核桃內(nèi)果皮發(fā)育研究進(jìn)展

王芬, 吳婷*, 張萍, 張強(qiáng), 劉麗

1. 貴州省黔西南州晴隆縣林業(yè)局, 貴州 晴隆 561400；

2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830052；

3. 新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所, 新疆 烏魯木齊 830000；

4. 宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 四川 宜賓 644003

核桃（Juglans regiaL.）是我國分布最為廣泛的經(jīng)濟(jì)樹種之一[1]，種植核桃已經(jīng)成為地方農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展、實(shí)現(xiàn)脫貧致富的支柱型產(chǎn)業(yè)。核桃是一種集多種營養(yǎng)要素于一身的優(yōu)良特色干果和油料樹種，也是我國重要的“木本糧油”戰(zhàn)略樹種[2]。核桃果實(shí)外部的硬殼實(shí)際上是核桃果實(shí)的內(nèi)果皮，近年來早實(shí)薄殼核桃主栽品種在生產(chǎn)上均出現(xiàn)內(nèi)果皮發(fā)育不完全、果仁外露、縫合線不緊密等諸多問題，嚴(yán)重地影響了核桃內(nèi)外觀品質(zhì)、貯運(yùn)性和商品價(jià)值。收集國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，進(jìn)行歸納、總結(jié)和比較分析，對(duì)目前核桃內(nèi)果皮發(fā)育的研究成果進(jìn)行綜合和梳理，為生產(chǎn)實(shí)踐中制定合理的繁育管理措施、減少露仁、裂果等的發(fā)生提供基礎(chǔ)參考資料，也可為深入開展核桃硬殼形成機(jī)制的研究打下一定的理論基礎(chǔ)。

1 核桃內(nèi)果皮的發(fā)育過程

目前在核桃良種選育、優(yōu)質(zhì)高效栽培方面急需進(jìn)行的工作之一就是了解核桃堅(jiān)果硬殼發(fā)育的過程及其影響因子。當(dāng)前針對(duì)這些問題，主要集中在核桃堅(jiān)果內(nèi)果皮發(fā)育的影響因子、核桃內(nèi)果皮發(fā)育與木質(zhì)素代謝的關(guān)系、麻核桃不同發(fā)育程度與核桃內(nèi)果皮主要成分的關(guān)系和核桃木質(zhì)素代謝過程中相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析等方面。相關(guān)科研人員研究發(fā)現(xiàn)：在內(nèi)果皮厚度與種仁品質(zhì)相關(guān)性分析中，種仁品質(zhì)隨著內(nèi)果皮厚度的增大而明顯增加，而出仁率隨著內(nèi)果皮厚度的增大而明顯減少[3]。不同核桃品種內(nèi)果皮厚度存在著一定的差異性，縫合線緊密度越高其內(nèi)果皮就越厚，而其裂果率和蟲果率就越低，在初加工過程中清洗的污染率就隨之下降[4]。由此可知，核桃內(nèi)果皮在其外觀品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)效益上起著重要作用。

核桃的果皮由內(nèi)、中、外3 層組成[5]，核桃內(nèi)果皮為堅(jiān)硬的核殼，其結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，由多層薄壁組織構(gòu)成，前期細(xì)胞體積小、排列緊密，后期木質(zhì)化形成石細(xì)胞層；中果皮主要由兩層石細(xì)胞和薄壁組織構(gòu)成，外果皮由薄壁組織和表皮層組成。

核桃堅(jiān)果成熟的整個(gè)過程是從雌花柱頭枯萎開始至青皮變黃開裂為止，構(gòu)成整個(gè)果實(shí)的發(fā)育期[6]。核桃內(nèi)果皮在發(fā)育過程中細(xì)胞木質(zhì)化加厚、非常堅(jiān)硬并且組織結(jié)構(gòu)非常致密，其木質(zhì)化主要表現(xiàn)在硬核期。吳國良等[7]研究表明，內(nèi)果皮發(fā)育后期細(xì)胞壁增厚并迅速石細(xì)胞化，成為堅(jiān)硬的果殼。李夕勃[6]研究認(rèn)為在核桃果實(shí)硬核期，其內(nèi)果皮的硬化是由頂部逐漸向底部進(jìn)行的，核殼內(nèi)隔膜與褶壁的彈性、機(jī)械強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)，核殼表面呈現(xiàn)起伏狀紋路且機(jī)械強(qiáng)度加大。

2 影響核桃內(nèi)果皮發(fā)育的主要成分

目前國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為影響核桃內(nèi)果皮發(fā)育的成分主要有木質(zhì)素[6,8-12]、纖維素[13-16]、棕色素[17-21]等。肖玲等[5]通過植物顯微切片觀察，內(nèi)果皮發(fā)育也就是內(nèi)果皮的薄壁細(xì)胞逐漸向石細(xì)胞分化的過程，也是細(xì)胞的次生壁形成、厚度增加并逐漸木質(zhì)化的過程。植物的木質(zhì)化過程是木質(zhì)素在其組織中的沉積，導(dǎo)管壁的次生細(xì)胞壁變厚就是木質(zhì)素連續(xù)沉積的結(jié)果[6,22]。而在木質(zhì)化細(xì)胞中，核桃內(nèi)果皮最主要的成分木質(zhì)素是從細(xì)胞壁一角開始逐漸發(fā)展到初生細(xì)胞壁、次生細(xì)胞壁的生物合成活動(dòng)[8]。木質(zhì)素、纖維素和半纖維素是核桃內(nèi)果皮的主要成分，木質(zhì)素和纖維素的生物合成過程是內(nèi)果皮形成的主要過程[23]。

木質(zhì)素是一種高碳含量的復(fù)合聚合物，其通過共價(jià)鍵和氫鍵與纖維素、半纖維素相互交織且主要沉積在特殊細(xì)胞類型的次生壁中，使其具有剛性和防水性能。嚴(yán)格控制的生長程序確保了在這些特化細(xì)胞的分化過程中木質(zhì)素沉積的適當(dāng)時(shí)間和位置[24]。

李夕勃[6]發(fā)現(xiàn)18 個(gè)核桃品系間核桃內(nèi)果皮中木質(zhì)素含量存在明顯差異；核桃果實(shí)在發(fā)育過程中內(nèi)果皮木質(zhì)素含量的變化明顯，從果實(shí)硬核期開始到成熟過程中木質(zhì)素含量逐漸增加，木質(zhì)素含量與硬殼厚度呈極顯著正相關(guān)。靳麗鑫等[25]研究發(fā)現(xiàn)麻核桃發(fā)育非正常的內(nèi)果皮較正常內(nèi)果皮木質(zhì)素含量嚴(yán)重不足，而發(fā)育非正常的內(nèi)果皮較正常內(nèi)果皮纖維素含量遠(yuǎn)超其上。試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃中木質(zhì)素和纖維素的生物合成調(diào)控機(jī)制是相互補(bǔ)充的，即在木質(zhì)素含量不足時(shí)纖維素彌補(bǔ)性增加其含量。文菁等[26]研究認(rèn)為在木質(zhì)素的沉積和含量測定分析中，硬核初期細(xì)胞層數(shù)隨著核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的沉積增加而增多，內(nèi)果皮細(xì)胞層數(shù)逐漸穩(wěn)定之后木質(zhì)素的積累表現(xiàn)為次生壁增厚。纖維素的變化情況接近于木質(zhì)素。而在硬核期核桃未聚集正常發(fā)育所需的葡萄糖、阿魏酸，可能是影響木質(zhì)素、纖維素等形成的原因，而導(dǎo)致內(nèi)果皮的木質(zhì)化進(jìn)程受到抑制[27]。陳鵬鵬[28]對(duì)波斯核桃殼厚表型的分析表明，PXC1 基因果實(shí)發(fā)育階段的表達(dá)量的改變證明PXC1 基因可能參與調(diào)控纖維素含量的變化。

棕色素屬于天然色素中的植物色素類，是堅(jiān)果硬殼中不可或缺的組成成分[29]。陳志勇、李維莉等[17，30]從核桃殼中提取到耐熱好、有抗氧化性能的脂溶性棕色素和有一定的耐光性和熱穩(wěn)定性水溶性好的棕色素。研究表明麻核桃發(fā)育不良硬殼棕色素含量遠(yuǎn)低于正常硬殼，說明棕色素對(duì)麻核桃硬殼發(fā)育有較大影響[25]。

3 影響核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中木質(zhì)素合成的環(huán)境因素

已有研究文獻(xiàn)中，對(duì)影響核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中木質(zhì)素合成的環(huán)境因素的研究目前主要在光照、礦質(zhì)元素和外源激素這幾個(gè)方面。

3.1 光照

光照對(duì)核桃生長發(fā)育、花芽分化及開花結(jié)實(shí)均具有重要的意義。結(jié)果期核桃一般要求全年日照2 000 h及以上，若低于1 000 h 則會(huì)引起內(nèi)果皮和種仁發(fā)育不良。核桃堅(jiān)果內(nèi)果皮發(fā)育的充實(shí)度比例隨著光照時(shí)間的增加而升高[31]。木質(zhì)素合成與光照時(shí)間呈極顯著正相關(guān)，向陽面光線充足因此木質(zhì)素沉積相對(duì)背陰面較多，核桃內(nèi)果皮的機(jī)械強(qiáng)度也隨之加強(qiáng)[32]。李夕勃[6]研究發(fā)現(xiàn)同一樹體不同部位果實(shí)內(nèi)果皮中木質(zhì)素等其他成分及與木質(zhì)素相關(guān)酶活性因樹體部位光照的不同而存在差異。調(diào)查結(jié)果表明，核桃樹冠由于外圍光照遠(yuǎn)高于內(nèi)膛，因此外圍果實(shí)發(fā)育不良的比例遠(yuǎn)低于內(nèi)膛[33,34]。核桃果實(shí)內(nèi)果皮發(fā)育過程中栽植密度小的園中木質(zhì)素和多酚含量高于栽植密度大的園，且核桃堅(jiān)果的品質(zhì)更優(yōu)[35]。

3.2 礦質(zhì)元素和外源激素

靳麗鑫[36]通過施N、P、K、Ca 處理，發(fā)現(xiàn)堅(jiān)果硬殼發(fā)育正常率的提高、木質(zhì)素含量的增加與施肥量呈顯著正相關(guān)。通過對(duì)麻核桃堅(jiān)果硬殼主要成分間相關(guān)性分析可知：N、P 肥能使木質(zhì)素含量增加，而K 肥對(duì)木質(zhì)素含量的影響是先降后升的。Ca 肥對(duì)木質(zhì)素合成的影響不大，但對(duì)纖維素合成的影響有一定的抑制。寧萬軍等[37]在核桃果實(shí)硬殼期噴施K、Zn、Ca、Mg 肥，顯著提高了核桃品質(zhì)并降低了露仁率。龍國輝[38]以稀釋倍數(shù)為1 500 倍液的螯合鈣對(duì)核桃葉面進(jìn)行噴施能促進(jìn)核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素合成。魚尚奇等[39]發(fā)現(xiàn)生長素IAA 在核桃內(nèi)果皮硬化過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。鹿宏麗[40]認(rèn)為不同濃度GA3和IAA 處理增加了核桃果殼厚度和硬殼機(jī)械強(qiáng)度。

4 核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中木質(zhì)素合成相關(guān)酶（基因）

4.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）

苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）是一個(gè)可把苯丙氨酸用于酚類化合物合成的酶。在組織中的活性可隨外界因素而發(fā)生顯著變化，有時(shí)還受光敏色素所支配。也是苯丙烷代謝途徑中的第一限速酶，它可催化苯丙氨酸脫氨基生成反式肉桂酸[41,42]。有研究認(rèn)為PAL 是木質(zhì)素代謝途徑的關(guān)鍵酶和光調(diào)控酶[43]，光照時(shí)間長的部位相對(duì)光照時(shí)間短的部位，PAL 酶活性較強(qiáng)，木質(zhì)素沉積較多[31]。李夕勃[6]研究發(fā)現(xiàn)核桃硬殼在發(fā)育過程中PAL 的活性先升高后降低，之后略升高再降低，與硬殼中木質(zhì)素含量呈正相關(guān)。文菁等[26]研究發(fā)現(xiàn)核桃硬殼發(fā)育過程中PAL 活性在硬殼分化的初期較高，之后逐漸降低，這是因?yàn)橐鹉举|(zhì)素的積累需要PAL 酶活性達(dá)到一定的水平，因而出現(xiàn)了在木質(zhì)化之前PAL 酶活性相對(duì)較高。郭永翠等[44]研究發(fā)現(xiàn)，露仁核桃‘溫138’前期PAL 基因表達(dá)遠(yuǎn)低于后期表達(dá)，可能是前期木質(zhì)素代謝中間產(chǎn)物形成太少、木質(zhì)素積累不足的緣故而導(dǎo)致核桃內(nèi)果皮發(fā)育不完全。

4.2 多酚氧化酶（PPO）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）常會(huì)引起植物發(fā)生褐變，原因是與底物接觸而發(fā)生的氧化還原反應(yīng)，在有氧的條件下使酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)，從而生成黑色素并引起植物褐變。李夕勃[6]、靳麗鑫等[25]、文菁等[26]研究都發(fā)現(xiàn)在核桃硬殼的發(fā)育過程中PPO 活性在各個(gè)發(fā)育時(shí)期變化較小，認(rèn)為雖然PPO 活性的增強(qiáng)能夠促進(jìn)核桃硬殼木質(zhì)素的生成，但并不起主要作用。

4.3 過氧化物酶（POD）

過氧化物酶（peroxidase，POD）在植物生長發(fā)育過程中其活性是連續(xù)變化的，且活性比較高。它與光合作用、呼吸作用等都有一定的關(guān)系。因POD能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，從而使木質(zhì)化程度上升[45]。李夕勃[6]研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)酶POD 在核桃硬殼發(fā)育過程中活性較低，且相關(guān)酶POD 活性變化與木質(zhì)素含量變化呈極顯著負(fù)相關(guān)。文菁等[26]研究發(fā)現(xiàn)核桃硬殼發(fā)育過程中POD 活性在硬殼分化初期較高，后逐漸降低，是因?yàn)橐鹉举|(zhì)素的積累前提是POD 酶活性需達(dá)到一定水平才能實(shí)現(xiàn)這一生物合成活動(dòng)。靳麗鑫[36]研究發(fā)現(xiàn)POD 在硬核期間變化比較平穩(wěn)甚至在前中期略有下降，認(rèn)為POD 與木質(zhì)素和纖維素的合成無明顯關(guān)系。這幾個(gè)研究結(jié)果存在一定的差異，需后續(xù)進(jìn)一步研究。

4.4 其他相關(guān)酶（基因）

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）在單木質(zhì)素生物合成的最后步驟之一中起作用，在聚合成木質(zhì)素聚合物之前將肉桂醛催化還原成肉桂醇。一般而言，CAD 的轉(zhuǎn)基因下調(diào)不會(huì)影響總木質(zhì)素含量，但是對(duì)木質(zhì)素生物合成的抑制會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素組成的變化[46]。在擬南芥CAD 雙基因突變體中，相比于野生型突變體成熟莖中木質(zhì)素含量降低了40%。引起了其莖稈木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的改變[47]。汪燦等[48]的研究結(jié)果顯示，蕎麥品種中木質(zhì)素含量高的莖稈，其CAD 活性相對(duì)增強(qiáng)。郭永翠等[49]研究分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),核桃硬化過程中CAD 基因參與調(diào)控木質(zhì)素合成，從而導(dǎo)致木質(zhì)素積累的缺乏。CAD 基因家族中JrCAD17 和JrCAD18 基因的表達(dá)模式與木質(zhì)素的積累存在緊密聯(lián)系[50]。

4-香豆酸輔酶A 連接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase EC6.2.1.12，4CL）是木質(zhì)素合成途徑中的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，4CL 是起到連接木質(zhì)素前體及各個(gè)分支反應(yīng)作用的關(guān)鍵限速酶,在木質(zhì)素生物合成途徑中4CL 分別催化對(duì)-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成相應(yīng)的輔酶A 酯,促進(jìn)木質(zhì)素單體的合成[51,52]。早期研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、煙草轉(zhuǎn)基因植物中4CL酶活性的提高能促使木質(zhì)素含量的增加，并且其莖顯示異位木質(zhì)素分布。而抑制4CL 酶活性導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低，其莖中的木質(zhì)素分布嚴(yán)重減少[53,54]。有研究表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的4CL 活性被抑制后，其中紫丁香基-木質(zhì)素含量下降，愈創(chuàng)木基-木質(zhì)素并無明顯改變[55]。但是在轉(zhuǎn)基因煙草中不僅這兩種木質(zhì)素含量都有下降，而且愈創(chuàng)木基-木質(zhì)素下降幅度大很多[56]。郭永翠[57]相對(duì)定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4CL 基因在硬殼完整核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于同期露仁核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量，說明露仁現(xiàn)象可能由于硬核期缺乏木質(zhì)素的積累。

肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是催化桂皮酸形成咖啡酸、香豆酸的酶。該酶屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶。Sewalt 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，C4H 活性的降低引起木質(zhì)素含量顯著減少而且導(dǎo)致木質(zhì)素組成的改變。當(dāng)C4H 酶的活性受到約束后，轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量顯著減少，雖然在此基礎(chǔ)上調(diào)控C4H 酶的表達(dá)會(huì)引起木質(zhì)素構(gòu)成的改變，但是生長現(xiàn)象正常無異[59]。

香豆酸-3-羥基化酶（Coumarate 3-Hydroxylase，C3H）被認(rèn)為是植物中木質(zhì)素和許多其他苯丙烷途徑產(chǎn)物的生物合成所必需的，也是催化合成雙子葉植物中兩種主要木質(zhì)素亞基：愈創(chuàng)木基和紫丁香基的關(guān)鍵步驟[60]。其作用是催化肉桂酸向香豆酸的轉(zhuǎn)化，最適催化底物是甲酰肉桂酯類化合物[61]。目前在苜蓿[62]、楊樹[63,64]的研究結(jié)果中，降低C3H 基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素總量的變化。

肉桂酸和對(duì)香豆酸（木質(zhì)素合成中間代謝物）是Scleritic-hue 和Pulpy-hue 中木質(zhì)素合成發(fā)生反常表現(xiàn)的化合物,它們既是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵中間物質(zhì),也是木質(zhì)素生物合成過程的重要調(diào)節(jié)物[65]。

5 木質(zhì)素代謝過程中相關(guān)基因克隆與表達(dá)

在對(duì)核桃生產(chǎn)栽培中出現(xiàn)的內(nèi)果皮發(fā)育不全問題，魚尚奇[66]等對(duì)紙皮核桃內(nèi)果皮硬化期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)候選基因參與了苯丙氨酸代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)子合成等核桃內(nèi)果皮硬化進(jìn)程中主要涉及的生理生化過程。另有利用RNA-seq 技術(shù)，對(duì)核桃硬殼形成期內(nèi)果皮的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究分析，豐富了核桃內(nèi)果皮形成的分子機(jī)理的研究[67]。還有以‘溫138’核桃為研究對(duì)象，從其內(nèi)果皮中克隆到（PAL、4CL 和CCR（肉桂酰輔酶 A 還原酶））3 種基因的 c DNA 片段后對(duì)其在不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量進(jìn)行分析[68]、核桃內(nèi)果皮 CAD 基因克隆及其在硬化過程的表達(dá)分析[49]和從‘溫 138’‘紙皮’兩個(gè)品種的核桃內(nèi)果皮中克隆 C3H、C4H、CCo AOMT 和F5H 四對(duì)基因，并通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)得到，這四對(duì)基因在內(nèi)果皮硬化過程中在一個(gè)時(shí)期出現(xiàn)表達(dá)量較低，從而導(dǎo)致‘溫 138’核桃由于木質(zhì)素前期物質(zhì)積累不足所以出現(xiàn)露仁現(xiàn)象[69]。核桃露仁主要涉及苯丙烷類代謝、金屬離子響應(yīng)及轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程和177 個(gè)關(guān)鍵基因參與[65]。

6 結(jié)論和討論

綜上所述，在核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中主要影響成分有木質(zhì)素、纖維素和棕色素，影響木質(zhì)素合成有環(huán)境因素、木質(zhì)素合成相關(guān)酶（基因）和相關(guān)基因的克隆與表達(dá)等。眾多科研學(xué)者在有關(guān)核桃內(nèi)果皮發(fā)育方面做了很多的工作，尤其是近年來對(duì)核桃內(nèi)果皮相關(guān)酶（基因）克隆及表達(dá)分析上有了新的進(jìn)展[39,49-50,57,65]。

但是相比于其他果樹、作物，在核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中對(duì)木質(zhì)素所研究的內(nèi)容并不是很全面，比如在核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中主要成分之一棕色素的研究、纖維素合成的相關(guān)因素研究及纖維素代謝過程中相關(guān)基因克隆與表達(dá)等其他相關(guān)成分的研究近些年未見進(jìn)展，特別是在糖、酚、激素等方面對(duì)木質(zhì)素合成的影響需要更深入地研究。

在目前研究文獻(xiàn)中對(duì)核桃內(nèi)果皮主要組成成分木質(zhì)素生物合成的影響因素進(jìn)行了一些研究，但由于木質(zhì)素的生物合成是復(fù)雜、多途徑的生化調(diào)控過程，影響其生物合成的因素也是多元化的，如在不同脅迫條件、不同栽植密度等對(duì)核桃內(nèi)果皮發(fā)育的影響目前少見報(bào)道，在這些方面進(jìn)行探索將對(duì)于核桃等果樹在生產(chǎn)應(yīng)用中進(jìn)行良種選育和提高其果實(shí)品質(zhì)等方面打下堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。