防治措施，將布魯氏桿菌病的發(fā)生流行率降低到最低程度。本文主要結(jié)合實際工作經(jīng)驗，在對羊布魯氏桿菌病發(fā)病現(xiàn)狀進(jìn)行探討的基礎(chǔ)上，明確了該種疾病的流行特點危害以及診斷方法，并提出了綜合防治措施，希望對更好地提高不僅是桿菌病的防控成效有一定幫助。

一、流行病學(xué)

1、病原學(xué)

羊布魯氏桿菌病簡稱羊布病，是由布魯氏桿菌引起的人畜共患慢性傳染病。病原菌布魯氏桿菌屬于細(xì)菌界，革蘭氏染色陰性，為需氧型細(xì)菌，不具備芽孢和莢膜結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下觀察，布魯氏桿菌通常呈球桿狀，且在細(xì)胞內(nèi)可見。布魯氏桿菌對環(huán)境的抵抗力較強，能在土壤、水中存活數(shù)月，在干燥土壤中的存活時間約為1個月。在寒冷的環(huán)境中，其存活時間可長達(dá)6個月。該菌對高溫、消毒劑和光照的抵抗力相對較弱。根據(jù)布魯氏桿菌的生物學(xué)特性和致病性進(jìn)行的可以將其劃分成羊種布魯氏桿菌、牛種布魯氏桿菌、豬種布魯氏桿菌、狗種布魯氏桿菌等幾種。

2、致病機理

布魯氏桿菌主要通過接觸感染動物的血液、體液、分泌物或排泄物而傳播。在養(yǎng)殖環(huán)境中由于羊與帶菌動物的未經(jīng)處理的流產(chǎn)胎兒、糞便、尿液等接觸，使得布魯氏桿菌得以傳播。布魯氏桿菌進(jìn)入羊體后，依靠其表面抗原和毒素，逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，然后通過血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)傳播到全身多個組織和器官，但主要侵害生殖系統(tǒng)和關(guān)節(jié)。通常情況下布魯氏桿菌通過表面的侵襲素和黏附素，與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而侵入宿主細(xì)胞。并且布魯氏桿菌能有效逃避宿主的天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，細(xì)菌在宿主體內(nèi)存在時，能通過多種通道分泌抑制炎癥反應(yīng)因子等多種機制抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用和殺菌能力，細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素和外毒素對宿主細(xì)胞具有破壞作用，導(dǎo)致組織損傷和炎癥反應(yīng)。一般情況下，布魯氏桿菌呈現(xiàn)慢性感染，導(dǎo)致羊的生產(chǎn)力下降、繁殖障礙和生長遲緩。在慢性感染過程中，細(xì)菌在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，與宿主免疫系統(tǒng)形成平衡，使得感染難以根除。

3、流行特點

羊布魯氏桿菌病的主要傳染源是病羊和帶菌羊，布魯氏桿菌可以在羊的皮毛、糞便、分泌物、肌肉組織以及羊水、流產(chǎn)胎兒和精液中找到。健康羊群通過接觸或食用被病原污染的飲用水和飼料，或者通過與病羊的直接接觸，或接觸被病原污染的物品而感染。在空氣中布魯氏桿菌通過呼吸道進(jìn)入健康羊體內(nèi)，此外配種或人工授精過程中，病原也可以通過生殖道傳播。除了羊之外牛、豬、鹿、馬、犬等均為布魯氏桿菌的易感宿主。其中羊?qū)υ摬〉囊赘行宰罡?，尤其是性成熟的母羊，其易感性通常顯著高于公羊，公羊可能成為攜帶病原菌或隱性發(fā)病的宿主。從流行季節(jié)來看布魯氏菌病沒有典型的季節(jié)性，一年四季都有可能發(fā)生。不過在羊養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)可能因氣候、飼養(yǎng)管理方式等因素呈現(xiàn)出地方性的季節(jié)性流行趨勢。從布魯氏桿菌病的流行原因角度來看，不良的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件密度過大、營養(yǎng)不良、圈舍衛(wèi)生差等都可能促進(jìn)病原的傳播。生物媒介雖然不是主要傳播途徑，但環(huán)境污染較為嚴(yán)重，環(huán)境當(dāng)中存在大量的吸血昆蟲如蚊子、蜱等也可能參與傳播布魯氏桿菌。此外，飼養(yǎng)管理人員個人防護(hù)不足，頻繁接觸病畜或其排泄物，也可能導(dǎo)致病原傳播。

二、臨床癥狀

羊布魯氏桿菌病的潛伏期長短不一，一般為2周～6個月，但有時也可能長達(dá)1年。發(fā)病期間母羊流產(chǎn)是該類疾病最典型的臨床癥狀之一。感染布氏桿菌的妊娠母羊通常在懷孕的第3～4個月會出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。流產(chǎn)前患病羊可能出現(xiàn)食欲減退、飲水量增加、精神萎靡不振等癥狀，從陰道中分泌出淡黃色液體。流產(chǎn)的胎兒可能是死胎或呈現(xiàn)僵尸胎現(xiàn)象，即出生后立即死亡但外觀無明顯異常的胎兒。胎衣可能呈現(xiàn)黃色膠凍狀浸潤，胎衣顯著增厚，并存在散在出血點。配種公羊可能出現(xiàn)睪丸炎，睪丸堅硬、硬化。羔羊和育成羊在少數(shù)情況下也會出現(xiàn)敗血癥癥狀，黏膜和膠膜上出現(xiàn)大量出血點，皮下和肌肉組織出現(xiàn)漿液性浸潤，全身淋巴結(jié)腫大等。

三、病理學(xué)變化

病原菌首先感染羊的生殖系統(tǒng)，引起生殖器官的炎癥。初期感染部位的黏膜充血、水腫，伴有黏液性或膿性分泌物。隨著病程的發(fā)展，炎癥逐漸加重，組織壞死，形成潰瘍。后期病變部位的纖維組織增生，導(dǎo)致生殖器官變形，功能減退。關(guān)節(jié)受到病原入侵之后，初期關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)漿液性或漿液纖維素性炎癥，伴有發(fā)熱、疼痛等癥狀。隨后關(guān)節(jié)炎癥加重，關(guān)節(jié)軟骨和骨組織受到破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛加劇，活動受限。最終關(guān)節(jié)僵硬，功能喪失。同時布魯氏桿菌還會對肝臟脾臟淋巴結(jié)造成嚴(yán)重危害，癥狀較輕時肝、脾、淋巴結(jié)腫大，質(zhì)地變硬。病程加重之后肝、脾、淋巴結(jié)實質(zhì)細(xì)胞壞死，形成潰瘍。后期病變部位的纖維組織增生，使肝、脾、淋巴結(jié)變形，功能減退。有些患病羊在發(fā)病期間還會表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)病變，神經(jīng)組織充血、水腫，伴有漿液性或膿性分泌物，隨后炎癥逐漸加重，神經(jīng)組織壞死，形成潰瘍，有時在病變部位還能夠看到纖維組織增生，導(dǎo)致神經(jīng)組織受壓、變形，功能減退。

四、實驗室診斷

1、病原分離培養(yǎng)

對于細(xì)菌性疾病，病原分離培養(yǎng)是診斷該類疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于布魯氏桿菌具有特殊的侵染環(huán)境，主要在動物細(xì)胞當(dāng)中繁殖生長，因此細(xì)菌分離培養(yǎng)難度相對較大，尤其是對于慢性布魯氏桿菌病幾乎無效，通常不能夠從病料當(dāng)中分離到致病源。一般細(xì)菌分離培養(yǎng)主要用于羊種布魯氏桿菌病和豬種布魯氏菌病的鑒別診斷，很少用于其他種布魯氏桿菌病的鑒別。在分離培養(yǎng)過程中，布魯氏桿菌的菌落生長困難并且生長緩慢。一般布魯氏桿菌的典型菌落為圓形或類圓形，直徑1～2mm，剛分離的菌落呈灰白色或乳白色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落顏色逐漸加深，變?yōu)榈S色或黃褐色，菌落表面光滑，邊緣規(guī)則，質(zhì)地柔軟，黏附性強，不易乳化，半透明或不透明，屬于需氧菌，適宜生長溫度為37℃，pH為6.6～7.4。在血瓊脂平板上布魯氏桿菌菌落呈灰白色或乳白色，周圍有輕度β-溶血環(huán)。并且在進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)過程中需要在生物安全二級實驗室（BSL-2）中進(jìn)行。

2、染色鏡檢

布魯氏桿菌在進(jìn)行染色鏡檢過程中，常規(guī)的染色劑如革蘭氏染色劑不能夠很好地將其著色，在顯微鏡下能夠觀察到革蘭氏陰性染色的布魯氏桿菌，但是染色不明顯，尤其是細(xì)胞壁和莢膜染色不明顯。瑞士染色劑能夠更加清楚地顯示布魯氏桿菌的莢膜，染色之后細(xì)胞呈淡紅色，莢膜被染成深藍(lán)色，包圍著細(xì)胞。

3、血清診斷

①虎紅平板凝集試驗

檢測原理是將待檢血清滴加到含有虎紅細(xì)胞和布魯氏桿菌抗原的平板上，如果血清中存在布魯氏桿菌抗體，抗體會與抗原結(jié)合，導(dǎo)致虎紅細(xì)胞凝集。操作過程中取一個無菌培養(yǎng)皿，在皿底平鋪一層虎紅細(xì)胞懸液。將待檢血清按一定稀釋度（如1∶20、1∶40、1∶80）滴加到虎紅細(xì)胞懸液上，每個稀釋度滴加一滴，培養(yǎng)皿置于37℃孵育18～24h。完全凝集，形成明顯的小顆粒，培養(yǎng)皿底部呈均勻紅色表示為陽性，無明顯凝集，呈均勻分布狀態(tài)，培養(yǎng)皿底部呈鮮紅色表示為陰性。部分凝集形成小團(tuán)塊或細(xì)小的懸浮顆粒，可能存在假陽性的血清凝集結(jié)果，需要進(jìn)一步稀釋血清進(jìn)行復(fù)查。

②試管凝集試驗

試管凝集試驗原理是將待檢血清與已知濃度的布魯氏桿菌抗原混合，如果血清中存在布魯氏桿菌抗體，抗體會與抗原結(jié)合，導(dǎo)致抗原凝集沉淀。取一個試管，加入待檢血清和一定量的布魯氏桿菌抗原，將試管置于37℃水浴中孵育2h，取出試管，觀察結(jié)果。試管底部出現(xiàn)明顯的凝集沉淀為陽性，底部無明顯凝集沉淀判定為陰性，底部出現(xiàn)細(xì)小的凝集物或渾濁表示可疑，需要進(jìn)一步進(jìn)行檢測。

③補體結(jié)合試驗

操作過程中采集受檢動物的血清，使用已知的布魯氏桿菌抗原，使用新鮮的小白鼠血清作為補體來源，將血清、抗原、補體和生理鹽水按一定比例混合，孵育一定時間，然后加入溶血系統(tǒng)（紅細(xì)胞和抗紅細(xì)胞血清），觀察溶血現(xiàn)象。血清中含有針對布魯氏桿菌抗原的補體結(jié)合抗體，溶血系統(tǒng)不發(fā)生溶血，補體結(jié)合滴度≥1∶8為陽性，血清中不含有針對布魯氏桿菌抗原的補體結(jié)合抗體，溶血系統(tǒng)發(fā)生溶血，補體結(jié)合滴度<1∶8為陰性。

五、疫情處置

在進(jìn)行羊布魯氏桿菌病疫情處置過程中，一定要嚴(yán)格執(zhí)行國家法律法規(guī)，詳細(xì)按照《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國動物防疫法》《布魯氏桿菌病防治技術(shù)規(guī)范》《布魯氏桿菌病疫情應(yīng)急預(yù)案》的相關(guān)要求建成議程處置。任何單位和個人發(fā)現(xiàn)疑似或確診布病疫情時，應(yīng)立即向當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門和動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)報告，通過嚴(yán)格的診斷確定疫情之后根據(jù)疫情嚴(yán)重程度和擴散情況，劃定疫點、疫區(qū)和受威脅區(qū)，對疫點進(jìn)行隔離，禁止動物及其產(chǎn)品移動，防止疫情擴散，對檢測為陽性的羊群立即進(jìn)行撲殺淘汰處理，患病動物接觸的環(huán)境物品進(jìn)行消毒，推薦使用2%的氫氧化鈉溶液，2%的復(fù)合酚溶液，10%的生石灰乳進(jìn)行交替消毒。病羊的流產(chǎn)物和死畜需要進(jìn)行深埋處理，污染的環(huán)境則可用20%的漂白粉或10%的石灰乳進(jìn)行消毒。病畜的乳制品需煮沸消毒，皮毛則可用過氧乙烷熏蒸消毒，并放置3個月以上再運出疫區(qū)。同時，應(yīng)將病羊和健康羊只分群分區(qū)放牧，病羊用過的牧場需經(jīng)過3個月的自然凈化后才能供健康羊只使用。在封鎖隔離期間，對受到威脅地區(qū)的養(yǎng)殖場應(yīng)該進(jìn)行緊急免疫接種，選擇使用國家推薦的M5株或者S9株疫苗進(jìn)行免疫接種，每只羊使用1mL，保護(hù)期三年。持續(xù)加強疫區(qū)內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)疑似患病病例之后應(yīng)該及時撲殺處理，逐步對羊群做出有效的凈化。發(fā)病養(yǎng)殖場的檢測為陰性的羊群，應(yīng)該單獨隔離，不能用于配種，應(yīng)該立即進(jìn)行育肥，及時淘汰。通過多年有效凈化處理，確保疫區(qū)內(nèi)的養(yǎng)殖場能夠逐步達(dá)到地區(qū)和國家級凈化標(biāo)準(zhǔn)，并在凈化處理過程中對疫區(qū)內(nèi)外進(jìn)行監(jiān)測，評估疫情控制效果。同時，對從事布病監(jiān)測、防治工作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，普及布病防治知識，提高公眾和養(yǎng)殖戶的自我防護(hù)意識和能力，對每次疫情處置完畢后進(jìn)行總結(jié)，評估效果，不斷完善疫情處置方案。

六、預(yù)防措施

為了有效預(yù)防羊布病，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶堅持自繁自養(yǎng)，盡量不引進(jìn)帶菌的羊只，防止引入布病，若必須引種，一定要按照相關(guān)技術(shù)規(guī)程開展針對性的引種檢查，防范像布魯氏桿菌病這類傳染性疾病傳入到養(yǎng)殖場內(nèi)部，保證羊群健康安全。一般在引種檢疫過程中，應(yīng)該嚴(yán)格執(zhí)行國家法律法規(guī)，嚴(yán)格遵守《中華人民共和國動物防疫法》《中華人民共和國進(jìn)出境動植物檢疫法》《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》《動物疫情報告和通報辦法》。在引種前對來源地進(jìn)行風(fēng)險評估，了解當(dāng)?shù)氐牟疾∫咔榇_保從無疫病地區(qū)引種，然后向當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門申請引種，提交包括引種地布病疫情、引種場地的獸醫(yī)衛(wèi)生狀況等材料，并對羊只進(jìn)行健康檢查，包括布病在內(nèi)的相關(guān)疫病檢測，必須由官方認(rèn)可的獸醫(yī)機構(gòu)進(jìn)行。到達(dá)養(yǎng)殖場的引種羊只應(yīng)隔離觀察至少45天，其間要進(jìn)行定期健康監(jiān)測，確保沒有攜帶布病，并在隔離觀察期間，根據(jù)所在地區(qū)的疫病流行趨勢進(jìn)行疫苗免疫接種，以防止疫病傳播。經(jīng)過隔離觀察和健康檢查，確認(rèn)羊只未感染布病后，才能夠混合養(yǎng)殖。日常也需要保持羊舍清潔干燥，通風(fēng)良好，減少病原菌的生存和傳播條件。定期對羊舍、用具等進(jìn)行消毒，使用有效的消毒劑如10%的氫氧化鈉溶液、5%的過氧乙酸溶液和2%的福爾馬林溶液等，常規(guī)消毒每周進(jìn)行一次，大清理大消毒每季度進(jìn)行一次，疫情發(fā)生之后，應(yīng)該堅持每天消毒1～2次，持續(xù)14天。對于受到布魯氏桿菌病威脅的養(yǎng)殖場可以采用疫苗接種的方式提高羊只的免疫力，減少布病的發(fā)生，未受到布魯氏桿菌病威脅的養(yǎng)殖場，通常不采用疫苗免疫接種。另外為了防范布魯氏桿菌由深處向人類群體傳播蔓延，要求養(yǎng)殖戶在日常養(yǎng)殖管理，尤其是疫情處置過程中，一定要注重做好個人防護(hù)。

綜上所述，羊布魯氏桿菌病是一種危害較為嚴(yán)重的接觸性細(xì)菌性傳染性疾病，該類疾病的發(fā)生流行會對羊的生長發(fā)育以及一個地區(qū)的畜牧養(yǎng)殖安全構(gòu)成嚴(yán)重的危害。由于布魯氏桿菌存在多種類型，再加上養(yǎng)殖管理人員對布魯氏桿菌病的危害認(rèn)知不足，當(dāng)出現(xiàn)疫情之后不能夠第一時間做出有效的診斷，不能夠立即將病情上報當(dāng)?shù)氐男竽莲F醫(yī)部門，最終造成疫情逐漸擴大蔓延。為更好降低羊布魯氏桿菌病的發(fā)生流行率，就需要加快布魯氏桿菌病分離診斷方法的深度攻關(guān)，要明確不同診斷方法的優(yōu)缺點，規(guī)范診斷操作，確保在短時間內(nèi)能夠判定病原感染類型。另外在今后的布魯氏桿菌病防控期間，也需要加強對該種疾病診斷技術(shù)的深度研究，加快快速準(zhǔn)確診斷技術(shù)的創(chuàng)新和改革，為該類疾病的防治和凈化奠定堅實基礎(chǔ)，最終推動羊養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

（作者單位：1.061001河北省滄州市動物疫病預(yù)防控制中心;2.530817廣西大化瑤族自治縣板升鄉(xiāng)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站;3.843200新疆阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心）