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    上海地方豬種抗腹瀉基因與免疫相關因子分析

    2024-06-28 21:30:07周金勇孫玲偉張克勤戴建軍張德福王振國主性吳彩鳳
    中國農(nóng)業(yè)科技導報 2024年4期

    周金勇 孫玲偉 張克勤 戴建軍 張德?!⊥跽駠≈餍浴遣束P

    摘要:為鑒定上海地方豬種上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬中抗腹瀉基因抗原加工相關轉(zhuǎn)運體1(transporterassociatedwith antigen processing 1, TAP1)、α(1, 2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶1[α( 1, 2)-fucosyltransferase 1, FUT1]、天然抗性相關的巨噬細胞蛋白1(natural resistance-associated macrophage protein 1, NRAMP1)、黏蛋白4(mucin 4,MUC4)和黏蛋白13(mucin 13, MUC13)基因的有效遺傳標記,為上海地方豬種資源特性提供參考,應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCRRFLR)和序列測序分析上述基因的多態(tài)性,結合部分免疫相關因子,探討對3個上海地方豬種免疫力的影響。結果顯示,3個豬種中TAP1 和MUC4 基因均具有抗腹瀉基因型GG,而僅在楓涇豬和沙烏頭豬中檢測到MUC13基因抗腹瀉基因型GG,在3個豬種中均未檢測到FUT1 和NRAMP1 基因抗腹瀉基因型AA。上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因處于中度多態(tài),上海白豬的MUC4 基因處于低度多態(tài),楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因處于中度多態(tài),上海白豬MUC13 基因處于中度多態(tài),其中上海白豬和沙烏頭豬的TAP1 基因不滿足Hardy-Weinberg平衡,楓涇豬的MUC4 基因不滿足Hardy-Weinberg平衡。上海白豬MUC13 基因AA型的白細胞介素12(interleukin-12, IL-12)水平顯著高于AG 型,楓涇豬TAP1 基因AA 型的腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactor, TNF-α)指標顯著高于GG和AG型,沙烏頭豬TAP1 基因AG型的IL-12指標顯著高于GG型。以上研究結果對上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬的抗腹瀉育種和分子選育具有一定指導意義,為今后上海各地方豬種抗腹瀉育種工作奠定了基礎。

    關鍵詞:上海白豬;楓涇豬;沙烏頭豬;抗腹瀉基因;免疫因子

    doi:10.13304/j.nykjdb.2023.0229

    中圖分類號:S828.2 文獻標志碼:A 文章編號:10080864(2024)04012816

    根據(jù)2022年10月國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù),我國生豬存欄44 394萬頭,擁有相當高的生豬存欄量,而豬腹瀉病常年頻發(fā),致死率高,是嚴重制約我國乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大難題[1]。當前,對豬群的抗腹瀉相關基因通過分子育種技術進行其等位基因頻率的檢測與分析,從而用于指導豬群育種,從育種角度提高豬群整體的抗腹瀉能力,進而從根本上解決生豬腹瀉病帶來的經(jīng)濟損失。

    產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxi-genic escherichiacoli, ETEC)F18的候選基因主要是α (1, 2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1[α (1, 2)-fucosyltransferase1, FUT1]和抗原處理相關轉(zhuǎn)運體基因(transporter-associatedwith antigen processing 1, TAP1)[23]。Meijerink等[4]研究發(fā)現(xiàn),瑞士長白豬FUT1 基因的A 型可抗ETEC F18的感染。Kim等[5]進一步證明,F(xiàn)UT1 基因的AA基因型個體的仔豬存活率幾乎是GG個體的2倍。因此,F(xiàn)UT1 基因多態(tài)性可用作選擇程序的有效標記,以提高斷奶后仔豬的存活率。趙喬輝等[6]研究發(fā)現(xiàn),在淮豬、榮昌豬和長白豬等豬種中TAP1 基因的GG型個體有更強的抗ETEC F18感染的能力,可將TAP1 基因作為豬抗腹瀉育種的有效遺傳標記之一。天然抗性相關的巨噬蛋白1(natural resistance-associated macrophage protein 1,NRAMP1)基因能夠影響動物機體的抗病性能,豬NRAMP1 基因AA基因型為抗腹瀉優(yōu)勢基因型[7]。劉艷冬等[8]通過觀測記錄哺乳仔豬的腹瀉情況發(fā)現(xiàn),NRAMP1 在各品種豬中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性,進一步證明NRAMP1 可作為豬抗病育種候選基因。粘蛋白4(mucin 4, MUC4)和粘蛋白13(mucin 13, MUC13)基因是ETEC F4ab/F4ac 受體的重要候選基因[9-11]。Peng 等[12]研究表明,豬對ETEC F4ab/ac 感染的易感性/抗性與MUC4 基因內(nèi)含子17中的G243位點A→G突變顯著相關,且GG 型是抗腹瀉基因型。任軍等[13] 也發(fā)現(xiàn),MUC13 基因的rs319 699 771位點上存在G→A突變,GG型為抗腹瀉基因型,且通過鑒定該位點突變能夠鑒別抗腹瀉個體。因此,MUC4 和MUC13基因被視為F4ab/F4ac 受體最有希望的候選基因。

    本研究對上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬部分抗腹瀉基因(TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13)的基因多態(tài)性進行篩查,并結合部分血液免疫因子,如免疫球蛋白(immunoglobulin, IgG)、白細胞介素2(interleukin-2, IL-2)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)、白細胞介素12(interleukin-12, IL-12)、腫瘤壞死因子ɑ(tumor necrosis factor, TNF-ɑ)、干擾素γ(interferon γ, IFN-γ)等,進一步分析上述豬種的抗腹瀉能力,以期為提高上述豬種抗腹瀉育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 采樣

    本研究中使用的動物為90 頭后備種公豬(200~300日齡),包括3種中國上海本土豬:上海白豬(30頭)、楓涇豬(30頭)和沙烏頭豬(30頭),分別來自上海農(nóng)系白豬種原種場、上海金山楓涇豬保種場和上海崇明沙烏頭農(nóng)業(yè)科技有限公司。試驗豬種圍欄中單獨飼養(yǎng),每天按照標準飼喂,并隨意飲用水,按照《中國豬飼喂標準指南》[14]進行病害控制。每個豬種分別采集血液樣本各30份抗凝血用于提取DNA,30份未抗凝血用于測定部分免疫因子。采集的未抗凝血經(jīng)4 000 r· min-1離心20 min后分離血清,置于-80 ℃冰箱保存。

    1.2 DNA 提取

    按照血液全基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]使用說明書,對豬血液樣品進行DNA 提取。利用紫外分光光度計(eppendorf公司)對提取的DNA含量進行測定,選擇含量在80~250 μg· μL-1的樣品進行后續(xù)試驗。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA 的質(zhì)量,統(tǒng)一稀釋至50 ng·μL-1,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 聚合酶鏈式反應-限制性酶切酶段長度多態(tài)性分析。

    在NCBI 上查找相關序列,使用PrimerPremier 6.0 軟件設計FUT1、NRAMP1、TAP1、MUC13 和MUC4 基因的引物(表1),由中國上海生工生物工程有限公司合成。

    PCR 反應體系為20 μL,包含template DNA2μL,2× M5 Taq hifi PCR mix 10 μL,primer 1(10 μmol·L-1)0.5 μL,primer 2(10 μmol·L-1)0.5 μL,nuclease-free ddH2O 補充至20 μL。PCR 反應條件:預變性94 ℃ 4 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸(TAP1 和FUT1 為60 s,循環(huán)30 次;NRAMP1 為45 s,循環(huán)29 次;MUC4 為15 s,循環(huán)34次;MUC13 為45 s,循環(huán)35次);72 ℃延伸5 min,并置于4 ℃保存待用(PCR儀購自美國ABI公司)。

    TAP1 基因選用MboI [寶如億(北京)生物技術有限公司]對PCR產(chǎn)物進行消化,酶切反應總體系為10 μL,包括PCR 擴增產(chǎn)物0.4 μL,restrictionenzyme 0.4 μL(10 U·μL-1),10× NE buffer 1 μL,ddH2O 8.2 μL,置37 ℃恒溫反應2 h,65 ℃溫育20 min后經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后分析。

    FUT1 與MUC4 基因選用HhaⅠ [寶如億(北京)生物技術有限公司],NRAMP1 基因選用NdeⅠ[寶如億(北京)生物技術有限公司]對PCR產(chǎn)物進行消化。酶切反應總體系為10 μL,包括PCR擴增產(chǎn)物1 μL(500 ng· μL-1),RE10× buffer 1 μL,acetylated BSA 0.1 μL(10 μg·μL-1),restrictionenzyme 0.25 μL(10 U·μL-1),ddH2O 7.65 μL,置37 ℃恒溫反應2 h,后添加4 μL 6×加載緩沖液經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后分析。由于MUC13 無特異性內(nèi)切酶位點,故不進行酶切。

    將上述PCR產(chǎn)物切膠回收純化后,送至上海生工生物工程技術服務有限公司單向測序,測序結果用DNAstar軟件分析。

    1.4 血液免疫因子測定

    采用ELISA免疫因子檢測試劑盒(elabsciencebiotechnology Co., Ltd.)測定樣品吸光度,吸光度值用于繪制標準曲線,用于測量以下免疫因子:IgG(DG50 132P-96T)、IL-2(DG50 032P-96T)、IL-6(DG50 031P-96T)、IL-10(DG50 034P-96T)、IL-12(DG50 055P-96T)、TNF- ɑ(DG50 014P-96T)和INF-γ(DG50 141P-96T)[15-17]。所測指標作為上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬免疫應答和一般抗病力的評價。按照使用說明具體操作方法如下:首先,從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4 ℃;設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同含量的標準品50 μL;樣本孔先加待測樣本10 μL,再加樣本稀釋液40 μL;空白孔不加;除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)標記的檢測抗體100 μL,用封板膜密封反應孔,37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min;棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板);每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min;每孔加入終止液50 μL,15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線:在Excel工作表中,以標準品含量作橫坐標,對應OD值作縱坐標,繪制標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本含量(pg·mL-1)。所有免疫因子指標檢測方法相同。

    1.5 統(tǒng)計分析

    測序結果利用NCBI 系統(tǒng)中BLAST 進行比對,鑒定SNP 位點,根據(jù)Hardy-Weinberg 平衡定律,計算基因的基因型頻率。采用適合性檢驗法,進行Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)、卡方(χ2)獨立性檢驗分析,計算各基因的等位基因和基因型頻率。群體內(nèi)遺傳變異和分化的相關參數(shù)通過popgene3.1 軟件計算獲得。采用cervus 3.0 軟件計算基因的多態(tài)信息含量(polymorphism informationcontent, PIC)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(expected heterozygosity, He);其中PIC≥0.50時為高度多態(tài),0.25≤PlC<0.50時為中度多態(tài),PIC<0.25時為低度多態(tài)。各性狀值與基因型的關系采用SPSS 14.0軟件進行最小二乘分析,其中P<0.05為顯著相關。

    2 結果與分析

    2.1 基因PCR 擴增結果

    根據(jù)TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因的引物對上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬提取的DNA 進行擴增,PCR 產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖電泳檢測。由圖1 可見,TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13 基因在不同豬種中均擴增出清晰的特異性條帶,片段大小分別為767、421、483、220和230 bp,與預測的擴增片段大小一致。

    2.2 PCR 產(chǎn)物的酶切結果

    由圖2可知,上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬的TAP1 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MboⅠ酶切,經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到上海白豬有2種不同基因型(AG和GG),楓涇豬和沙烏頭豬有3種不同的基因型條帶,分別為AA、GG和AG。根據(jù)酶切結果,對PCR產(chǎn)物進行測序發(fā)現(xiàn),在測序峰圖中部分豬種個體的TAP1 基因有1個G→A的單堿基突變,將該位點未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型,將該位點突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型,呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型(圖2D)。GG 型個體的序列與NCBI 中AK396698.1的序列一致,定義為野生型,相比之下發(fā)現(xiàn)GG 型在第729位置有1個G→A 的單堿基突變,這與酶切結果一致(圖2E)。

    上述豬種FUT1 基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MboⅠ酶切,經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到3個豬種的FUT1 基因都只有1種基因型條帶,為GG表型(241/93/87 bp)(圖3)。根據(jù)酶切結果對其進行驗證,對PCR產(chǎn)物進行測序,對測序峰圖分析發(fā)現(xiàn),在測序峰圖中所有豬種個體的FUT1 基因都不存在單堿基突變,將該位點未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型(圖3D)。所有豬種GG型個體的序列與NCBI中U70 883.2的序列一致,這與酶切結果一致,沒有發(fā)現(xiàn)突變的基因位點。

    3個豬種NRAMP1 基因第6內(nèi)含子的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ酶切,經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到3個豬種的NRAMP1 基因都只有1種基因型條帶,為BB表型(373/110 bp)(圖4)。根據(jù)酶切結果對其進行驗證,對PCR產(chǎn)物進行測序發(fā)現(xiàn),在測序峰圖中所有豬種個體的NRAMP1基因都不存在單堿基突變,將該位點未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為BB型(圖4D)。所有豬種個體的序列與NCBI中上AY368 473.1的序列一致,這與酶切結果一致,沒有發(fā)現(xiàn)突變的基因位點(圖4E)。

    對上海白豬、楓涇豬的MUC4 基因擴增得到的所有PCR產(chǎn)物進行測序分析,對所得測序峰圖(圖5)分析發(fā)現(xiàn),部分豬種的MUC4 基因有1個G→A的單堿基突變,將該位點未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型,將該位點突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型,呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型(圖5B)。對沙烏頭豬的MUC4 基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切后,經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后都得到了3種不同的基因型條帶,分別命名為AA、GG和AG,抗性等位基因(A)不能被HhaI 消化,為AA型(367 bp),而敏感等位基因被消化成2個片段,為GG型(151/216 bp)。2個基因型同時存在時為AG型(151/216/367 bp),如圖5所示。根據(jù)酶切結果,對PCR產(chǎn)物進行測序發(fā)現(xiàn),在測序峰圖中沙烏頭豬部分豬種的MUC4 基因有1 個G→A 的單堿基突變。將上述豬種的MUC4 基因所測序列與NCBI中KT966 749的序列對比,AA型個體的序列與其一致,定義為野生型,相比之下發(fā)現(xiàn)GG型有1個G→A的單堿基突變,這與酶切結果一致。

    對上述豬種的MUC13 基因擴增得到的所有PCR產(chǎn)物進行測序分析,得到測序峰圖與基因序列,對所得的測序峰圖進行分析發(fā)現(xiàn),上海白豬中有部分豬種存在G→A的單堿基突變,楓涇豬和沙烏頭豬的所有個體都存在G→A 的單堿基突變,將該位點未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型,將該位點突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型,呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型(圖6A)。得到的序列與NCBI上JN613 418.1對比,所有個體的對比結果與測序峰圖一致(圖6B)。

    2.3 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因型和等位基因頻率分析

    利用PCR-RFLP方法對3個豬群個體進行檢驗,分型后計算各豬群的基因型和等位基因頻率,結果如表2所示。上海白豬中TAP1 基因有1個等位基因,2種基因型(AG和GG),其中AG、GG基因型數(shù)量和基因型頻率分別為17、13和0.57、0.43;抗病等位基因G的頻率為0.72,敏感等位基因A的頻率為0.28。楓涇豬TAP1 基因的AA、AG、GG基因型數(shù)量及基因型頻率分別為3、11、16 和0.10、0.37、0.53,抗病等位基因G和敏感等位基因A的頻率分別為0.72和0.28。在檢測的30個沙烏頭豬樣本中,TAP1 基因的AA、AG、GG 基因型數(shù)量分別為1、19、10,基因型頻率分別為0.03、0.63、0.33,抗病等位基因G的頻率為0.65,敏感等位基因A的頻率為0.35。在3個豬群中,AA型的頻率不高,總體上等位基因G為優(yōu)勢等位基因。

    在檢測的所有豬種的樣本中,F(xiàn)UT1 基因只檢測出敏感基因型GG型,等位基因G為優(yōu)勢等位基因。

    對NRAMP1 基因的檢測表明,3 個地方豬種中沒有出現(xiàn)抗病基因型AA型,只檢測出敏感基因型BB型,等位基因B為優(yōu)勢等位基因。

    如表2所示,共檢測出MUC4 基因的1對等位基因,3個豬種均檢測出3種基因型,但在各個豬種中所含有的基因型和基因頻率有差異;在上海白豬中,MUC4 基因的AA、GG、AG基因型數(shù)量及頻率分別為1、25、4 和0.03、0.83、0.13,其中G 為優(yōu)勢等位基因。在楓涇豬中MUC4 基因的AA、GG、AG 基因型數(shù)量及頻率分別為10、1、19 和0.33、0.03、0.63,其中A為優(yōu)勢等位基因。在沙烏頭豬中MUC4 基因的AA、GG、AG 基因型數(shù)量及頻率分別為6、10、14和0.20、0.33、0.47,其中G為優(yōu)勢等位基因。

    3個地方豬種中MUC13 基因共檢測出1對等位基因,檢測出AA、GG和AG共3種基因型,上海白豬中檢測出2種基因型(AA和AG),楓涇豬和沙烏頭豬只檢測出了1種基因型(GG),在上海白豬中AA和AG基因型頻率分別為0.87和0.13,其中A為優(yōu)勢等位基因。

    2.4 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因的遺傳多態(tài)性分析

    由表3 可知,上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因的多態(tài)信息含量(PIC)處于0.25~0.50,都屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的Ho、He和PIC值均比上海白豬和楓涇豬高,表明其遺傳多樣性高于其他2個品種。上海白豬和沙烏頭豬的χ20.05(1)<χ2<χ20.01(1)(χ20.05(1)=3.84,χ20.01(1)=6.63),0.010.05,差異不顯著,滿足Hardy-Weinberg平衡。

    對上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬FUT1 和NRAMP1 基因的酶切與測序結果顯示,只有GG和BB 基因型,無法進行遺傳多態(tài)性和Hardy-Weinberg平衡分析。

    上海白豬的MUC4 基因的PIC<0.25,屬于低度多態(tài),楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因PIC 處于0.25~0.50,屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的He 與PIC值均高于楓涇豬和沙烏頭豬,表明沙烏頭豬的遺傳多態(tài)性高于其他2個品種,經(jīng)過比對,3個品種中上海白豬遺傳多態(tài)性最低。分析發(fā)現(xiàn),上海白豬和沙烏頭豬χ2<χ20.05(1),P>0.05,差異不顯著,滿足Hardy-Weinberg 平衡。楓涇豬χ20.05(1)<χ2<χ20.01(1),0.01

    上海白豬MUC13 基因PIC<0.25,屬于低度多態(tài)。χ2<χ20.05(1),P>0.05,差異不顯著,滿足Hardy-Weinberg平衡。然而,楓涇豬和沙烏頭豬MUC13基因僅有GG基因型,無法繼續(xù)進行遺傳多態(tài)性和Hardy-Weinberg平衡分析。

    2.5 上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬免疫因子的測定分析

    不同豬種免疫因子測定結果見表4,上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬之間血液免疫因子平均水平無顯著差異(P>0.05)。分析發(fā)現(xiàn),沙烏頭豬的IL-12和TNF-α免疫因子均比上海白豬和楓涇豬高。其中,IL-6免疫因子水平與其正好相反,上海白豬血液中IL-6水平高于楓涇豬和沙烏頭豬。楓涇豬的IFN-γ、IL-10和IgG 的水平比上海白豬和楓涇豬高,其中IL-10和IgG的水平較低的是沙烏頭豬。上海白豬IL-2的水平較高,楓涇豬IL-2的水平低于其他2個豬種。

    2.6 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因多態(tài)性與免疫因子相關性分析

    由于FUT1 和NRAMP1 基因只檢測出1種基因型,所以這2個基因不與免疫因子進行相關性分析。如表5所示,上海白豬的TAP1 基因各基因型個體表達的免疫因子的量差異不顯著(P>0.05),但GG基因型的IFN-γ、IL-12、IgG、TNF-α免疫因子水平高于AG基因型,AG基因型的IL-2、IL-6和IL-10的免疫因子水平高于GG基因型。在上海白豬中,MUC4 基因由于AA 型只檢測出1個,AA型免疫因子與GG和AG不作比較,通過最小二乘法分析,GG和AG型各免疫因子不存在顯著差異(P>0.05)。MUC13 基因由于沒有檢測到GG 基因型,GG 型免疫因子與AA 和AG 不作比較,通過最小二乘法分析,AA型的IL-12水平顯著高于AG型(P<0.05)。其他免疫因子AA和AG型之間不存在顯著差異(P>0.05)。

    對楓涇豬TAP1 基因的各基因型的免疫因子的分析可知,TNF-α在3個基因型豬中存在明顯差異,其中AA 型的TNF-α 水平顯著高于GG 和AG型(P<0.05)。其他免疫因子在各基因型間不存在差異,但從結果看,AA型中IL-2的水平高于GG和AG型,其中AG型IL-2水平較低。GG型中IFN-γ和IL-10水平高于AA和AG型,其中AA型的IFN- γ 和IL-10 水平較低。IL-6 水平AG 型較高,GG 型較低。AG 型的IL-12 水平高于AA 和GG,AA型的IL-12水平較低。還可以看出,GG的IgG 水平高于AA 和AG,其中AG 型水平相對較低。楓涇豬MUC4 基因由于GG型只檢測出1個,GG型免疫因子與AA和AG不作比較,通過最小二乘法分析,GG 和AG 型免疫因子不存在差異(P>0.05)。

    在沙烏頭豬中,TAP1 基因由于AA型只檢測出1個,AA型免疫因子與GG和AG不作比較,通過最小二乘法分析,GG 型的IL-12水平與AG 型之間存在顯著差異(P<0.05),其他免疫因子的GG和AG型之間不存在顯著差異。從表4可知,GG型的IFN-γ、IL-2和IgG高于AG型。AG型的IL-6和IL-12 高于GG 型。GG 型與AG 型的TNF-α 水平趨于一致。沙烏頭豬中MUC4 各基因型的免疫因子沒有顯著差異(P>0.05)。

    3 討論

    3.1 抗腹瀉基因的多態(tài)性

    本研究對上海地區(qū)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬3個地方豬種的TAP1 基因外顯子3多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),上海白豬檢測到AG和GG型,楓涇豬和沙烏頭豬都檢測到AA、AG和GG 3種基因型,其中G為優(yōu)勢等位基因。趙喬輝等[6]研究發(fā)現(xiàn),中國本地豬種與亞洲野豬及國外引進豬品種的基因頻率存在明顯差異,外來引進豬的等位基因G頻率相對較高,而中國地方豬種(淮豬和榮昌豬等)的A頻率相對較高,這與本研究結果一致,本研究中上海白豬沒有檢測出AA型基因,可能是因為上海白豬是與外國豬種培育的結果。Zhao 等[18]報道,蘇太豬TAP1 基因G729A突變顯著影響mRNA表達,且GG基因型個體抗腹瀉能力顯著高于其他2種基因型的個體。因此,TAP1 基因的GG基因型可作為抗腹瀉感染的候選基因型。

    本研究中,F(xiàn)UT1 基因M307位點結果顯示,3個地方豬種均僅存在1 種不抗病基因型(GG)。張雄等[19]發(fā)現(xiàn),國內(nèi)地方品種只含有GG型,而國外及國內(nèi)雜交培育品種豬FUT1 基因M307位點中含有AA、AG 和GG 基因型,其中GG 為絕對優(yōu)勢基因型。推測FUT1 基因抗病性等位基因A在中國地方豬種中呈極端偏態(tài)分布,AA抗病基因型可能來源于外國豬種。這一結果也與Yan等[20]和吳華莉等[21]的研究結果一致,可能是上海的幾個地方豬種與國內(nèi)外豬種基因交流較少,具有上海本地獨特的遺傳資源性。也有學者在中國上海的浦東白豬中檢測出了抗病基因GG型[22],可能是由于浦東白豬作為本土種豬和國外豬種雜交,使AA抗病基因型得到遺傳。

    作為相對比較保守的基因,NRAMP1 基因會對動物自身免疫產(chǎn)生影響,且對沙門氏菌及多種胞內(nèi)寄生病原菌具有抗病[23]。本研究利用PCRRFLP技術,在3個豬種中均未檢測到AA型,只檢測到BB 型。楊軍等[24] 在多個豬種中檢測到NRAMP1 基因的AB和BB型,均未檢測到抗病基因型AA型。但劉艷冬[25]研究發(fā)現(xiàn),貴州地方豬種NRAMP1 基因內(nèi)含子6具有豐富多態(tài)性,其中香豬抗病基因型AA型比例為26%、糯米豬為20%、宗地花豬為7.5%、大約克豬為4.3%。其他學者在中國的其他地方豬種中也檢測到有AA型[22]??赡苁巧虾0棕i、楓涇豬和沙烏頭豬在長期的進化選擇中,該基因的個體逐漸被淘汰,群體該位點的遺傳平衡從而被打破。

    研究表明,MUC4 基因可以作為F4ab/F4ac抗性的候選基因,且G為控制F4ac大腸菌抗性等位基因[2627]。本研究對上海地區(qū)3 個地方豬種的MUC4 基因第17 內(nèi)含子243 位點多態(tài)性鑒定發(fā)現(xiàn),在該位點共檢測到了1 個等位基因及AA、AG、GG共3種基因型,其中上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬中都檢測到3種基因型。在上海白豬和沙烏頭豬中G為優(yōu)勢等位基因,楓涇豬中A為優(yōu)勢等位基因。李聰聰?shù)萚28]研究表明,淮南豬和太白豬的MUC4 基因檢測出3 種基因型AA、AG 和GG,這與本研究結果相似,在Liu 等[27]和李聰聰?shù)萚28]研究中,GG型個體對抗ETEC F4ab/F4ac感染能力高于其他基因型。本研究中,3個地方豬種都存在GG型抗病基因,可以通過選育來實現(xiàn)群體抗ETEC F4ab/F4ac感染。

    MUC13 基因被定位于豬13號染色體長臂41區(qū)的Sw207和S0075之間,研究表明,MUC13 基因是決定仔豬F4ac腹瀉易感/抗性的基因之一[29-31]。本研究對上海地區(qū)3個地方豬種的MUC13 基因第2內(nèi)含子多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn),在該位點共檢測到了1個等位基因和AG、GG 2種基因型。其中上海白豬檢測到2種基因型,楓涇豬和沙烏頭豬只檢測出抗病基因型GG型,其中G為優(yōu)勢等位基因。與本研究的結果相似,楊明等[32]研究杜洛克豬和皮特豬中MUC13 基因的分子標記輔助選擇發(fā)現(xiàn),2個豬種中G為優(yōu)勢等位基因;任軍等[13]發(fā)現(xiàn),該基因在rs319699771 位點的GG 型為優(yōu)勢抗腹瀉基因型,而AG型和AA型為易感腹瀉基因型。本研究發(fā)現(xiàn),楓涇豬和沙烏頭豬只存在抗病基因型GG型,可能是這2個豬種在長期的進化選擇中,該基因的個體逐漸被保留,形成了抗病基因型的種群。

    3.2 遺傳多態(tài)性分析

    作為群體內(nèi)遺傳變異的檢測參數(shù),PIC、Ho和He 數(shù)值反映了群體內(nèi)個體的均質(zhì)度,其數(shù)值越高,說明遺傳變異性就越大,對環(huán)境的適應能力越強,具有較大的選擇潛力,應用于遺傳育種效果越好,反之則說明該群體雜合度小、基因純合度高,可以看作純系加以利用[33-35]。上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因的PIC處于0.25~0.50,都屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的TAP1 基因Ho和He值高于上海白豬和楓涇豬,說明沙烏頭豬遺傳多樣性豐富,對環(huán)境的適應能力較強,遺傳潛力大。經(jīng)過分析,TAP1 基因在上海白豬和沙烏頭豬中不滿足Hardy-Weinberg平衡,這一結果與在浦東白豬、皖南黑豬、霍壽黑豬和梅山豬等地方豬種中的研究結果一致,TAP1 基因偏離了Hardy-Weinberg 平衡[6, 22]。楓涇豬中滿足Hardy-Weinberg平衡,說明TAP1 基因在楓涇豬中基本處于自由交配的狀態(tài),也就是群體的選育對TAP1 基因沒有造成影響,對現(xiàn)在的選育性狀沒有作用。這與前人在杜洛克、大白和長白中的研究結果一致[6]。

    上海白豬的MUC4基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài)(<0.25),而楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因?qū)儆谥卸榷鄳B(tài)。沙烏頭豬He值比其他2個豬種高,與PIC值的變化趨勢一致,說明沙烏頭豬的遺傳多態(tài)性較高,可作為抗病育種的標記輔助性選擇。上海白豬MUC4 基因的PIC較低,說明遺傳變異性較低,但分析發(fā)現(xiàn)上海白豬和沙烏頭豬滿足Hardy-Weinberg平衡,楓涇豬不滿足Hardy-Weinberg平衡。說明人工選擇影響了MUC4 基因抗腹瀉基因型在楓涇豬中的分布。上海白豬MUC13 基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài),滿足Hardy-Weinberg平衡。此外,本試驗中有部分豬種基因位點偏離了Hardy-Weinberg平衡??赡苁怯捎谌后w研究的樣本量不夠或者群體內(nèi)近交積累過高[36]。本研究的上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬品系樣本量都達到了統(tǒng)計學意義,但分析3個品種的基因多態(tài)性以及雜合度,結果表明,群體中出現(xiàn)近交積累過高和部分等位基因缺失的問題。進一步分析群體出現(xiàn)連鎖不平衡,主要是由于目前上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬群體在保種過程中出現(xiàn)了高度近交或遺傳漂變,而這與上述豬種后期的品種改良有關。

    3.3 抗腹瀉基因多態(tài)性與免疫因子相關性分析

    IgG是在針對外來抗原的免疫應答過程中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白類別,通過其雙功能特性有效地提供保護,血清中IgG含量可以代表機體體液的免疫狀態(tài)[37]。IL-2、IL-6、IL-10 和IL-12 在機體免疫系統(tǒng)中具有重要作用,其中IL-2主要是激活免疫,IL-6 和IL-10 主要參與炎癥反應[38-40]。IL-12主要是促進T細胞和NK細胞的增殖,也被證明可以促進Thl細胞的分化和增殖,阻止瘧疾的傳播[4142]。作為一種強烈抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子,IFN-γ在機體免疫系統(tǒng)中具有重要作用[43]。TNF-α屬于腫瘤壞死因子超家族的一員,在機體內(nèi)可抑制病毒復制、病原體的擴散,并預防腫瘤發(fā)生,是重要的抗病因子[44]。上述血清學免疫因子,都是機體免疫不可缺少,它們之間互相影響、互相調(diào)節(jié),存在密切聯(lián)系。本研究對3個豬種的上述免疫因子分析顯示,各豬種間的免疫因子水平均差異不顯著,但在沙烏頭豬中IL-6指標低于其他2個豬種。研究表明,低水平IL-6更具有抗病優(yōu)勢[45],說明沙烏頭豬的抗病性可能更高。此外,對上海地區(qū)3個地方豬種的部分抗腹瀉基因的基因型與部分免疫因子進行關聯(lián)性分析,在上海白豬中僅有MUC13 基因AA型的IL-12免疫因子顯著高于AG型;楓涇豬中TAP1 基因的AA基因型個體TNF-a表達水平顯著高于GG和AG型,這與薛偉偉[15]對圩豬的研究結果一致。由于TNF-a不僅能夠調(diào)控促炎細胞因子,也能控制趨化因子和黏附因子的活化和表達[46]。因此,推測在正常值范圍內(nèi),AA型豬的抗病能力與AG利GG型存在差異。在沙烏頭豬中,TAP1 基因GG型的IL-12水平顯著低于AG型,研究表明,IL-12水平過高會抑制Th2細胞的產(chǎn)生從而抑制IL-10的產(chǎn)生,且IL-10的表達與IL-12的表達早現(xiàn)負相關[47]。雖然沙烏頭豬的TAP1 基因GG型與AG型的IL-10 沒有顯著差異,但AG 型的IL-10 水平低于GG型。本研究總結了上海白豬,楓涇豬和沙烏頭豬部分抗腹瀉基因與部分免疫因子間的的關系,通過分析,對各豬種的抗腹瀉有了初步的認識,可為后期試驗提供一定的理論依據(jù)。

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    (責任編輯:胡立霞)

    基金項目:國家重點研發(fā)計劃項目(2021YFD120303);上海市農(nóng)業(yè)科學院助跑計劃人才項目(ZP22171);重慶市技術創(chuàng)新與應用發(fā)展專項(CSTC2021JSCX-DXWTBX0004);寧波科技創(chuàng)新2025重大專項(2019B10023)。

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