雞滑液囊支原體PCR檢測方法的建立

陳文平 李冬立 康翠翠 張妹 程春格 陳小嬌 由鵬 王全武 蔡曉慶

摘 要：目前雞滑液囊支原體（MS）在養(yǎng)雞生產(chǎn)中時有發(fā)生，是一種頑固性、條件性疾病。在多種致病因素的作用易發(fā)，給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成了經(jīng)濟損失；為了快速診斷MS，特別是致病性雞滑液囊支原體，本研究針對MS的VlhA基因設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，進行靈敏性試驗、特異性試驗和重復(fù)性試驗，建立快速高效檢測MS的PCR方法。試驗結(jié)果表明：該檢測技術(shù)具有較好的靈敏性、特異性強且CV＜3%，具有很好的符合性。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體；PCR；檢測

中圖分類號：S858.31文獻標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2024）06-0027-05

雞的滑液囊支原體感染（Mycoplasama synoviae infection），又稱滑液囊支原體病，是一種急性或慢性傳染性疾病，可引起雞和火雞的傳染性滑液囊炎、慢性呼吸系統(tǒng)疾病及雞蛋尖端綜合征[1]。臨床上主要表現(xiàn)為滲出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或粘液囊炎等，對雞的生產(chǎn)性能造成了很大的影響。近幾年來，MS在各個地區(qū)都陸續(xù)出現(xiàn)，各個品種的雞均有發(fā)病，特別是商品蛋雞、商品肉雞及一些地方品種雞等，且各個日齡均可感染；大多數(shù)成年雞呈隱形感染。MS有垂直傳播和水平傳播2種傳播方式，而呼吸道傳播感染是該病的主要傳播方式。臨床上主要表現(xiàn)為呼吸啰音、雞冠蒼白、食欲減退、生長緩慢；嚴(yán)重的可出現(xiàn)胸骨囊腫、腳墊及腳關(guān)節(jié)腫脹、跛行等。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟有尿酸鹽沉積，脾臟、腎臟腫大等[2]。剖檢病雞，主要病理變化為附關(guān)節(jié)、跗關(guān)節(jié)和腳墊腫脹，腫脹部位囤積大量黃色膠凍樣粘液。胸部發(fā)生囊腫，隨著病程延長，胸骨關(guān)節(jié)被粘液或干酪樣物質(zhì)覆蓋，爪墊內(nèi)也存在膿性分泌物或干酪樣滲出[3]。病雞的睫鞘滑膜層出現(xiàn)廣泛、散在和局灶性的炎性浸潤[4]。部分雞肝脾腫大、出現(xiàn)明顯的紋路，腎臟腫大[5]。

總體來說，現(xiàn)有的全球家禽養(yǎng)殖場的支原體流行情況報告大部分都是血清學(xué)檢測[6]，但血清學(xué)檢測不能用于確定血清抗體的存在，可能缺乏特異性或靈敏性，因此，單純的依靠血清轉(zhuǎn)化的檢測程序可能不夠完善 。

本研究對MS疑似的病料進行病原的分離和鑒定是非?？煽康臋z測方法，但是該方法對菌的生長環(huán)境和條件極為苛刻，且耗時較長、難度較大；大型雞場和獸醫(yī)基層工作人員，大多數(shù)還是以平板凝集的試驗來初步診斷。通過分離培養(yǎng)菌株，對MS分離菌株的VlhA基因設(shè)計特異性引物，建立快速準(zhǔn)確的PCR檢測方法，為臨床檢測MS提供一種快速的檢測技術(shù)。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1? 菌株? 雞滑液囊支原體MS菌株（Y1株），火雞支原體MM菌株、雞毒支原體MG菌株均由峪口禽業(yè)疾控研發(fā)中心提供。

1.1.2? 主要試劑? 2×Rapid Taq Master Mix 購自美國Axgey公司。DL2 000marker、5×RT-緩沖液、pMD19-T載體、DNA核酸提取試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.1.3? ?主要的設(shè)備? 核酸提取儀器、振蕩器、PCR儀、研磨器、電泳儀。

1.2? 方法

1.2.1? 引物的設(shè)計? 基于Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的雞滑液囊支原體的VlhA基因序列（Genbank編號：HQ682228.2），本研究成功設(shè)計出一套針對雞滑液囊支原體的通用引物。具體的引物序列詳見表1。這些引物由上海生物生工工程有限公司負責(zé)合成。這一研究成果為進一步探索雞滑液囊支原體的檢測和分析提供了有力工具。通過對該基因序列的分析，我們可以更好地理解雞滑液囊支原體的生物學(xué)特性，從而為雞病的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1.2.2? 核酸的提取? 參照日本TaKaRa公司的柱式提取的試劑盒操作說明進行核酸的提取。

1.2.3? 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備? 本研究主要關(guān)注質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備過程。首先，將目的片段與pMD19-T載體連接，形成重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)。隨后，提取含有pMD18-T的VlhA目的菌株中的質(zhì)粒。為了確保質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，對其進行測序鑒定，確保無誤。最后，通過紫外分光光度計測定質(zhì)粒的OD值，并在-20 ℃的條件下進行保存。這一過程為后續(xù)相關(guān)研究提供了可靠的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4? MS普通PCR檢測方法的建立? （1）PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過對PCR的反應(yīng)體系進行配置，在優(yōu)化過程中對引物濃度、退火溫度等進行具體優(yōu)化，確定反應(yīng)條件（表2）。

反應(yīng)程序包括初始變性，循環(huán)擴增，最終延伸和保存等步驟。具體為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 15 s，共42個循環(huán)；92 ℃ 5 min；4 ℃保存。為了檢測PCR產(chǎn)物的正確性，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測。根據(jù)電泳結(jié)果，選取疑似陽性PCR產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司進行測序鑒定。這一過程為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供了重要保障。

（2）靈敏性試驗：分別以MS株為樣本，再分別按照10倍稀釋成0.42×109、0.42×108、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8個滴度。采用日本TaKaRa公司的柱式提取的試劑盒提取DNA為模板，按照優(yōu)化好條件進行PCR，凝膠電泳讀取試驗結(jié)果。

（3）特異性試驗：本研究以MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照樣本，同時設(shè)置了MG和MM作為對照樣本。采用TaKaRa公司的柱式提取試劑盒提取DNA為模板，利用PCR技術(shù)進行擴增；最后，通過凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行讀取，分析結(jié)果。這一過程不僅驗證了我們的實驗方法，也為后續(xù)的研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

（4）臨床試驗：選取臨床有呼吸道癥狀的雞群（河北省某雞場商品代雞群），隨機采取80份組織樣品進行檢測，按照優(yōu)化條件進行PCR檢測，每次實驗均設(shè)立陽性對照、陰性對照。

2? 結(jié)果

2.1? 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用構(gòu)建好的MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用F和R引物進行普通PCR擴增，核酸電泳檢測結(jié)果和預(yù)期結(jié)果一致，得到大約183 bp的目的片段（圖1），并進行基因序列測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行blast比對，結(jié)果表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品符合VlhA的基因序列，可用于后續(xù)試驗。

利用imple超微量分光光度計測量DNA的濃度，其濃度為92 ng/μL，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)0.17×1012 copies/μL。

2.2? 靈敏性試驗

通過優(yōu)化后的檢測條件，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，稀釋到0.42×1012 copies/μL后，再進行倍比稀釋成0.42×10、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8個滴度，分別進行PCR擴增。結(jié)果顯示：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到0.42×103μcopies/μL時仍然可以檢測陽性條帶（圖2），稀釋到0.42×102copies/μL以后仍出現(xiàn)條帶，但是顯示為弱陽性，表明該方法具有較高的靈敏性。

2.3? 特異性試驗

用MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，分別以MG、MM為對照樣本，以去離子水為陰性對照及空白對照組，為保證試驗的準(zhǔn)確性，做3組重復(fù)試驗。試驗結(jié)果表明：MS標(biāo)準(zhǔn)品為陽性，其他均為陰性（圖3），表明該方法具有良好的特異性。

2.4? 臨床樣品檢測

采集臨床出現(xiàn)精神萎靡、關(guān)節(jié)有積液等樣品，應(yīng)用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對疫苗、蛋清、蛋黃及雞胚（尿囊腔液）樣品中雞滑液囊支原體的感染情況進行檢測，其結(jié)果見表3。

3? 討論

雞毒支原體和滑膜囊支原體長期以來對家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠的不利影響。因此，在早期感染的雞身上檢測滑膜囊支原體，并盡快采取有效的控制措施，從而達到凈化雞滑膜囊支原體的目的。鑒于其垂直和水平傳播的特點，受感染的雞混合感染其他細菌和病毒，因此引起疾病暴發(fā)，出現(xiàn)腳墊腫脹、關(guān)節(jié)積液等癥狀，但臨床上很難通過癥狀診斷雞支原體疾病并及時采取相應(yīng)措施。因此，迫切需要建立一種特異、靈敏、可重復(fù)和快速的檢測方法。

病原分離技術(shù)一直都是行業(yè)檢測MS的金標(biāo)準(zhǔn)。MS的生長對環(huán)境要求苛刻，對營養(yǎng)條件有很高的要求，通常在其培養(yǎng)基中添加0.01%的NAD以及10%豬血清或者馬血清。其生長的最適pH為7.5左右，當(dāng)pH降至6.5甚至更低時開始大量死亡。因此，通過病原分離的方法對大量的臨床樣品進行檢測比較困難。研究發(fā)現(xiàn)，MS的vlhA基因在不同的MS菌株之間具有99%～100%的高度同源性，針對MS vlhA基因相對保守的特定區(qū)域設(shè)計引物，在其特定序列（1～200 bp）內(nèi)設(shè)計上游引物，并對目標(biāo)基因的選擇和引物進行特異性設(shè)計[7]。本研究結(jié)果表明，靶向MS vlhA基因的特異性引物可以特異性擴增混合樣品中MS的靶片段，有效鑒定了混合樣品中的MS。與OIE標(biāo)準(zhǔn)的MS普通PCR方法相比，MS-PCR方法可以有效避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的假陽性，有效避免了分子污染，使其更加方便、快速，并在一定程度上降低了檢測成本，對檢測方法的逐步簡化，分子生物學(xué)方法更適合基層疫情檢測和實驗室廣泛推廣。

本研究建立的方法在前人研究的基礎(chǔ)上，同樣對引物的靶基因、引物序列、引物濃度和退火溫度以及酶的用量和模板濃度進行了優(yōu)化，選擇了在MS屬內(nèi)高度保守且與其他病原體基因組具有差異區(qū)間的特異性基因vlhA作為檢測目標(biāo)，為滑液囊支原體單重及多重PCR檢測方法的建立提供了另一有效的選擇。本研究建立的PCR檢測方法，以固定量的陽性質(zhì)粒為模板，使用不同的酶和引物、探針濃度進行MS PCR反應(yīng)，檢測感染臨床樣品，對滑液囊支原體的陽性檢出率高達83%以上，為滑液囊支原體感染流行病學(xué)調(diào)查研究以及進一步開展滑液囊支原體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Establishing of the PCR Detection Method of a Smooth Liquid Pocket

CHEN Wenping1，LI Dongli，KANG Cuicui1， ZHANG Mei1，CHENG Chunge，

CHEN Xiaojiao1，YOU Peng，Wang Quanwu，cai xiaoqing 12*

（1.Beijing Huaduyukou Poultry Industry Co.，Ltd.，Beijing 101206，China;

2.Pinggu Comprehensive Test Station of National Laying Hens Industrial Technology System，Beijing 101206，China）

Abstract： At present， the proportion of chlamydiac （MS） in a smooth liquid sac pocket is a high proportion of chicken -raising production， which is a refractory and conditional disease. Under the effect of a variety of diseased factors， it has increased and easy to occur， causing huge economic losses to the production of chicken breeding; in order to quickly diagnose MS， especially the pathogenic bodies of the pathogenic fluid， Specific primers， by optimizing the reaction conditions， conducting sensitivity tests， specific tests， and repeated tests to establish a PCR method for fast and efficient testing MS. The test results show that the detection technology has good sensitivity， strong specificity， and CV <3%， which has good compliance.

Keywords： Smochye Pork Pystogen supports; PCR; detection