澳洲石斛疫病病原菌的鑒定及其殺菌劑毒力測定

林接英 吳浩芳 麥章龍 張云霞

關(guān)鍵詞：澳洲石斛；棕櫚疫霉；毒力測定

石斛屬（Dendrobium）是蘭科植物第二大屬[1]。我國石斛蘭資源豐富，主要分布在華南、西南和臺灣等地區(qū)[2]。石斛分為觀賞石斛和藥用石斛[3]，澳洲石斛（D. kingianum）屬于觀賞石斛，原產(chǎn)于澳大利亞，隨國外觀賞洋蘭的引進和推廣而逐漸進入我國蘭花市場[4]。因其花型小、色彩絢麗和長勢強，近年來越來越受到國內(nèi)花卉愛好者喜愛，成為最具觀賞性的花卉種類之一[5]。

然而，病害是限制石斛蘭生產(chǎn)，影響其觀賞價值和經(jīng)濟價值的重要因素之一。目前，國內(nèi)外已報道的石斛（Dendrobium spp.）植物主要病害有鐮刀菌（Fuarium spp.）引起的莖腐病、齊整小核菌（Sclerotium rolsii）引起的白絹病、棕櫚疫霉（Phytophthora palmivora）引起的疫病[6]、終極腐霉（Pythium ultimum）引起的黑腐病[7]和炭疽菌（Colletotrichum spp.）引起的炭疽病[6]等。其中，根莖部病害對其生產(chǎn)影響較大。王國榮等[8]對浙江省杭州市鐵皮石斛（D. officinale）上發(fā)生的2 種莖腐病進行了研究，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS 基因序列分析，明確其病原菌為齊整小核菌（S. rolsii）和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），2 種病害的發(fā)病率達到30%以上。曹瑱艷等[9]對浙江省金華市發(fā)生的鐵皮石斛根腐病菌進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚垣鐮刀菌（F. chlamydosporum）是其主要病原菌。李夢嬌[10]將云南鐵皮石斛莖腐病的病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌，該病害在云南的發(fā)病率在20%以上。但是，以上相關(guān)病害的報道主要集中在鐵皮石斛和金釵石斛等藥用石斛上。目前，尚無澳洲石斛相關(guān)病害的報道。

近年來，筆者在病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，廣東某花場的澳洲石斛病害發(fā)生嚴(yán)重，受害植株葉片初期呈水漬狀，葉片和莖基部腐爛，后期干枯死亡，發(fā)病率達20%。為明確該病害的病原菌種類，為病害防控提供理論依據(jù)，本研究對其病原菌進行了鑒定，并針對病原菌進行了殺菌劑的室內(nèi)篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 發(fā)病的澳洲石斛采自廣東某花場，接種植株為健康的澳洲石斛。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[11]、馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液[12]、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基[13]和V8 培養(yǎng)基[14]。采用PDA 培養(yǎng)基進行菌株分離、菌種保存和菌落形態(tài)觀察，采用WA 培養(yǎng)基純化菌株，采用V8 培養(yǎng)基誘導(dǎo)疫霉孢子囊和厚垣孢子，采用PD 培養(yǎng)液培養(yǎng)接種菌[15]。

1.1.3 供試殺菌劑 供試殺菌劑共10 種，分別為：80%代森錳鋅WP（美國陶氏益農(nóng)公司），78%百菌清WP[先正達（蘇州）作物保護有限公司]，50%嘧菌酯WG（河北冠龍農(nóng)化有限公司），80%三乙膦酸鋁WP（利民化學(xué)有限責(zé)任公司），68%精甲霜靈·代森錳鋅WG（瑞士先正達作物保護有限公司），35%甲霜靈WP（浙江禾本科技有限公司），23.4%雙炔酰菌胺SC（寧波石原金牛農(nóng)業(yè)科技有限公司），50%烯酰嗎啉WG（河北冠龍農(nóng)化有限公司），72.2%霜霉威鹽酸鹽AS[拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司]，50%多菌靈WP（上海悅聯(lián)化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 （1）病原菌的分離。采用常規(guī)組織分離法[8]。取發(fā)病植株的葉和莖稈，沖洗晾干，在病健交界處切取約5 mm×5 mm 的小塊，75%乙醇消毒10～20 s，2.5%次氯酸鈉溶液消毒10～20 s，無菌水漂洗3 次，最后用無菌濾紙吸干組織塊表面的水分，移至PDA 平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)。

（2）菌株的純化。采用頂端菌絲法[8]。待菌落長出后，挑取邊緣的頂端菌絲移至新的PDA 平板上。培養(yǎng)2～3 d 后，取少量菌絲在WA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d，于顯微鏡下再次切取頂端菌絲，移至新的WA 平板上培養(yǎng)1 d，再切取頂端菌絲。重復(fù)3 次，獲得純化菌株，于13 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）菌落形態(tài)特征觀察。純化菌株轉(zhuǎn)接至PDA 平板上置于26 ℃下培養(yǎng)，12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)交替。分別于第3 天和第5 天測量菌落直徑，拍照并記錄菌落形態(tài)特征[15]。

（4）顯微形態(tài)特征觀察。純化菌株轉(zhuǎn)接至V8平板上置于26 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)交替培養(yǎng)。5 d 后觀察孢子囊及厚垣孢子形態(tài)并測量大小，孢子囊及厚垣孢子各測30 個[15]。

1.2.2 病原菌分子鑒定 （1）真菌基因組DNA的提取。純化菌株轉(zhuǎn)接至PDA 平板上培養(yǎng)4 d，收集菌絲，采用CTAB 法提取菌株基因組DNA。

（2）PCR 擴增和測序。采用TUBUF2 和TUBUR1 引物對β-tubulin（tub）基因進行擴增[16]。

PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)熱3 min；94 ℃變性30s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃終延伸10 min，于17 ℃保存。PCR 產(chǎn)物送至廣州天一輝遠基因科技有限公司測序，將測序結(jié)果輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源性比對。

（3）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。從NCBI 網(wǎng)上下載可信度高的相關(guān)序列，在MAFFT 網(wǎng)站（https：//mafft.cbrc.jp/）進行序列比對，采用BioEdit 軟件進行序列剪切。以Pythium aphanidermatum 作為外群，在CIPRES 網(wǎng)站（http：//www.phylo.org/）用RAxML-HPC2 on XSEDE （8.2.8）工具采用最大似然法（maximum likehood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)1000 次重復(fù)。

1.2.3 致病性測定 純化菌株轉(zhuǎn)接至PD 培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)4 d，過濾得到菌絲，配置成3%（m/V）的菌絲懸浮液用于接種。從心葉部位澆注2 mL菌絲懸浮液，套袋保濕2 d。以接種無菌水作為對照（CK）。每個處理重復(fù)3 盆。接種植株置于25 ℃植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.2.4 殺菌劑對病原菌的毒力測定 （1）含毒培養(yǎng)基的配置。根據(jù)殺菌劑的推薦濃度進行預(yù)實驗。在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇各藥劑對病原菌菌絲生長抑制率在10%～90%范圍內(nèi)的濃度；每種殺菌劑按等比設(shè)置5 個濃度梯度。按殺菌劑的有效成分含量分別用無菌水稀釋成一定濃度梯度的母液，在PDA 培養(yǎng)基中加入已配制好的殺菌劑母液，制成不同濃度梯度的含藥平板。在PDA 培養(yǎng)基中加入等量的無菌水作為空白對照。

（2）菌絲生長速率的測定。菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板培養(yǎng)5 d，用打孔器（d=6 mm）在菌落邊緣打取菌餅，移至含藥平板的中央，每個濃度3 個重復(fù)。培養(yǎng)皿置于26 ℃下培養(yǎng)。待對照菌落長滿培養(yǎng)皿時，采用“十”字交叉法測量菌落直徑，計算平均值。按以下公式計算抑菌率：抑菌率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%；再算出每種藥劑的有效濃度，每種藥劑使用抑菌率和有效濃度2 組數(shù)據(jù)在DPS統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)值型數(shù)據(jù)機值分析，求出10種藥劑的毒力回歸方程、致死中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲石斛疫病的癥狀及致病性測定

該病害主要為害植株的莖桿和葉片。受害莖稈變褐，軟腐，逐漸向上向下擴展，后期皺縮。感病葉片初期為水漬狀、暗綠色濕腐，后期葉片干枯脫落，植株死亡（圖1A～圖1C）。

接種植株7 d 后開始發(fā)病，新葉接種部位初期水漬狀，逐漸變褐色，而后擴展成濕腐狀；發(fā)病部位沿葉片向下擴展，莖稈逐漸變褐，軟腐（圖1D、圖1E）。接種14 d 左右，葉片干枯，莖稈皺縮，后期植株死亡（圖1F）。對照植株未表現(xiàn)癥狀（圖1G～圖1I）。

2.2 澳洲石斛疫病病原菌的培養(yǎng)性狀及顯微形態(tài)

在 PDA 培養(yǎng)基上澳洲石斛疫病病原菌的菌落呈圓形（圖2A，圖2B），白色，絮狀，邊緣整齊，生長速率為6～7 mm/d。孢子囊倒梨形（圖2C～圖2E），多頂生，具有明顯乳突，大小為（39～80）μm×（23～40）μm （ 平均大小為59 μm×31 μm）；厚垣孢子無色，近圓形，頂生或間生（圖2F，圖2G），直徑為25～43 μm（平均大小為33 μm）。該病原菌的形態(tài)特征與鄭小波[17]描述的棕櫚疫霉（P. palmivora）基本一致。

2.3 澳洲石斛疫病病原菌的分子鑒定

采用引物TUBUF2 和TUBUR1 進行tub 基因片段擴增，得到約900 bp 的產(chǎn)物。將產(chǎn)物進行測序，獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站進行BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)供試病原菌菌株（NCBI 登錄號OP404090和OP404091）與P. palmivora（NCBI 登錄號MAFF235788）的相似度為99%。

利用NCBI 上下載的菌株和供試病原菌菌株基于tub 基因構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，結(jié)果顯示，供試病原菌的2 個菌株SHL918、SHL921 與P.palmivora 位于同一分支，支持率為100%，親緣關(guān)系較近（圖3）。

因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起澳洲石斛疫病的病原菌鑒定為棕櫚疫霉（P.palmivora）。

2.4 殺菌劑對澳洲石斛疫病病原菌的抑制作用

毒力測定結(jié)果表明，供試的10 種殺菌劑中以雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、甲霜靈和精甲霜靈·代森錳鋅4 種殺菌劑對澳洲石斛疫病病原菌棕櫚疫霉的毒力較高，EC50 分別為0.000 03、0.0628、0.2381、0.5457 μg/mL；其次是百菌清、嘧菌酯和代森錳鋅， EC50 分別為2.1811 、7.0083 、8.1427 μg/mL。而霜霉威鹽酸鹽和三乙膦酸鋁的抑制效果差，EC50 均大于100 μg/mL；多菌靈基本無抑制作用，EC50 大于1000 μg/mL。10 種藥劑的相關(guān)系數(shù)范圍在0.9726～0.9946 之間，說明藥劑濃度與抑制作用呈顯著正相關(guān)（表1）。

3 討論

在形態(tài)學(xué)特征觀察的基礎(chǔ)上，結(jié)合tub 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起澳洲石斛疫病的病原菌鑒定為棕櫚疫霉（P. palmivora）。棕櫚疫霉侵染澳洲石斛引起疫病為首次報道。石斛屬植物疫病已有相關(guān)研究，病原物多為煙草疫霉（P. nicotianae）。李靜等[18]和王曉陽[19]分別對浙江鐵皮石斛（D. candidum）和廣東金釵石斛（D. nobile）發(fā)生的疫病進行了研究，發(fā)現(xiàn)其病原菌均為煙草疫霉（P. nicotianae）。TAO 等[20]將云南思茅的4 種石斛植物（D. thyrsiflorum、D. chrysanthum、D.aurantiacum 和D. chrysotoxum）的疫霉病菌也鑒定為煙草疫霉。而李夢嬌[10]結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS 序列分析發(fā)現(xiàn)，引起云南德宏鐵皮石斛（D.candidum）疫病的病原菌為棕櫚疫霉。但是，目前尚無棕櫚疫霉侵染澳洲石斛的報道。

棕櫚疫霉（ P. palmivora ） 屬于卵菌門（Oomycota）霜霉科（Peronosporaceae）疫霉屬（Phytophthora）。該菌是一種重要的植物病原菌，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄主范圍廣，包括果樹、蔬菜和觀賞植物等170 余種植物[21]。棕櫚疫霉能侵染植物的根、莖、葉和花等各部位，引起根莖腐、葉片凋萎或脫落，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡，給生產(chǎn)帶來重大損失。據(jù)報道，棕櫚疫霉能侵染榴蓮（Durio zibethinus）的各個部位，引起根腐、莖枯和果腐等，在東南亞國家造成的經(jīng)濟損失達10 億美元[22]。該菌還可以侵染可可（Theobroma cacao）引起黑果病，該病害每年在全球造成的產(chǎn)量損失在20%～30%之間[23]。棕櫚疫霉也是觀賞植物上的重要病原菌。油棕（Elaeisguineensis）芽腐病是由該菌引起的一種毀滅性的病害，2016 年該病害在哥倫比亞爆發(fā)，造成的經(jīng)濟損失達2.5×108 美元[22]。該菌還能侵染米蘭（Aglaia odorata）、蝶蘭（Phalaenopsis wilsonii）、絲蘭屬（Yucca sp.）和長壽花（Kalanchoe blossfeldiana）等10 余種觀賞植物[17， 24-25]。本課題組在廣東發(fā)現(xiàn)的澳洲石斛疫病，為害嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株死亡，發(fā)病率達20%。由于棕櫚疫霉在生產(chǎn)上的危害性，因此應(yīng)對該病害引起重視。

進一步選用10 種殺菌劑對澳洲石斛疫霉病病原菌棕櫚疫霉進行室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)，雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、甲霜靈和精甲霜靈·代森錳鋅4種殺菌劑對其毒力較強，研究結(jié)果可為石斛蘭疫病的田間防控提供理論依據(jù)。程東美等[26]對棕櫚疫霉引起的一品紅疫病進行了室內(nèi)毒力測定和田間防效試驗，發(fā)現(xiàn)雙炔酰菌胺和精甲霜·錳鋅具有較好的室內(nèi)毒力和大田防效，而三乙膦酸鋁、霜霉威和多菌靈的抑菌效果較差。王自然等[27]研究發(fā)現(xiàn)50%烯酰嗎啉和68%精甲霜·錳鋅對引起檸檬苗疫病的棕櫚疫霉抑菌效果較好。本研究結(jié)果與以上研究基本一致。但是，由于殺菌劑的室內(nèi)毒力測定結(jié)果不能完全反映其大田防效，因此，本研究篩選出的4 種殺菌劑的田間防效還需進一步的大田驗證。