病毒載體遺傳毒性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

何偉偉，周長(zhǎng)慧，鄭明嵐，李嫚琪，崔文騰，方雅勵(lì)，王曉煒，常艷

（1.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)檢查長(zhǎng)三角分中心，上海 201203；3.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057）

近年來(lái)，基因治療在遺傳疾病和罕見病領(lǐng)域取得顯著成果，越來(lái)越多基于病毒載體的基因治療產(chǎn)品被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)上市。如何安全有效地將外源基因?qū)塍w外細(xì)胞或體內(nèi)組織，是安全高效實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵。目前主流的基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又可分為整合型病毒載體和非整合型病毒載體。整合型病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒（lentivirus，LV）載體等；非整合型病毒載體包括腺病毒載體和腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體等。AAV和LV載體在目前臨床試驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛［1］。

病毒載體因其自身優(yōu)勢(shì)在基因治療中表現(xiàn)突出，但也暴露了相關(guān)安全問(wèn)題，如遺傳毒性。病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性是由炎癥、隨機(jī)插入干擾正?；颉⒃┗虻募せ詈筒迦胪蛔兊葘?dǎo)致的［2-3］。通常表現(xiàn)為基因表達(dá)失調(diào)，甚至導(dǎo)致克隆擴(kuò)增和腫瘤發(fā)生［4-5］。載體介導(dǎo)的遺傳毒性可受病毒類型、整合位點(diǎn)和靶細(xì)胞類型的影響，不同載體具有不同細(xì)胞特異性整合傾向［6］。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）指南S2（R1）中描述了傳統(tǒng)的遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)，該試驗(yàn)存在局限于檢測(cè)DNA損傷或突變及只能得到短期結(jié)果的缺點(diǎn)［2］，因此不適用于評(píng)估載體介導(dǎo)的遺傳毒性。面對(duì)復(fù)雜多變的病毒載體整合特點(diǎn)及可能引發(fā)的相關(guān)安全問(wèn)題，對(duì)病毒載體進(jìn)行潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估勢(shì)在必行。本文對(duì)目前應(yīng)用廣泛的AAV 和LV 載體的生物學(xué)特性和整合途徑進(jìn)行簡(jiǎn)介，對(duì)已有的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述，并對(duì)建立準(zhǔn)確快速的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性的評(píng)價(jià)體系進(jìn)行展望，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 AAV和LV載體

1.1 AAV載體

AAV 屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，是一類微小、無(wú)被膜的線性單鏈DNA 病毒［7］，同時(shí)也是一種缺陷型病毒，需要輔助病毒的存在才能感染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生新病毒顆粒。無(wú)輔助病毒存在時(shí)，野生型AAV（wild type-AAV，WT-AAV）只能整合到19號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，形成潛伏感染，隨宿主細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制［7-8］。與WT-AAV 不同，重組AAV（recombination AAV，rAAV）載體通常是將WT-AAV 中的rep基因和cap基因用目的基因所取代，只保留AAV 基因組兩端的2 個(gè)反向重復(fù)序列。rAAV 作為基因治療載體，通過(guò)在載體上移除rep與cap消除其整合能力，因此缺乏rep介導(dǎo)的主動(dòng)整合，在宿主細(xì)胞中主要形成反向重復(fù)序列融合片段，稱為環(huán)狀連接游離體或游離串聯(lián)體［9］。rAAV 載體能同時(shí)感染分裂期和靜止期細(xì)胞，在未分裂細(xì)胞中，這些rAAV 載體基因組在宿主細(xì)胞生命周期中保持完整；在分裂細(xì)胞中，游離DNA 不隨宿主細(xì)胞DNA 復(fù)制，rAAV 載體的DNA 通過(guò)細(xì)胞分裂而丟失［10-11］。然而，rAAV 載體仍能以低頻率隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組中，可能是宿主細(xì)胞DNA修飾酶介導(dǎo)了該整合過(guò)程，同時(shí)造成了潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)［9］。

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，rAAV 載體整合有2種方式。一種是隨機(jī)整合，發(fā)生在DNA 損傷位點(diǎn)的非同源位置，通過(guò)非同源末端與宿主基因組連接發(fā)生整合；另一種是靶向整合，通過(guò)同源重組發(fā)生在特定位點(diǎn)［12］。rAAV 載體的整合位點(diǎn)通常位于活性轉(zhuǎn)錄單元和相關(guān)注釋附近，整合事件發(fā)生在CpG 島和富含GC 片段的頻率逐步增加，這與活性轉(zhuǎn)錄有關(guān)［13-14］。但不同物種間也存在整合位點(diǎn)偏好性，如新生小鼠的整合“熱點(diǎn)”包括Rian 位點(diǎn)、白蛋白和甲胎蛋白［15］；犬的整合“熱點(diǎn)”有早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因、細(xì)胞周期蛋白D1 基因、雙特異性磷酸酶1 基因和白蛋白［14］；非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類肝細(xì)胞相關(guān)研究也報(bào)道了白蛋白中的多個(gè)rAAV整合事件［16-17］。rAAV載體之所以能作為基因治療載體，是因其在人類中的低遺傳毒性特征，且無(wú)直接證據(jù)表明rAAV載體可在人類中介導(dǎo)宿主的遺傳毒性。目前普遍認(rèn)為，rAAV載體基因組仍然主要以附加體的形式存在于宿主細(xì)胞核［18］。

1.2 LV載體

LV 是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)屬，為二倍體RNA 病毒，因其潛伏期長(zhǎng)而被稱為L(zhǎng)V［1］。LV 的基因組整合過(guò)程首先從整合酶識(shí)別病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列開始，此時(shí)整合酶將宿主細(xì)胞的DNA 切斷，產(chǎn)生的黏性末端與病毒的DNA 相連接。整合進(jìn)去的前病毒DNA 會(huì)轉(zhuǎn)錄出病毒蛋白的mRNA 和病毒基因組RNA，二者在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中包裝成完整病毒顆粒，并以出芽方式釋放到細(xì)胞外［19-21］。人類免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）載體是應(yīng)用最早、最廣泛的LV 載體，因其轉(zhuǎn)運(yùn)外源基因穩(wěn)定且高效而成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)常用的載體工具。研究表明，HIV 載體更傾向于整合到轉(zhuǎn)錄活躍基因的內(nèi)含子中下游區(qū)域［22］，對(duì)轉(zhuǎn)錄活躍基因的轉(zhuǎn)錄單位有一定偏好性，但不包括轉(zhuǎn)錄起始單位［23-25］。LV載體整合位點(diǎn)的偏好性還會(huì)隨轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的活性狀態(tài)而變化，如HIV 均可整合在靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)的CD4+T 細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄單元中，但激活狀態(tài)的CD4+T 細(xì)胞的整合位點(diǎn)更常見于基因密集、CpG 島密集和G/C 堿基富集的基因組區(qū)域［26］。分裂和非分裂的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞之間的整合也有區(qū)別，相較于非分裂細(xì)胞，自失活（self inactivating，SIN）載體在分裂細(xì)胞中的整合優(yōu)先發(fā)生在基因編碼區(qū)域［27］。此外，對(duì)發(fā)生HIV 整合的靶DNA 上的核小體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明，核小體表面的向外DNA主凹槽有利于整合的發(fā)生，由此可以誘導(dǎo)原癌基因（如Evi1和B-Raf）激活［2］。LV 載體在基因治療中表現(xiàn)出高效性和安全性，但隨機(jī)整合的特性仍會(huì)引發(fā)難以預(yù)料的插入突變。因此，第1 代～第4 代LV 載體通過(guò)改造包膜蛋白、去除輔助蛋白、添加土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，以及開發(fā)SIN 載體和整合缺陷LV（integration-deficient LV）等方式，有效減少載體整合且提高病毒載體滴度［28］。

2 病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法

以病毒載體為遞送載體的基因治療產(chǎn)品，由于復(fù)雜的生物組成和特殊的作用機(jī)制，介導(dǎo)的遺傳毒性區(qū)別于傳統(tǒng)的遺傳毒性，主要為整合插入導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變、基因失活/激活或癌變的風(fēng)險(xiǎn)，因此其安全性評(píng)價(jià)不能完全采用化學(xué)藥的傳統(tǒng)毒理學(xué)方法［2-4］。全基因組分析、整合位點(diǎn)分析、核型分析和評(píng)估轉(zhuǎn)化潛力試驗(yàn)等方法能夠從不同角度對(duì)病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有針對(duì)性、高效性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。

2.1 脫靶修飾的全基因組分析

近年來(lái)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具潛力的基因編輯工具。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性主要取決于單鏈導(dǎo)向RNA（single guide RNA，sgRNA）的識(shí)別序列。由于設(shè)計(jì)的sgRNA 可能會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列形成錯(cuò)配，導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變效應(yīng)，該效應(yīng)稱為脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9 技術(shù)在被廣泛應(yīng)用的同時(shí)，發(fā)生脫靶效應(yīng)的頻率也在增加［29］。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)需要結(jié)合有效的體內(nèi)遞送方式才可能最終轉(zhuǎn)化為臨床疾病治療工具。目前可借助病毒載體或非病毒載體進(jìn)行遞送，其中AAV載體最為安全。AAV載體能感染分裂和非分裂細(xì)胞，并具有低免疫原性、高組織特異性、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等優(yōu)勢(shì)［30］。理想的基因編輯遞送工具應(yīng)兼具瞬時(shí)和高效的特點(diǎn)，以確保治療的安全性和有效性。而AAV載體作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送載體，進(jìn)入細(xì)胞后可支持CRISPR/Cas9 系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)Cas 蛋白；相較于瞬時(shí)表達(dá)，sgRNA 介導(dǎo)的脫靶概率將增大，加之AAV 載體可整合進(jìn)宿主基因組的潛在風(fēng)險(xiǎn)，將進(jìn)一步放大sgRNA介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)，造成不同程度的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。全基因組測(cè)序技術(shù)是對(duì)某物種基因組進(jìn)行測(cè)序得到其基因組序列的方法，分為體內(nèi)全基因組脫靶分析方法和體外全基因組脫靶分析方法，已由第1 代測(cè)序技術(shù)發(fā)展到第3 代，目前已經(jīng)成為分析脫靶效應(yīng)的主流方法，其中全基因組無(wú)偏雙鏈斷裂點(diǎn)測(cè)序（genomewide，unbiased identification of double strand breaks enabled by sequencing）和基因組環(huán)化測(cè)序（circularization forinvitroreporting of cleavage effects by sequencing）代表了迄今為止最具可擴(kuò)展性和易于復(fù)制的方法［31］。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有更加全面、精準(zhǔn)、高效等優(yōu)勢(shì)［32］，不足之處在于成本高、產(chǎn)量低，需要復(fù)雜的生物信息學(xué)知識(shí)，且對(duì)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和處理有巨大的計(jì)算需求。

2.2 基因組DNA的整合位點(diǎn)分析

整合位點(diǎn)分析可精確定位基因組中的插入，為評(píng)估縱向修飾基因和移植細(xì)胞群的克隆性提供了一種工具，該技術(shù)已成為整合載體系統(tǒng)以確定安全性和追蹤整合位點(diǎn)的主要基準(zhǔn)。最初病毒載體整合位點(diǎn)分析經(jīng)TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分離擴(kuò)增，用獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)分析整合位點(diǎn)特征［33］。由于PCR與測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，操作復(fù)雜、靈敏度低的分子雜交技術(shù)逐漸被取代，下一代測(cè)序（next-generation sequencing）逐漸成為主流的整合位點(diǎn)分析技術(shù)。根據(jù)PCR技術(shù)路線的不同，主要有反向PCR、連接介導(dǎo)型PCR（ligation-mediated-PCR，LM-PCR）和線性擴(kuò)增介導(dǎo)型PCR（linear amplification mediated-PCR，LAM-PCR）。

2.2.1 反向PCR

反向PCR 技術(shù)可對(duì)已知DNA 片段相鄰的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可檢測(cè)病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點(diǎn)和克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移文庫(kù)等［34］。首先使用限制性核酸內(nèi)切酶將宿主DNA打斷，然后對(duì)病毒載體末端重復(fù)序列設(shè)計(jì)反向引物并進(jìn)行擴(kuò)增，從而在連接酶的作用下已知序列（末端重復(fù)序列）與整合位點(diǎn)兩翼的未知序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析判斷其相對(duì)分子質(zhì)量后，可進(jìn)行TA 克?。═A cloning）及測(cè)序，獲得病毒載體整合位點(diǎn)特征［35］。反向PCR的主要優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)單快速，但其連接酶成環(huán)效率較低，導(dǎo)致使用范圍受限。

2.2.2 連接介導(dǎo)型PCR

LM-PCR 主要通過(guò)4 個(gè)步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)［36］：①模板DNA 的片段化處理；②針對(duì)病毒載體末端重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物；③模板片段與接頭連接；④進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序后即可揭示病毒載體整合位點(diǎn)特征。LM-PCR 具有靈敏度較高、使用通用引物擴(kuò)增均衡、對(duì)模板質(zhì)量要求低和產(chǎn)物產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也存在操作步驟相對(duì)繁瑣、面對(duì)復(fù)雜模板時(shí)易丟失片段等缺點(diǎn)［37-39］。使用限制性內(nèi)切酶對(duì)模板DNA進(jìn)行片段化處理，存在酶切偏好的局限性，因此LM-PCR 的衍生體，即剪切延伸引物標(biāo)簽選擇（shearing extension primer tag selection，S-EPTS）/LM-PCR 被開發(fā)，其使用超聲打斷法對(duì)模板DNA進(jìn)行片段化處理，隨機(jī)打斷的的方式克服了酶切的偏好性，使得擴(kuò)增效果大幅提高［40］。

Cristina 等［41］使用一種介導(dǎo)人CD18 的LV 載體，對(duì)白細(xì)胞黏附缺陷癥Ⅰ型進(jìn)行基因治療，并使用S-EPTS/LM-PCR 進(jìn)行整合位點(diǎn)分析。整合位點(diǎn)分析在Genewerk 實(shí)驗(yàn)室（德國(guó)）進(jìn)行，模板DNA用量為500 ng進(jìn)行擴(kuò)增，并使用超聲剪切儀剪切至中位長(zhǎng)度400～500 bp。使用長(zhǎng)末端重復(fù)序列特異性的生物素化引物對(duì)剪切的DNA 進(jìn)行延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)磁珠捕獲富集，然后連接到包括分子條形碼在內(nèi)的連接盒上。連接產(chǎn)物經(jīng)2輪指數(shù)PCR擴(kuò)增后采用MiSeq技術(shù)（Illumina平臺(tái)）進(jìn)行深度測(cè)序，最終在對(duì)應(yīng)的樣本中檢測(cè)到10個(gè)最顯著的插入位點(diǎn)。

2.2.3 線性擴(kuò)增介導(dǎo)型PCR

LAM-PCR 與LM-PCR 不同之處在于，在模板DNA 的片段化處理前引入線性擴(kuò)增，即對(duì)目標(biāo)序列（載體-基因組連接部分）設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行生物素化標(biāo)記，通過(guò)磁珠固相選擇去除非目標(biāo)DNA序列，保留的目標(biāo)序列則被進(jìn)行初始預(yù)擴(kuò)增（100個(gè)循環(huán)）。該步驟使得LAM-PCR 的靈敏度和特異性大幅提高，是目前識(shí)別位于已知DNA 附近的未知DNA 的最敏感方法［42］。LAM-PCR 同樣受到酶切偏好的限制。為此開發(fā)了一種LAM-PCR 的變體，稱為非限制性LAM-PCR，可繞過(guò)限制性消化，從而消除整合位點(diǎn)的酶切偏好性，有利于對(duì)宿主基因組中的原病毒位置進(jìn)行全面分析［43］。

Helen 等［44］使用LAM-PCR 對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)整合缺陷LV 的平滑肌細(xì)胞DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。磁珠捕獲生物素化的單鏈線性PCR 產(chǎn)物后，進(jìn)行了雙鏈DNA 合成。得到的雙鏈片段分別用Tsp509Ⅰ或MseⅠ酶切，連接盒接頭連接后進(jìn)行2輪指數(shù)擴(kuò)增。對(duì)所得到的LAM-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行深度測(cè)序并使用局部同源性搜索工具（basic local alignment search tool，BLAT）與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì)，最終分析了共同插入位點(diǎn)的傾向性。

2.2.4 靶向富集測(cè)序

靶向富集測(cè)序是一種捕獲基因組特定區(qū)域DNA 并進(jìn)行深度測(cè)序的方法［45］，其關(guān)鍵在于靶向富集。當(dāng)前高通量測(cè)序的靶向富集方法主要有2種［46］：①雜交捕獲法，主要利用探針雜交富集目標(biāo)片段，適用于基因組目標(biāo)區(qū)域的全面檢測(cè)，但依賴于成百上千個(gè)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)、復(fù)雜的微陣列芯片制造和較長(zhǎng)的雜交時(shí)間；②多重PCR 擴(kuò)增法，其核心是引物設(shè)計(jì)，先通過(guò)PCR 擴(kuò)增富集目標(biāo)片段，再進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，適用于研究的目標(biāo)區(qū)域相對(duì)較小，對(duì)于拷貝數(shù)較低的模板DNA，可產(chǎn)生足夠數(shù)量用于測(cè)序的擴(kuò)增子，這種方法能明顯提高效率，節(jié)約時(shí)間，降低經(jīng)濟(jì)成本；不足之處在于存在引物互相干擾和非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題［45］。CRISPR/Cas9 靶向富集方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了上述2 種靶向富集方法的不足，該方法具有無(wú)PCR 擴(kuò)增、保留堿基修飾信息、實(shí)現(xiàn)高測(cè)序深度、低錯(cuò)誤率和低成本的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)［47］。靶向富集測(cè)序在評(píng)估病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性時(shí)，能夠捕獲和測(cè)序載體基因組，并確定載體拷貝數(shù)；可以對(duì)一個(gè)給定的載體進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證，對(duì)載體基因組進(jìn)行定量分析，揭示整合位點(diǎn)的整體克隆性并闡明每個(gè)細(xì)胞和載體基因組拷貝的整合頻率。

2.3 核型分析

病毒載體與宿主基因組發(fā)生整合，尤其當(dāng)整合發(fā)生在基因組不穩(wěn)定區(qū)域，如衛(wèi)星DNA 序列、回文序列和CpG 島，則更容易自發(fā)斷裂，導(dǎo)致缺失、插入和易位等［48］。因此，精準(zhǔn)確定目的基因在宿主染色體上的位置成為重中之重。核型分析技術(shù)為檢測(cè)克隆性異常相關(guān)核型及可能的染色體重排提供了可能。傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)是診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在診斷周期長(zhǎng)、易培養(yǎng)失敗、操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜、對(duì)技術(shù)人員要求較高等局限［49］。核型分析對(duì)染色體的輕微結(jié)構(gòu)異常不能做出明確診斷，尤其是對(duì)具有相似條紋或相似片段的染色體易位的診斷有一定難度；而熒光原位雜交技術(shù)可很好克服該局限性，能夠分析一部分染色體顯帶技術(shù)不易分辨的異常［50］。光譜染色體自動(dòng)核型分析技術(shù)是在熒光原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常能作出快速而準(zhǔn)確的診斷，更可以揭示常規(guī)分析方法難以識(shí)別的染色體易位、重排和一些未知來(lái)源的標(biāo)記染色體［51］。

2.4 評(píng)估細(xì)胞轉(zhuǎn)化潛力實(shí)驗(yàn)

病毒載體基因組插入到宿主基因組可干擾宿主細(xì)胞鄰近基因的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后活性，病毒載體中的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子能使癌基因或腫瘤抑制基因表達(dá)失調(diào)，并引起插入突變導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化［3］。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的常用方法，也是體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化的金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，缺點(diǎn)是不適合進(jìn)行高通量篩選［52-53］。低附著生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)是一種快速且可定量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測(cè)方法，彌補(bǔ)了軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的不足［54］。此外，還開發(fā)了體外永生化法［55-56］，能夠檢測(cè)由于病毒載體插入導(dǎo)致原代小鼠骨髓細(xì)胞中原癌基因Evi1表達(dá)水平的上調(diào)，但耗時(shí)較長(zhǎng)；還有白細(xì)胞介素2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［57］和白細(xì)胞介素3非依賴性突變體選擇法［6］，以及利用Cdkn2a-/-易感腫瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)病毒載體介導(dǎo)的插入誘變，但這些試驗(yàn)既耗時(shí)又昂貴［58-59］。

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的《基因治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》中指出，基因治療產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性、是否最終會(huì)發(fā)生癌變依然缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知［60］。目前的遺傳毒性檢測(cè)策略在很大程度上依賴于檢測(cè)相對(duì)較短的暴露后對(duì)DNA 的影響（損傷或突變）和突變的表達(dá)期，但病毒載體介導(dǎo)的插入誘變，可能需要較長(zhǎng)時(shí)間才能在患者中顯現(xiàn)出來(lái)。雖然小鼠中常見的整合位點(diǎn)顯示與人類癌基因和腫瘤抑制基因有顯著重疊［59］，但仍應(yīng)考慮檢測(cè)不太常見的插入位點(diǎn)的范圍。此外，Bokhoven 等［6］提出病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評(píng)估方法需要具備可定量、可再現(xiàn)并能檢測(cè)基因功能的獲得/缺失、確定整合位點(diǎn)等。因此，已有的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法需要不斷優(yōu)化，以評(píng)估病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性。這些優(yōu)化包括使用受體群體來(lái)源的細(xì)胞來(lái)避免疾病和（或）年齡因素的影響，以及使用可能增強(qiáng)體外模型的體內(nèi)相關(guān)性并支持長(zhǎng)期培養(yǎng)的3D 模型［2，7］。同時(shí)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行新方法開發(fā)與創(chuàng)新。期待能不斷拓寬且加深對(duì)病毒載體的認(rèn)識(shí)，對(duì)其有清晰的、系統(tǒng)的認(rèn)知，從而經(jīng)過(guò)科學(xué)、慎重、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)木C合考慮，開發(fā)通用型的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法，建立完整的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評(píng)價(jià)體系，以用于早期、準(zhǔn)確、快速地評(píng)價(jià)病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性。