補骨脂異黃酮通過miR-497-5p調(diào)控對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移的機制研究

梁博 李國東 牟江月崔昭

[摘要]目的：探討補骨脂異黃酮通過調(diào)控miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移的機制研究。方法：體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞，使用濃度為0、9、18、36μg/ml補骨脂異黃酮處理細胞，記為Con組、低劑量組、中劑量組、高劑量組；按照脂質(zhì)體法miR-NC、miR-497-5p轉染細胞，記為miR-NC組、miR-497-5p組；按照脂質(zhì)體法anti-miR-NC、anti-miR-497-5p轉染細胞后，使用36μg/ml補骨脂異黃酮處理細胞，記為高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-497-5p組。CCK8、克隆實驗檢測細胞增殖；傷口愈合實驗檢測細胞遷移；Western blot實驗檢測Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平；qRT-PCR實驗檢測miR-497-5p表達水平。結果：補骨脂異黃酮呈劑量關系降低瘢痕疙瘩成纖維細胞活性、遷移率（P＜0.05），減少克隆細胞數(shù)（P＜0.05），降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平（P＜0.05），增加miR-497-5p表達水平。與miR-NC組相比，miR-497-5p組細胞活性、遷移率降低（P＜0.05），克隆細胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平降低（P＜0.05）。抑制miR-497-5p可以逆轉補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移的影響。結論：補骨脂異黃酮可能通過上調(diào)miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移。

[關鍵詞]補骨脂異黃酮；miR-497-5p；瘢痕疙瘩成纖維細胞；增殖；遷移

[中圖分類號]R285? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）06-0060-04

Mechanism Study on Proliferation and Migration of Keloid Fibroblasts Regulated by Psoralen Isoflavones Via miR-497-5p

LIANG Bo1， LI Guodong2， MOU Jiangyue1， CUI Zhao1

（ 1.Department of Dermatology， Baoding Second Hospital， Baoding 071051， Hebei， China; 2. Department of Gastroenterology， Baoding First Central Hospital， Baoding 071030， Hebei， China ）

Abstract： Objective? To investigate the mechanism of psoralen isoflavones inhibiting the proliferation and migration of keloid fibroblasts by regulating miR-497-5p. Methods? Keloid fibroblasts were cultured in vitro and treated with 0， 9， 18， 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were classified as Con group， low dose group， medium dose group and high dose group. The cells were transfected with miR-NC and miR-497-5p by liposome method， and were denoted as miR-NC group and miR-497-5p group. After transfection with anti-miR-NC and anti-miR-497-5p by liposome method， the cells were treated with 36 μg/ml psoralen isoflavones， which were denoted as high-dose group +anti-miR-NC group and high-dose group +anti-miR-497-5p group. Cell proliferation was detected by CCK8 and cloning assay. Cell migration was detected by wound healing test. The expression levels of Cyclin D1， MMP2 and MMP9 were detected by Western blot assay. The expression level of miR-497-5p was detected by qRT-PCR. Results? Psoralen isoflavones decreased the cell viability and migration rate of keloid fibroblasts （P＜0.05）， decreased the number of cloned cells （P＜0.05）， and decreased the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 （P＜0.05）， increase the expression level of miR-497-5p. Compared with the miR-NC group， the cell viability and migration rate of the miR-497-5p group were reduced （P＜0.05）， the number of cloned cells was reduced （P＜0.05）， and the protein expression levels of Cyclin D1， MMP2， and MMP9 were reduced （P＜0.05）. Inhibition of miR-497-5p can reverse the effect of psoralen isoflavones on the proliferation and migration of keloid fibroblasts. Conclusion? Psoralen isoflavones may inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts by increasing miR-497-5p.

Key words： psoralen isoflavones; miR-497-5p; keloid fibroblasts; proliferation; migration

瘢痕疙瘩主要是外傷或自發(fā)形成過度增長的病理性瘢痕組織，與正常皮膚界限表現(xiàn)明顯，瘢痕疙瘩一般呈暗紅或紫紅色，呈結節(jié)狀或片狀，常高出皮膚表面[1]。瘢痕疙瘩主要以手術、激光、藥物治療為主，但效果均不顯著且復發(fā)率高，嚴重影響患者生活質(zhì)量[2]。補骨脂是豆科植物補骨脂的成熟果實，具有溫腎助陽、溫脾止瀉等功效，外用能夠消風祛斑，有抗炎、抗菌和抗病毒等藥理活性[3]。有研究結果顯示，補骨脂異黃酮對人體皮膚創(chuàng)傷有治療作用，可能與抗炎、抗氧化作用有關[4]，但是補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩的研究尚不清楚。miRNA是短鏈非編碼RNA，與人類皮膚病有關，目前被證實的miRNA與瘢痕疙瘩有關，如miR-21、miR-141-3p、miR-181a等[5-6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在瘢痕疙瘩成纖維細胞中呈下調(diào)表達，過表達miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并誘導細胞凋亡[7]。關于補骨脂異黃酮和miR-497-5p對瘢痕疙瘩成纖維細胞的研究尚不清楚，鑒于此，本研究主要探究補骨脂異黃酮通過miR-497-5p影響瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移的機制，現(xiàn)報道如下。

1? 材料和方法

1.1 細胞和試劑：人瘢痕疙瘩成纖維細胞（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；補骨脂異黃酮（寶雞市辰光生物科技有限公司）；miR-NC、miR-497-5p、anti-miR-NC、anti-miR-497-5p、引物（廣州銳博公司設計合成）；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；CCK8試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Cyclin D1抗體、MMP2抗體、MMP9抗體、GAPDH抗體（美國Cellular Signaling Technology公司）；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Promega公司）。

1.2 細胞分離和分組：將人瘢痕疙瘩成纖維細胞從液氮罐內(nèi)取出，復蘇后使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。細胞生長狀態(tài)融合度達到80%，采用0.25%胰酶消化培養(yǎng)細胞。取對數(shù)期人瘢痕疙瘩成纖維細胞病接種96孔板中，融合度為60%，使用補骨脂異黃酮濃度為9、18、36μg/ml處理細胞，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組，以Con為對照，細胞內(nèi)加DMSO試劑；按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將miR-NC、miR-497-5p轉染細胞內(nèi)，記為miR-NC組、miR-497-5p組；按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將anti-miR-NC、anti-miR-497-5p轉染細胞后，使用補骨脂異黃酮濃度為36μg/ml處理細胞，記為高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-497-5p組。各組細胞設置9個復孔。

1.3 CCK8、克隆實驗檢測細胞增殖

1.3.1 CCK8實驗：收集各組人瘢痕疙瘩成纖維細胞然后以4×104個/毫升密度接種96孔板，培養(yǎng)48 h，然后加入10μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，使用酶標儀檢測細胞吸光度值（A），用來計算細胞活性（%）。

1.3.2 克隆實驗：將人瘢痕疙瘩成纖維細胞按照1.2的方法處理，以每孔500個細胞接種6孔板中，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d，直至觀察到克隆出現(xiàn)停止培養(yǎng)，使用甲醛固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞數(shù)，記為克隆細胞數(shù)目。

1.4 傷口愈合實驗檢測細胞遷移：將對數(shù)期人瘢痕疙瘩成纖維細胞接種6孔板中，細胞融合度生長到80%，使用無菌槍頭垂直劃線，使用PBS漂洗細胞2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。在0、24 h時拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=（0 h時劃痕寬度-24 h時劃痕寬度）/0 h時劃痕寬度×100%。

1.5 Western blot實驗檢測Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達：取各組人瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng)48 h，將總蛋白提取后經(jīng)過BCA法檢測定量蛋白濃度，然后將蛋白樣品使用SDS-PAGE凝膠分離蛋白，電泳結束迅速完成轉膜，在5%脫脂奶粉中封閉培養(yǎng)2 h，4℃加入一抗Cyclin D1（1∶800）、MMP2（1∶800）、MMP9（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）過夜孵育，次日與稀釋濃度為1∶5 000的二抗室溫孵育2 h，加入ECL試劑進行顯色，曝光、拍照。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參計算目的蛋白表達。

1.6 qRT-PCR實驗檢測miR-497-5p表達水平：取各組人瘢痕疙瘩成纖維細胞加入TRIzol試劑提取總RNA，紫外分光度計檢測RNA濃度，觀察是否在1.8～2.1之間，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，然后用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行擴增反應。以U6作為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計算miR-497-5p表達水平。

1.7 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，實驗結果以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，四組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞活性降低（P＜0.05），克隆細胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1蛋白表達水平降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

2.2 補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩成纖維細胞遷移的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組遷移率降低（P＜0.05），MMP2、MMP9蛋白表達水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.3 補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-497-5p表達的影響：與Con組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組miR-497-5p表達水平升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.4 上調(diào)miR-497-5p對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移的影響：與miR-NC組相比，miR-497-5p組miR-497-5p表達水平升高（P＜0.05），細胞活性、遷移率降低（P＜0.05），克隆細胞數(shù)減少（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平降低（P＜0.05）。

2.5 抑制miR-497-5p對補骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移的影響：與高劑量組+anti-miR-NC組相比，高劑量組+anti-miR-497-5p組miR-497-5p表達水平降低（P＜0.05），細胞活性、遷移率升高（P＜0.05），克隆細胞數(shù)增多（P＜0.05），Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

3? 討論

瘢痕疙瘩是皮膚科常見良性腫瘤，與成纖維細胞過度增長且膠原分泌過多有關[8]。瘢痕疙瘩治療方法比較多，但是容易復發(fā)從而影響治療效果，近年研究結果發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療瘢痕疙瘩效果明顯[9]。如雷公藤紅素可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促進細胞凋亡[10]。補骨脂外用可治療牛皮癬、斑禿等皮膚病，化學成分豐富多樣，藥理研究顯示具有良好的抗炎、抗腫瘤、抗菌等作用[11-12]。研究結果顯示，補骨脂酚通過增加COL-I表達，降低MMP-1、MMP-3表達，抑制紫外線誘導的光老化人皮膚成纖維細胞膠原合成[13]。補骨脂素對紫外線誘導的人皮膚角質(zhì)形成細胞老化有保護作用[14]。還有研究結果顯示，補骨脂異黃酮對中波紫外線誘導的人皮膚成纖維細胞凋亡具有保護作用，并能提高細胞抗氧化酶活性[15]。但是補骨脂異黃酮對瘢痕疙瘩研究不清楚。本研究結果顯示，補骨脂異黃酮呈劑量效應降低細胞活性、遷移率，減少克隆細胞數(shù)，降低Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達，提示補骨脂異黃酮抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移，從而抑制瘢痕疙瘩形成。

既往研究結果顯示，miRNA與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展有關[16]，如miR-21在瘢痕疙瘩成纖維細胞表達增加，miR-21通過降低Smad7表達抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原蛋白合成[17]。另有研究結果顯示，在瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-34a表達降低，其可能通過降低SATB1抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移和侵襲[18]。在瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-141-3p表達降低，上調(diào)miR-141-3p抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和遷移[19]。還有研究結果顯示，在瘢痕疙瘩組織中miR-152-5p低表達，Smad3是miR-152-5p靶基因，高表達miR-152-5p對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移有抑制作用，并促進細胞凋亡[20]。已有研究顯示，miR-497-5p與瘢痕疙瘩發(fā)展有關，可以作為瘢痕疙瘩潛在標記物[7]。本研究結果也顯示，補骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細胞后miR-497-5p表達增加，提示補骨脂異黃酮可能調(diào)控miR-497-5p表達。上調(diào)miR-497-5p能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移，進一步實驗結果顯示，抑制miR-497-5p對補骨脂異黃酮處理瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移的影響，提示補骨脂異黃酮可能通過增加miR-497-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移。

綜上所述，補骨脂異黃酮抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移，可能與miR-497-5p有關。

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[收稿日期]2022-11-28

本文引用格式：梁博，李國東，牟江月，等.補骨脂異黃酮通過miR-497-5p調(diào)控對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和遷移的機制研究[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（6）：60-64.