海南省東方市甜瓜細菌性果斑病病原鑒定

李鵬聲 黃清泰 范詠梅 王萌 楊葉

摘要：細菌性果斑病嚴重影響甜瓜生產，為確定其病原菌種類，從海南省東方市種植基地采集大量疑似細菌性果斑病的甜瓜樣本，進行病原菌分離純化，并按柯赫法則對獲得的菌株進行致病性測定。通過菌落形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列比對分析，對分離病原菌進行鑒定。結果表明，大田采集的所有甜瓜病果中均分離到培養(yǎng)性狀一致的細菌，細菌分離率為100%；所有分離菌株均對甜瓜果實具有致病性，該病原菌革蘭氏反應呈陰性，其菌落形態(tài)及生理生化測定結果與已報道的西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）一致；BLAST比對與A. citrulli 菌株的同源性可達100%，系統(tǒng)發(fā)育分析也進一步證實該病菌為A. citrulli。研究結果確定了甜瓜果斑病的致病菌，為該病的有效防治提供了依據。

關鍵詞：甜瓜；細菌性果斑病；病原菌鑒定；西瓜嗜酸菌；海南省東方市

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0124

中圖分類號：S652；S436.5 文獻標志碼：A 文章編號：1008‐0864（2024）03‐0117‐07

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物，是我國最早作為果品的瓜類。甜瓜在國內外廣泛種植，中國是最大的甜瓜生產國，栽培歷史悠久，并出口到東南亞等許多國家［1‐2］。因為氣候變化和栽培管理措施不足，甜瓜生產中出現(xiàn)的病害種類越來越多，其中細菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）對甜瓜危害最嚴重，可造成甜瓜的大范圍減產[3]，陜西省1988年就有該病的報道[4]。目前，由西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的瓜類細菌性果斑病在我國發(fā)生較為普遍，而甜瓜細菌性果斑病在新疆、內蒙古、北京、山東、吉林、福建等地均有發(fā)生，造成甜瓜減產甚至絕收[5-9]。于海博等[9]發(fā)現(xiàn)，果實感病初期呈淡綠或褐色水漬狀病斑，隨后病斑擴大，病菌侵入果肉組織，并導致褐變及腐爛。A. citrulli 除了為害果實，還可侵染葉片、種子等部位，在甜瓜整個生長周期均有可能被侵染[10‐11]。倪玉杰[12]研究指出，A. citrullis可在種子和土壤表面越冬，可通過風雨、昆蟲、農事操作傳播從傷口和氣孔侵染，高溫和高濕更有利于其發(fā)生。自1998 年張榮意等[13]首次報道海南樂東、東方等市縣種植的西瓜上發(fā)現(xiàn)細菌性果斑病以來，該病害在海南不斷發(fā)生和擴散。吉訓聰等[14]在海南樂東等甜瓜產區(qū)發(fā)現(xiàn)細菌性果斑病為害甜瓜果實。近年來，海南因其獨特的氣候條件已成為甜瓜的新興產區(qū)。海南大棚種植甜瓜的面積逐年增加，隨之而來的各種病害也時有發(fā)生且蔓延。其中，瓜類細菌性果斑病的危害就非常突出，據報道，該病在海南每年造成的損失可達5億元[15]。甜瓜是海南省東方市大力推廣種植的主要農業(yè)作物之一，2022 年東方市甜瓜多茬累計種植面積1.73 萬hm2，年產量91 萬t，占海南全省甜瓜總產量的32.5%左右[16]。2021—2022年筆者在海南省東方市多個甜瓜大棚基地調查發(fā)現(xiàn)，果實上有大量疑似細菌性果斑病的癥狀發(fā)生。由于該病具有發(fā)病迅速、傳播快、爆發(fā)性強等特點，田間一旦發(fā)病很難被控制，對瓜類種植業(yè)的危害極大。因此，本研究從海南省東方市3個甜瓜生產基地采集病果進行病原菌分離純化，并通過培養(yǎng)菌株形態(tài)、生理生化測定及分子鑒定的方法，對病原菌進行鑒定，旨在了解該病害的發(fā)生原因，明確其病原菌的種類，為生產中病害的綜合管理及有效防治提供理論依據，以促進甜瓜產業(yè)在海南的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的甜瓜果實采自海南省東方市共3個甜瓜種植基地，品種分別為‘ 紅冠‘ 金香玉和‘玉菇。

1.2 病害癥狀觀察與病原菌分離、純化

2021年11月和2022年4月在海南省東方市的3個甜瓜種植基地（經緯度分別為18.882 688°N、108.659 103° E，18.900 692° N、108.674 856° E，18.934 168°N、108.685 075°E）的甜瓜進行病害的田間調查并記錄發(fā)病癥狀，將新鮮的感病樣本帶回實驗室分離病原菌。

采用常規(guī)的組織分離法分離病原菌。首先于低倍顯微鏡下（40 ×）觀察病健交界處組織有無溢菌現(xiàn)象；然后將有溢菌的新鮮樣本用流水沖洗，待自然涼干后，選取要分離的病斑進行標記。用滅菌的解剖刀切取病健交界處的組織（5～10 mm），放入0.5%升汞中浸泡35 s，隨后放入75%酒精中洗脫8 s，最后用無菌水沖洗3次；然后取出組織塊加1 mL無菌水搗碎，浸泡30 min后，用接種環(huán)蘸取組織浸出液在LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉15.0 g加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.2）上劃線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，待長出單個菌落后，用接種環(huán)刮取菌液連續(xù)3次劃線接種到新的LB培養(yǎng)基平板中進行病原菌純化[9]。將純化菌株分別接種于斜面培養(yǎng)，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性測定

將純化獲得的20個菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，再轉移到LB 液體培養(yǎng)基于200 r·min-1、28 ℃搖培24 h。用分光光度計測定菌體含量，配制成1×108 CFU·mL-1細菌懸浮液備用。

采集成熟、健康的甜瓜（品種‘紅冠）果實備用，采用針刺法進行致病性測定。首先在甜瓜表面用滅菌針在每個點位進行刺傷，然后每個刺傷點接種20 μL細菌懸浮液，并用無菌水作為陰性對照。每個菌株在每個果實上接種3個點，重復5次，即每個菌株接種15個點。將接種好的甜瓜果實放入保鮮盒于30 ℃的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，2 d后觀察并記錄發(fā)病情況，若接種果實上產生與田間癥狀相似的褐斑，于顯微鏡下觀察到噴菌現(xiàn)象即為發(fā)病，并從病果上再次分離病菌，按柯赫法則確定菌株的致病性。

1.4 病原菌形態(tài)學觀察和革蘭氏染色

按照常規(guī)細菌形態(tài)學觀察方法[17‐18]，將分離純化后的菌株接種于LB培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落在培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、大小、顏色及菌落表面和邊緣生長狀況。參照格革蘭氏染色液試劑盒（上海吉至生化科技有限公司）使用說明書對菌株進行革蘭氏染色，并顯微觀察菌株形態(tài)及拍照。

1.5 病原菌生理生化特性測定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]，選取2個代表性菌株（HNTG01和HNF2.3），對病原菌進行熒光試驗及耐鹽性、淀粉水解、V-P測定、明膠液化、硝酸鹽還原和精氨酸雙水解酶產生、碳氮源利用等生理生化特性測定，重復3次。

1.6 病原菌16S rDNA 序列分析

將菌株加入LB液體培養(yǎng)基中，搖培24 h后的菌懸液轉入離心管離心，并用細菌DNA提取試劑盒（北京酷來搏技術有限公司）提取DNA，將獲得的DNA進行PCR擴增。參照文獻[9]合成16S rRNA通用引物序列5′-TGTACACACCGCCCGTCACAC-3′和5′-CCATTCAGAAATCTCCGGATC-3′。PCR 體系為：引物各1 μL、提取的DAN 1 μL、無菌水9.5 μL、Tag酶12.5 μL。PCR程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴增好的PCR產物進行凝膠電泳分離，使用DNA 回收試劑盒回收目標DNA 片段，將其送往上海生物工程技術服務有限公司進行序列測定，將測得的基因序列在GenBank的采用BLAST進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 甜瓜細菌性果斑病的田間癥狀及病原菌的分離

2021 年11 月和2022 年2 月對海南東方市3個甜瓜基地的田間調查發(fā)現(xiàn)，所有品種的甜瓜果實上均發(fā)現(xiàn)疑似細菌性病害的發(fā)生，其中‘金冠品種的發(fā)病最嚴重，一些大棚的發(fā)病率高達100％。該病的典型病癥為：初期果實表面出現(xiàn)水漬狀小斑點并逐漸擴大，且初期病變只局限于果皮，隨著時間延長漸變?yōu)楹稚蟀?，并造成穿孔，后期感染部位的果皮出現(xiàn)龜裂、凹陷（圖1），里面的果肉出現(xiàn)褐變腐爛。潮濕條件下，在病斑表面常常有溢出粘稠、透明的琥珀色菌膿。同時，在成熟葉片上也可發(fā)現(xiàn)病斑，早期為水漬狀斑點，后期受葉脈限制而呈現(xiàn)多角形或不規(guī)則褐色壞死病斑，病斑周圍明顯發(fā)黃，嚴重時病斑稍有凹陷，多個病斑可融合成大斑（圖1）。

采集‘紅冠‘金香玉和‘玉菇3個品種的37個病果上均分離到培養(yǎng)性狀非常相似的細菌，細菌分離率為100%。

2.2 病原菌對甜瓜果實的致病力

致病力測定發(fā)現(xiàn)，所有供試菌株的發(fā)病率均達100％。菌懸液接種2 d就出現(xiàn)明顯水漬狀病斑，4 d后部分菌株及其病斑出現(xiàn)流膿現(xiàn)象，切開甜瓜，可見果肉部分也出現(xiàn)明顯褐變，而對照部位無任何變化（圖2）。接種病原菌的甜瓜上均表現(xiàn)出與田間病害相似的癥狀，且從接種的病瓜上又重新分離到相同的菌株，根據柯赫氏法則證實分離菌株為病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)和革蘭氏染色

供試菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初期菌落呈圓形、乳白色，表面光滑不透明，中間微隆起，邊緣整齊（圖3A）。革蘭氏染色反應為陰性（圖3B），菌體短桿狀，大小為（2.0～3.0） μm×0.5 μm，無芽孢。

2.4 病原菌生理生化特性

生理生化特性測定結果如表1所示，2個供試菌株的試驗結果基本一致。測定結果為陽性的有：耐鹽性、過氧化氫酶、氧化酶、硝酸鹽還原和吐溫80 的分解試驗、明膠液化、葡萄糖發(fā)酵、甘露醇、山梨醇和肌醇的利用；測定結果為陰性的有：KBA培養(yǎng)基不產熒光、淀粉水解、甲基紅測定、乙酰甲基甲醇測定、吲哚的產生、產生果聚糖和精氨酸雙水解試驗。

2.5 病原菌16S rDNA 序列分析

將致病菌株HNTG01和HNF2.3的16S rDNA進行擴增，分別得到長為863和890 bp的片段，與GenBank中的核酸數據庫進行BLAST對比分析表明，該序列與西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli 3 菌株（ GU339091.1），M6 菌株（CP029373.1）和 JZ17 菌株（MG655621.1）的同源性為100％。系統(tǒng)發(fā)育分析結果也表明，致病菌株與A. citrulli 菌株聚為一類（圖4）。

3 討論

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的瓜類細菌性果斑病是為害西瓜和甜瓜等葫蘆科植物的一種毀滅性病害，也是世界各國公認的檢疫性病害。已被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄及全國農業(yè)植物檢疫性有害生物名單[15，19]。早期，致病菌被命名為燕麥噬酸菌西瓜亞種（Acidovoraxavenae subsp. citrulli）[20]，2008 年Schaad 等[21]將其更名為西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）。本次在海南省東方市的調查發(fā)現(xiàn)，該病比較常見，且在個別甜瓜種植區(qū)發(fā)病極為嚴重。從海南省東方市甜瓜基地采集回來的疑似瓜類細菌性果斑病的新鮮病果中均分離到培養(yǎng)性狀比較一致的細菌，結合形態(tài)特征、生理生化特性及分子生物學3個方面對病原菌進行鑒定，確定其為西瓜噬酸菌。采用16S rDNA 通用引物能夠準確、便捷地鑒定出西瓜噬酸菌，供試菌株與已報道的多個西瓜噬酸菌株的同源性達100%；同時，系統(tǒng)發(fā)育進化樹也證明本研究中的分離菌株與西瓜噬酸菌的親緣關系最近。

在調查中發(fā)現(xiàn)，甜瓜大棚中由于高溫、高濕，病害比較嚴重，除了細菌性果斑病，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的靶斑病對甜瓜葉片及果實為害也比較嚴重，還發(fā)現(xiàn)由鐮刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病等。本研究在少數果實的同一病斑上同時分離到細菌與真菌，其中細菌為西瓜噬酸菌，真菌經鑒定為多主棒孢。本次調查還發(fā)現(xiàn)，甜瓜生產上使用的殺菌劑種類多、施藥頻繁，個別大棚中使用的專門針對細菌病害的藥劑就有5種以上，但還是未能有效控制細菌性果斑病。推測可能存在以下原因：一是甜瓜品種抗病性差異，本次調查以‘紅冠品種發(fā)病最嚴重，同一大棚中，該品種全部發(fā)病，而另一甜瓜品種‘西州蜜的發(fā)病則很少；二是田間管理水平的差異，由于農業(yè)管理措施存在問題，在同一區(qū)域、相隔不到20 m不同種植戶的大棚內，甜瓜病害發(fā)生就存在明顯差異；三是有可能在殺菌劑選擇壓力下病原菌產生抗藥性。因此，本研究在確定細菌性果斑病菌后，還需加強對該病害在海南甜瓜上的發(fā)病流行規(guī)律、致病機理進行深入研究。另外，針對海南甜瓜多種病害的發(fā)生，后續(xù)就上述可能存在問題，有必要展開更深入的調查及研究工作，以建立高效安全的綜合防控措施，有效減輕和阻止甜瓜病害在海南進一步蔓延及為害。

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（責任編輯：張冬玲）