煙草葉斑病菌Cumuliphoma indica的生物學特性及室內(nèi)藥劑篩選

安宣鮮　桑維鈞　張得平　李昊熙　楊江敏　雷雪梅　王五權(quán)　楊茂發(fā)

關(guān)鍵詞：煙草；葉斑??；Cumuliphoma indica；生物學特性；藥劑篩選

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A

煙草（Nicotiana tabacum L.）隸屬于茄科煙草屬，原產(chǎn)于美洲，是一年生的草本植物，其葉是煙草產(chǎn)品生產(chǎn)中最主要的材料，是世界上種植十分普遍的一種重要經(jīng)濟作物[1-2]。近年來，隨著煙草種植制度的改變，氣候條件變化，品種單一以及煙草連作障礙等問題的加重，煙草病害流行范圍變廣，危害程度愈發(fā)嚴重，經(jīng)濟損失也越來越大[3-6]。其中，煙草葉斑類病害是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一，在煙草的整個生育期都有發(fā)生，可直接導致煙草產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低[7-8]。

2021 年，課題組在廣西壯族自治區(qū)賀州市發(fā)現(xiàn)一種發(fā)生在煙草生育中后期，病斑為白色，外周有黃色暈圈的葉斑病，對病原進行了分離鑒定，明確該病原菌為Cumuliphoma indica，此為國內(nèi)該病原菌在煙草上的首次報道[9]。C. indica 隸屬于子囊菌門（ Ascomycota ）、腔菌綱（ Loculoascomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、亞隔孢殼科（Didymellaceae）、Cumuliphoma 屬[10]。Cumuliphoma是2018 年VALENZUELA-LOPEZ 等建立的新屬，其模式種為C. omnivirens，該模式種由基物異名Phoma omnivirens 新組合而來[10]。早在2009 年AVESKAMP 等[11]報道了P. omnivirens 可引起菊科、豆科和白花丹科多種植物病害。2018年，江艷等[12]將在貴州發(fā)生的煙草莖點病的病原鑒定為P. omnivirens，其后，商勝華等[13]的研究明確了P. omnivirens 菌絲生長的最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，最適溫度為30 ℃，最適pH 為10，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣，致死溫度為58 ℃，以及發(fā)現(xiàn)3%中生菌素對該病原菌菌絲生長的抑制效果最好。

2021 和2022 年對廣西壯族自治區(qū)主要植煙區(qū)煙草真菌性葉斑病害種類的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害在鐘山縣公安鎮(zhèn)、燕塘鎮(zhèn)以及富川瑤族自治縣朝東鎮(zhèn)、石家鄉(xiāng)、福利鎮(zhèn)、新華鄉(xiāng)、柳家鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有發(fā)生，田間發(fā)病率在30%左右，該病對煙葉生產(chǎn)具有潛在的危害性。目前，關(guān)于C. indica生物學特性以及防治方面的研究基本處于空白，亟待進一步研究。本研究通過測定分離菌株的致死溫度以及不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳氮源、光照周期對菌絲生長的影響，以明確C. indica 的生物學特性，同時探究9 種化學藥劑對病原菌生長的抑制作用，旨在為該病害的有效防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2021 年，采用常規(guī)組織分離法[14]從15 份廣西壯族自治區(qū)賀州市鐘山縣煙草（品種：K326）病葉樣品中分離得到2 株C. indica 菌株（編號分別為HZGA75、HZGA79），保存于貴州大學煙草學院植物病理實驗室， 選用菌株HZGA75 用于后續(xù)試驗研究。

1.1.2 供試培養(yǎng)基供試培養(yǎng)基分別為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA，北京索萊寶科技有限公司）、察氏培養(yǎng)基（CDA，北京索萊寶科技有限公司）、燕麥培養(yǎng)基（OA，北京索萊寶科技有限公司）和自配番茄汁瓊脂培養(yǎng)基（TomA，自配）、山藥汁瓊脂培養(yǎng)基（YA，自配）、煙葉汁瓊脂培養(yǎng)基（TobA，自配）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA，自配）。自配培養(yǎng)基配方參照方中達[14]的方法等量配比。

1.1.3 供試藥劑本試驗所用的殺菌劑種類、廠家及處理濃度詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物學特性研究（1）不同類型培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響。將菌株HZGA75接在PDA 平板上于28 ℃全黑暗培養(yǎng)3 d。采用內(nèi)徑為5 mm 的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，菌絲面朝下（下同）接種至上述8 種培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基3 個重復，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑[15]。下同。

（2）溫度對病原菌菌絲生長的影響。將5 mm的菌餅接種在新的PDA 培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理3 次重復[16]。

（3）pH 對病原菌菌絲生長的影響。以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1% HCl 和1% NaOH 溶液調(diào)配培養(yǎng)基的pH 為8 個不同梯度（4、5、6、7、8、9、10、11），將5 mm 菌餅接在培養(yǎng)皿中央，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理重復3次[17]。

（4）碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響。以察氏培養(yǎng)基（CDA）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對照，將培養(yǎng)基中的蔗糖用相同含量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代；同理，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基為對照，以等量的蛋白胨、硝酸銨、牛肉浸粉、氯化銨，尿素、甘氨酸、丙氨酸代替培養(yǎng)基中的硝酸鈉，將5 mm 菌餅分別接在含不同碳氮源的培養(yǎng)皿上，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理重復3 次[18]。

（5）光照周期對病原菌菌絲生長的影響。將5 mm 的菌餅接在PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行24 h 持續(xù)光照、L/D=12 h/12 h 光暗交替和24 h 持續(xù)黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理重復3 次[19]。

（6）菌絲致死溫度測定。將5 mm 的菌餅接入裝有1 mL 無菌水的離心管中，分別于40、45、50、55、60、65 ℃的恒溫水浴鍋中持續(xù)處理10 min（提前預熱1 min），計時結(jié)束后立即置于常溫水中冷卻至室溫，隨后將處理的菌餅接種于無菌PDA 培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理3 次重復[20]。

1.2.2 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用采用菌絲生長速率法測定9 種藥劑對菌株HZGA75菌絲生長的抑制效果。經(jīng)初篩得出各藥劑的試驗終濃度（表1）。將不同濃度的藥劑溶液加入PDA培養(yǎng)基中充分混勻，制作表1 濃度的含藥平板，以添加相同體積無菌水的PDA 平板作為對照，每個處理設(shè)3 次重復。接菌后將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑不同劑量處理對病原菌菌絲生長的抑制率，并求出各藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC₅₀）[21]。

抑制率=（對照菌落直徑–處理菌落直徑）/（對照菌落直徑–菌餅直徑）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用 Excel 2010 和SPSS Statistics 26軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的生物學特性

2.1.1 不同類型培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響菌株 HZGA75 在8 種供試培養(yǎng)基上均可生長，在CMA、CDA 兩種培養(yǎng)基上生長最快，二者間無顯著差異，但顯著優(yōu)于其他6 種培養(yǎng)基；在CDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后菌落直徑達到60.50 mm；在WA培養(yǎng)基上生長最慢，其次是TomA 培養(yǎng)基（圖1）。

2.1.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響菌株HZGA75 在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長且差異顯著；在5 ℃和35 ℃下菌株菌絲均不生長；在溫度為28 ℃時菌絲生長最快，顯著高于其他溫度處理，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑分別達到43.83 mm（圖2）。因此28 ℃為該病原菌菌絲生長的最適溫度。

2.1.3 不同pH 對病原菌菌絲生長的影響。菌株HZGA75 對酸堿度的適應(yīng)范圍廣，在pH為4～11范圍內(nèi)均可生長（圖3）。在pH 為5 時的菌落直徑顯著大于其他處理， 培養(yǎng)7 d 后分別達到38.33 mm。在pH 為4 時菌落直徑與其他處理有顯著差異，培養(yǎng)7 d 后僅達到18.50 mm。

2.1.4 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響菌株 HZGA75 在8 種不同的碳、氮源培養(yǎng)基上均可生長。在供試碳源中，菌株HZGA75 對可溶性淀粉的利用效果最佳，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑達66.33 mm；在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑均明顯小于對照，但是對照的菌落菌絲生長極為稀疏（圖4）。

在供試氮源中，菌株HZGA75 對蛋白胨的利用效果最佳，其生長速度顯著高于其他氮源處理，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑分別為64.83 mm（圖5）。

2.1.5 不同光照周期對病原菌菌絲生長的影響光照處理對病原菌菌絲生長有顯著性影響。菌株HZGA75 在持續(xù)光照培養(yǎng)條件下生長最快，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑可達47.16 mm，其次是在光暗交替的條件下；在連續(xù)黑暗處理下最慢，培養(yǎng)7 d后菌落直徑分別為35.00 mm（圖6）。

2.1.6 致死溫度測定菌株 HZGA75 在45 ℃處理后菌絲均能生長，在50 ℃處理下則未生長。再以45 ℃為起始溫度，1 ℃為梯度進行逐漸升溫水浴處理，結(jié)果顯示經(jīng)≥49 ℃的溫度水浴10 min處理后菌絲在培養(yǎng)基上不再生長，因此推斷病原菌菌絲的致死溫度為49 ℃水浴10 min。

2.2 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

由表 2 可知，9 種殺菌劑對菌株HZGA75 菌絲生長表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中50%啶酰菌胺WG 的抑制效果最好，EC₅₀為0.025 mg/L；其余依次為50%咯菌腈FS、500 g/L 異菌脲SC、450 g/L 咪鮮胺EW、80%代森錳鋅WP、10%苯醚甲環(huán)唑ME、25%吡唑醚菌酯SC和40%腈菌唑SC，EC₅₀分別為0.084 mg/L、0.217 mg/L、1.354 mg/L、6.565 mg/L、9.576 mg/L、34.237 mg/L 和38.804 mg/L；430 g/L 戊唑醇SC 的抑制效果較差，EC50 為42.574 mg/L。

3 討論

Cumuliphoma 是VALENZUELA-LOPEZ 等[10]通過系統(tǒng)發(fā)育分析新建立的屬，該屬真菌可存在于土壤、植物以及人類呼吸道中。目前，有關(guān)C. indica引起植物病害方面的報道除本課題組報道的煙草葉部病害外[9]，關(guān)于其生物學特性和防治方面的研究未見報道。本研究對已分離鑒定的病原菌菌株HZGA75 進行了生物學特性測定及有效殺菌劑的篩選。其生物學特性研究結(jié)果表明，病原菌可在10～30 ℃的溫度范圍內(nèi)生長，28 ℃時病原菌菌絲生長最快，菌絲最低致死溫度為49 ℃水浴10 min，此結(jié)果與VALENZUELA-LOPEZ 等的研究結(jié)果存在差異，同時與同屬真菌C. omnivirens的生物學特性存在較大差異，導致該差異的原因可能與不同寄主、地域以及物種進化有關(guān)。供試菌株對酸堿度的適應(yīng)性較廣，在pH 為4～11 的范圍內(nèi)菌絲均可生長，pH 為5 時病原菌菌絲生長最快，其次是pH 為6，說明弱酸性的環(huán)境更適于該菌菌絲生長。供試菌株可利用多種碳、氮源，在供試的8 種碳源和8 種氮源的培養(yǎng)基上均可生長，病原菌最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源均為蛋白胨。由于本研究的供試菌株HZGA75 分離自廣西壯族自治區(qū)賀州市，該地區(qū)屬于中亞熱帶季風氣候區(qū)，具有雨熱同季、高溫高濕的氣候條件[22]，適宜該病原菌的生長。同時賀州市大部分地區(qū)土壤偏酸性[23]，且前人研究分離的C. indica 菌株可來自于土壤[11]，推測土壤可作為該病原菌生存的重要場所，在條件適宜的情況下可對煙草葉片進行侵染，該病原菌引起的煙草葉斑病在賀州市煙區(qū)存在一定的潛在危害。針對該病原菌引起的病害，在生產(chǎn)上應(yīng)加強田間管理以及水肥合理管控來預防病害的暴發(fā)流行。

現(xiàn)階段化學防治仍是煙草葉部病害防治中最有效的方法。鑒于C. indica 較難培養(yǎng)產(chǎn)孢，本研究采用菌絲生長速率法測定了9 種化學藥劑對病原菌菌絲生長的影響，結(jié)果表明50%啶酰菌胺WG 對病原菌菌絲生長的抑制效果最佳，EC₅₀為0.025 mg/L， 其次為50%咯菌腈FS，EC₅₀為0.084 mg/L。已有研究表明啶酰菌胺對煙草生產(chǎn)中出現(xiàn)的赤星病、灰霉病、Didymella segeticola葉斑病、煙葉霉爛病等葉部病害的病原菌均有較好的抑制效果和病害防效[24-27]。為此，在生產(chǎn)上可選用50%啶酰菌胺WG 對C. indica 葉斑病進行防治。