實(shí)驗(yàn)動物血清膠凍樣成因分析及消除方法探索*

饒玉良 馬淑蘭 張亞東 王見之 王 浩 嚴(yán)鈺鋒

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海市 200032

動物血清是常用的實(shí)驗(yàn)材料,血清質(zhì)量往往決定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。動物血清制備常出現(xiàn)一些異常情況,如血清析出,但呈膠凍樣血清。膠凍樣血清對血清學(xué)檢測過程和數(shù)據(jù)造成很大影響,嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。減少血清膠凍樣的形成,對涉及血清學(xué)檢測的實(shí)驗(yàn)都具有重要意義。本文基于血液凝固機(jī)制,重點(diǎn)分析實(shí)驗(yàn)動物血清膠凍樣的成因,并探索消除血清膠凍樣的系列方法,減少血清膠凍樣的形成,對于血清學(xué)檢測具有重要的意義。

1 動物血清及其制備

血清學(xué)檢測不同指標(biāo)可反映動物生理和病理狀況,對疾病檢測診斷、動物模型復(fù)制、疾病機(jī)制研究、治療效果評價等,具有重要意義。

1.1 血清組成成分 血清呈淡黃色,為血液凝固后析出透明液體,不含纖維蛋白原,能維持血液黏度、酸堿度、滲透壓等。血清成分復(fù)雜,包含水、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、總膽固醇、多肽等,還含有尿素氮、肌酐、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等。血清成分及含量常常變化,與供血動物性別、年齡、生理、病理和營養(yǎng)狀況等有關(guān)。凝血時血小板釋放大量物質(zhì),凝血因子也都發(fā)生變化,血清成分發(fā)生改變。纖維蛋白原活化為成纖維蛋白,與血漿顯著區(qū)別是血清無纖維蛋白原。動脈血和靜脈血的血清成分上也會有區(qū)別。

1.2 血清析出過程 血液凝固有三個過程:凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纖維蛋白形成,最根本的是血漿可溶性纖維蛋白原活化成不可溶的纖維蛋白。血液樣本在未加抗凝劑的情況下,血小板破裂釋放凝血激活酶,在系列凝血因子參與下,凝血酶原活化為凝血酶,纖維蛋白原活化為纖維蛋白單體;凝血酶激活凝血因子ⅩⅢ為活性凝血因子ⅩⅢa,纖維蛋白單體聚合為不溶纖維蛋白多聚體,交織成網(wǎng)狀,血細(xì)胞、血小板被網(wǎng)羅其中,血凝塊形成,淡黃色透明的血清析出。

1.3 血清制備方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物、采血部位和采血要求的不同,采血方式方法也不同。若采用一次性注射器從動物血管中吸出血液后,取下針頭,將血液沿著離心管壁緩緩注入離心管,離心管室溫靜置2～4h,或37℃水浴或恒溫箱預(yù)處理0.5～1h。待血清析出后,3 000～4 000r/min離心10min,上清即為澄清透明的淡黃色血清。

2 血清膠凍樣物質(zhì)的成分分析

凝血是復(fù)雜的反應(yīng)過程,最終表現(xiàn)為血凝塊形成和血清析出。采血后血液未完全凝固就離心,使紅細(xì)胞、活化血小板離開纖維蛋白網(wǎng),紅細(xì)胞、活化血小板沉積,而纖維蛋白因缺乏磷脂表面,無法收縮沉積,且其比重較小,離心后留在血清層,形成膠凍樣[1]。

血清膠凍樣物質(zhì)的具體成分目前還未見相關(guān)研究報道。根據(jù)血液凝固和血清析出的機(jī)制推測,膠凍樣物質(zhì)可能是膠原蛋白、纖維蛋白原,或活化但尚未收縮的纖維蛋白。部分膠凍樣血清是因供血動物過于肥胖、脂肪過多,纖維蛋白及脂肪過多聚集于血清,而形成膠凍狀血清[2],顯示血清膠凍樣的形成與脂肪可能有關(guān)。

3 血清膠凍樣的成因分析

實(shí)驗(yàn)動物采血制備血清時,會遇到有血清析出但血清呈膠凍樣不能吸出的現(xiàn)象,也曾遇到血清澄清透明但吸出后變成膠凍樣的現(xiàn)象。動物血清呈膠凍樣主要包括以下原因。

3.1 血液靜置時間短 采血后,血液在離心管或采血管內(nèi)啟動凝血過程,纖維蛋白原在凝血酶作用下活化為纖維蛋白,纖維蛋白單體交聯(lián),交織成不溶的網(wǎng)狀纖維蛋白多聚體,血細(xì)胞被網(wǎng)羅于內(nèi),血凝塊形成,血清析出。采血后放置時間不夠長,血液凝固不完全就離心,易形成膠凍樣血清[3]。

3.2 溫度不合適 血液樣本放置的環(huán)境溫度也會影響血清析出。冬季氣溫低,酶活力低,血液中纖維蛋白原不易充分活化、成網(wǎng)、沉淀,易導(dǎo)致膠凍樣血清形成,故冬季膠凍樣血清更易出現(xiàn)。環(huán)境溫度過高,也可能因血液水分揮發(fā),血清缺水而形成膠凍狀[4]。

3.3 食物和營養(yǎng)狀況的影響 動物進(jìn)食后,機(jī)體各器官功能活躍,血液成分含量變化較大,進(jìn)食后采血更易出現(xiàn)膠凍樣血清。采血時間宜在進(jìn)食前或進(jìn)食2h后,畜禽宜禁食8h(空腹)后再采血,常早晨或午后采血。禽類24h內(nèi)喝水太少,血清也不易析出。常高蛋白質(zhì)高脂肪飲食,動物容易營養(yǎng)過剩、高血脂,血液中纖維蛋白和脂肪過多,易出現(xiàn)乳白色膠凍樣血清。

3.4 動物品種的影響 實(shí)驗(yàn)動物常用家兔、大鼠、小鼠、豚鼠、蟾蜍等,也會用到牛、豬、狗、雞、鴨等。雞血清更易出現(xiàn)膠凍狀[4],鵝、鴨類本來就血脂高,易形成膠凍,可以采前多飲水來改善。 實(shí)驗(yàn)動物性別、年齡、生理、病理和營養(yǎng)狀況等因素影響血清構(gòu)成成分及含量,不同的實(shí)驗(yàn)動物個體血液狀況不同,有些更易形成膠凍樣。

3.5 采血部位的影響 不同的采血部位,也可能影響血清膠凍樣的出現(xiàn)。動脈血和靜脈血成分不同,血清析出也會有影響,因此,動靜脈采血部位對血清制備也有影響。不同品種動物采血部位不同,也會有影響。豬的前腔靜脈和耳靜脈均可采血,前腔靜脈通常用于大批量采血。禽翅膀內(nèi)側(cè)腋下靜脈和心臟均可采血,翅膀內(nèi)側(cè)腋下靜脈常用,心臟采血多見于對淘汰禽檢測或技能競賽。牛頸靜脈和尾根靜脈可采血,奶牛多尾根靜脈采血,羊頸側(cè)靜脈采血常用。

3.6 采血器材的影響 使用一次性的真空采血裝置采血,若采血后活塞未打開一定空隙,血清便不容易分離出來;采用注射器采集血液后,如果未取下針頭便快速將血液推入離心管,易導(dǎo)致溶血及血清渾濁;若采用抗凝管采血,則會影響血液凝固血清析出。玻璃試管血清析出的效果比塑料離心管好,膠凍較少。若采用促凝管采血,管內(nèi)促凝劑會加速血液凝固,更快更好地獲取血清。采血量以采血管容積的1/3為宜,不宜超容器2/3。大、中型實(shí)驗(yàn)動物全血量不少于5mL。為保障充足的血清量,大、中型實(shí)驗(yàn)動物析出血清不宜少于1mL,禽及寵物血清量不宜少于0.5～1mL。采血量少、采血斷斷續(xù)續(xù)、抗凝管采血,易導(dǎo)致血清量不足或膠凍樣。

3.7 影響因素 動物實(shí)驗(yàn)中,尤其介入性手術(shù)操作,易引入抗凝物質(zhì),對血清會產(chǎn)生影響。采血部位酒精未完全揮發(fā)時采血,酒精可能滲入血液, 血清更易出現(xiàn)膠凍樣。 疾病也容易導(dǎo)致血清呈膠凍樣。漿細(xì)胞疾病(如多發(fā)性骨髓瘤等)會引起漿細(xì)胞異常增殖,單克隆免疫球蛋白增多,異常免疫球蛋白或片段劑量過量而沉淀,可導(dǎo)致組織變性以及淋巴細(xì)胞浸潤,引發(fā)器官功能障礙。免疫球蛋白濃度過高,增加血液黏稠度,導(dǎo)致廣泛病理損傷。多發(fā)性骨髓瘤患者血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和組織因子等水平升高,大量M蛋白與纖維蛋白原相互作用, 損傷纖維蛋白的聚合作用,引起患者血清易出現(xiàn)膠凍樣[5]。

4 血清膠凍樣的消除方法

4.1 加強(qiáng)動物免疫和科學(xué)飼養(yǎng) 根據(jù)動物種類和免疫要求,科學(xué)規(guī)范免疫,確保實(shí)驗(yàn)動物健康?？茖W(xué)合理均衡飼喂,確保動物營養(yǎng)均衡和生理指標(biāo)的正常。對于特殊模型動物,按照建模要求科學(xué)制定建模方案。

4.2 嚴(yán)格注意采血時機(jī)、溫濕度和放置時間 通常早晨或午后,動物空腹或禁食8h后采血,盡可能減少攝食對血液的影響。血清制備與環(huán)境溫濕度關(guān)系密切。采血過程中注意樣品保溫,尤其冬季,采樣時可在采樣箱內(nèi)放置保暖袋,溫度控制在37℃左右。采樣后將樣品37℃培養(yǎng)箱中放置1～2h,待血清析出后,3 000～4 000r/min離心10min。若離心前血清析出良好,離心后裝入離心管內(nèi)形成凝膠,可在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的前提下,放置在56℃水浴鍋或金屬浴鍋中加熱0.5h,促進(jìn)纖維蛋白凝結(jié)[6]。若時間到仍有凝膠,可適當(dāng)延長加熱時間。

4.3 采血操作科學(xué)規(guī)范 根據(jù)動物種類和血清要求,選擇合適采血方式、采血部位和采血器材。使用一次性真空采血器采血后,將采血器活塞盡可能拉到最大刻度,套上針頭帽,采血器針頭朝上自然傾斜30°～45°角靜置[7],血清自然析出,血液樣本避免陽光直射[8]。離心過程時,放置在離心機(jī)轉(zhuǎn)子外圈離心孔中也能在一定程度減少膠凍血清的出現(xiàn)。

4.4 適度混勻有利于血清形成 動物采血后,顛倒混勻血液樣本,再靜置于室溫或孵育箱,待血液完全凝固血清析出后再離心。若采血后樣本直接靜置,不顛倒混勻,血液樣本的細(xì)胞成分自然沉降,血液凝固,血液細(xì)胞成分和血清分離,有時也不易通過離心獲得合格血清。

4.5 其他解決方案 動物實(shí)驗(yàn)中,如出現(xiàn)完全膠凍樣血清,可采用無菌針頭或移液槍槍頭將膠凍樣物質(zhì)挑出,再靜置或離心,血清便再次分離出來。若某采血部位分離的血清易呈膠凍樣或混濁,更換采血部位也可得到理想血清。

5 討論

在現(xiàn)代科學(xué)研究中,動物血清是常用的實(shí)驗(yàn)材料,血清質(zhì)量的好壞往往直接影響實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。動物血清制備過程中,常因血液靜置時間不夠長、溫濕度因素、動物種屬、個體差異、飲食和營養(yǎng)狀況、疾病狀況、采血部位、采血器材、藥物因素等影響,血清可能呈膠凍樣,或完全凝固沒有血清析出,必然會影響血清學(xué)試驗(yàn)及血清成分檢測。血清質(zhì)量是血清學(xué)檢測的前提,因此,對血清膠凍樣成因分析和探討消除辦法,對于血清學(xué)檢測具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)動物血清廣泛應(yīng)用于各種血清學(xué)檢測,不僅適用于科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué),還適用于動物疫病檢測、免疫效果評價等多種場景,在傳染性疾病防控、畜牧養(yǎng)殖業(yè)等廣泛應(yīng)用。因此,分析血清膠凍成因,探索消除膠凍樣血清的方法,減少血清膠凍樣的形成,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文通過對血清膠凍成因的系統(tǒng)分析,梳理歸納血清膠凍的主要成因,并據(jù)此提出消除膠凍的相應(yīng)解決方案,對動物實(shí)驗(yàn)中減少膠凍樣血清有積極作用。然而,由于動物個體差異等因素,以及還未完全掌握血清膠凍的成因等多方面原因,還沒有真正意義上完全解決血清膠凍的形成,還有待后續(xù)繼續(xù)研究機(jī)制和不斷積累解決方案。