保肝顆粒對大鼠酒精性肝損傷的早期干預(yù)作用

朱正望, 高達(dá), 郭桓博, 趙靜涵, 王琳琳, 苗明三, 朱平生*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 鄭州 450046)

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是臨床常見的一種肝病,隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展,ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。研究表明,進(jìn)入人體的酒精90%以上在肝臟代謝,可導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞,持續(xù)性的肝細(xì)胞損傷會引發(fā)肝炎、肝硬化甚至肝癌[3-4]。目前臨床上主要是采取戒酒和藥物治療綜合干預(yù),但由于其臨床癥狀為非特異性,也可無癥狀,發(fā)展過程較隱匿,不易被感知,故此在確診時,肝損傷往往已較重,且患者早期用藥依從性較差,這就使ALD的早期干預(yù)成為臨床治療上的難點[5-6]。因此,針對ALD的早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)對重型肝病的防治和保障大眾健康具有十分重要的意義。

中醫(yī)藥在防治ALD方面發(fā)揮著重要作用,本研究中的保肝顆粒選用藥食同源藥材組方,能在不增加肝臟負(fù)擔(dān)的前提下,發(fā)揮保肝作用,患者接受度好、依從性高,已獲得國家發(fā)明專利(專利號:ZL 2016 1 1252370.X),具有深入研究的價值。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥可以通過減少炎癥、降低自由基的損傷、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肝功能等來修復(fù)受損肝細(xì)胞,起到保護(hù)肝臟的作用,應(yīng)用前景廣闊[7-8]。但其研究多集中于中醫(yī)藥對ALD的治療,鮮見從早期生物標(biāo)志物入手研究ALD的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防。前期實驗研究發(fā)現(xiàn),嘌呤核苷酸磷酸化酶(purine nucleotide phosphorylase, PNP)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GLDH)、精氨酸酶1(arginase 1, Arg-1)和α-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(α-glutathione S-transferase, α-GST)作為早期生物標(biāo)志物較ALT、AST等傳統(tǒng)肝功能檢測指標(biāo)更加靈敏,對早期肝損傷的診斷有較高的價值[9]。因此,通過檢測ALD大鼠傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)、早期生物標(biāo)志物、相關(guān)細(xì)胞因子以及脂質(zhì)過氧化指標(biāo),動態(tài)觀察保肝顆粒對ALD早期的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠144只,SPF級,體重180～200 g,雌雄各半,購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(魯)2014-0007。河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心許可證號:SYXK(豫)2015-0005,本實驗由河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn):DWLL16010005。

1.2 實驗藥物與試劑

保肝顆粒由茵陳30 g、梔子20 g、枸杞子30 g、五味子20 g、薏苡仁20 g、烏梅15 g、葛根30 g、大棗30 g、甘草9 g組成,由河南中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備;聯(lián)苯雙酯(萬邦德制藥集團(tuán)有限公司,批號:A020141140);無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司,批號:20150724);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)試劑盒(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司,批號:D1507053、D1507073、D1506073、D1507013);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20160121、20160130);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、PNP、GLDH、Arg-1、α-GST ELISA試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司,批號:E20160701A、20160810)。

1.3 實驗儀器

MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司),HH-S4恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),Cytation 3型酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司),UV-1901紫外可見分光光度計(上海奧析科學(xué)儀器有限公司),BS-2000全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),如圖1所示。

圖1 實驗儀器圖片F(xiàn)ig.1 Experimental instrument picture

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥

將144只Wistar大鼠于實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,隨機分為空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、保肝顆粒低、中、高劑量組,每組24只,雌雄各半。每日禁食不禁水6 h后,聯(lián)苯雙酯組(3.75 mg/kg,相當(dāng)于臨床成人用量的10倍)按相應(yīng)濃度灌胃給藥,保肝顆粒低、中、高劑量組分別給予低、中、高(17、34、68 g/kg,相當(dāng)于臨床成人用量的5、10、20倍)劑量保肝顆粒混懸液灌胃,空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃,10 mL/kg。

1.4.2 造模與取材

給藥1 h后除空白組外,其余各組按10 mL/kg灌胃50%乙醇,再1 h后按前用量重復(fù)灌胃50%乙醇一次,空白組灌胃等體積蒸餾水,連續(xù)6 d。在實驗開始的第2、3、4、6天酒精灌胃3 h后分別隨機取每組大鼠6只,麻醉后腹主動脈取血;處死各組動物,解剖并剝離肝臟,取適量肝組織勻漿[10]。

1.4.3 肝功能指標(biāo)檢測

腹主動脈取血,3 500 r/min離心10 min,分離血清,采用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平。

1.4.4 血清炎癥因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TNF-α、IL-6水平,具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 肝組織指標(biāo)檢測

稱取適量肝右葉加預(yù)冷生理鹽水,組織勻漿器研磨,配制成10%的肝組織勻漿,3 500 r/min離心10 min,取上清液,采用微板法檢測肝組織勻漿中SOD水平,比色法檢測MDA水平。

1.4.6 血清早期生物標(biāo)志物檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平,具體操作步驟按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

實驗流程如圖2所示。

圖2 實驗設(shè)計路線圖Fig.2 Experimental design roadmap

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平在2、3、4、6 d明顯升高(P<0.05,P<0.01),且隨著時間的增加呈遞增趨勢;與模型組比較,聯(lián)苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆?？擅黠@改善酒精性肝損傷大鼠的肝功水平。結(jié)果如表1所示。

表1 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平的影響Table 1 Effects of Baogan Granules on serum levels of ALT, AST, ALP and TBIL in rats with alcoholic liver injury n=6)

2.2 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-α、IL-6的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平在2、3、4、6 d均明顯升高(P<0.01),說明酒精進(jìn)入體內(nèi)后,造成了肝臟的損傷,致使機體釋放炎癥因子;與模型組比較,聯(lián)苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆?？梢种茩C體炎癥因子的釋放,減輕炎癥反應(yīng)。結(jié)果如表2所示。

表2 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清TNF-α、 IL-6水平的影響

2.3 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠肝勻漿MDA、SOD的影響

與空白組比較,模型組大鼠肝勻漿中MDA水平在2、3、4、6 d不斷升高,SOD水平明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,聯(lián)苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠肝勻漿中MDA水平在2、4、6 d明顯降低,SOD水平在3、4、6 d明顯升高(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆?？蓽p少酒精性肝損傷模型大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成,增加抗氧化活性。結(jié)果如表3所示。

表3 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠肝勻漿MDA、 SOD水平的影響

2.4 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平雖在2、3、4、6 d均升高(P<0.05,P<0.01),但在酒精灌胃后的第2天即有明顯的升高,之后有下降趨勢,說明PNP、GLDH、Arg-1、α-GST作為新型的早期生物標(biāo)志物對酒精性肝損傷有較好的靈敏性;與模型組比較,聯(lián)苯雙酯組、保肝顆粒組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01),表明保肝顆?？梢栽诰凭愿螕p傷早期即起到明顯的肝臟保護(hù)作用。結(jié)果如表4所示。

表4 保肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠血清PNP、GLDH、Arg-1、α-GST水平的影響

3 討論

古代中醫(yī)文獻(xiàn)中并沒有ALD這一病名,可將其歸為“脅痛”等范疇[11]。酒性濕熱,過量飲酒可使?jié)駸嵊艚Y(jié),阻遏脾胃,使脾胃喪失其升清降濁之用,同時濕熱煎灼日久易耗傷陰液,致使肝腎陰虛;或者酒入人體,損傷肝膽,使肝疏泄功能失常,氣機逆亂[12]。因此,ALD的病位主要在脾胃肝膽,久則及腎。保肝顆粒由茵陳、梔子、枸杞子、五味子、薏苡仁、烏梅、葛根、大棗、甘草組成,方中茵陳清熱祛濕退黃為君藥;梔子清利肝膽兩經(jīng)之濕熱,枸杞子補益肝腎,二者相合補瀉兼施同為臣藥;五味子、烏梅益氣生津,薏苡仁健脾、滲濕利水,葛根升舉中焦陽氣、生津,共為佐藥;甘草、大棗補益脾胃,調(diào)和諸藥,用為使藥;諸藥合用共奏清熱利濕、調(diào)和肝脾、養(yǎng)陰柔肝之功?，F(xiàn)代藥理研究表明,保肝顆粒中主要藥物均有一定的保肝護(hù)肝作用,如茵陳對多種類型肝損傷具有保護(hù)作用,其肝保護(hù)機制與抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、抑制肝細(xì)胞凋亡等有關(guān)[13];梔子常用于自身免疫性疾病、肝損傷等治療,其活性成分具有調(diào)節(jié)免疫、減少炎癥因子產(chǎn)生和抗氧化等多種藥理作用[14];枸杞子中的化學(xué)成分具有抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[15];五味子中的主要化學(xué)成分具有保肝降酶、減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷、恢復(fù)受損肝細(xì)胞的作用[16];薏苡仁含有多種活性物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、提高機體免疫等活性[17]。

乙醇因其主要在肝臟代謝,過量飲酒時超過肝臟代謝能力,酒精便在體內(nèi)蓄積,具有肝毒性的乙醇和其代謝產(chǎn)物可直接損傷肝細(xì)胞及其細(xì)胞器,造成肝臟損傷[18-19]。AST、ALT一直是臨床上用于檢查肝臟疾病使用最多的指標(biāo),常用來評價肝功能的異常,當(dāng)肝臟受到損傷時,細(xì)胞線粒體和胞漿內(nèi)的AST、ALT進(jìn)入血液,使血清中AST、ALT的活性升高[20]。同時,肝臟的損傷導(dǎo)致體內(nèi)ALP、TBIL排泄障礙而反流入血,從而引起血清ALP、TBIL水平增高。本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBIL水平明顯升高,給藥后,保肝顆粒各劑量組均能不同程度的降低大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBIL水平,對改善肝功能有顯著的作用。

ALD的具體發(fā)病機制尚不完全清楚,“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為,其與氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化、炎癥因子的釋放、線粒體功能障礙等多種因素密切相關(guān),而氧化應(yīng)激在ALD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[21-22]。生理狀態(tài)下,機體氧化和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài),過量攝入酒精,乙醇在肝臟代謝過程中產(chǎn)生的ROS和乙醛可降低肝臟抗氧化系統(tǒng)的活性,破壞肝臟的氧化還原平衡,肝臟中活性氧生成增多,而氧化產(chǎn)物作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘發(fā)因素,進(jìn)而對肝細(xì)胞形成“二次打擊”,引起肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死,由此引起一系列肝臟的病理損傷[23]。MDA作為生物體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物,可引起細(xì)胞腫脹、壞死[24]。SOD是細(xì)胞內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激最重要的一種酶,能很好的清除自由基,對抗氧化應(yīng)激,使機體免受氧化的損傷[25]。氧化應(yīng)激下ROS的增加可導(dǎo)致TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的釋放,加重炎癥反應(yīng),進(jìn)一步損害肝功能,加速ALD的疾病進(jìn)程,引起肝臟纖維化、肝硬化,甚至肝癌的發(fā)生[26]。研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平、肝勻漿中MDA水平明顯升高,肝勻漿中SOD水平明顯降低;保肝顆粒干預(yù)后,在不同的時間段內(nèi)可以不同程度的降低大鼠血清中TNF-α、IL-6水平、肝勻漿中MDA水平,升高肝勻漿中SOD水平,提示保肝顆?？赏ㄟ^改善ALD模型大鼠的氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)肝臟的作用。

酒精造成的肝臟綜合性影響不容忽視,發(fā)生肝損傷后,早期可通過及時服用相應(yīng)藥物予以糾正,若未在損傷早期進(jìn)行干預(yù),持續(xù)性的肝損傷易發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[27]。目前ALT、AST是臨床上評價肝損傷的重要指標(biāo),然而這些指標(biāo)常在肝細(xì)胞發(fā)生較重的實質(zhì)性損傷后才會出現(xiàn)明顯變化,且酒精性肝損傷患者早期一般無明顯臨床癥狀,因此能夠更早的發(fā)現(xiàn)病變,盡早進(jìn)行干預(yù),對于防止病情發(fā)展有著重要的意義。PNP是嘌呤補救途徑中的關(guān)鍵酶,只有當(dāng)肝細(xì)胞受損時才能在血液中檢測出來;GLDH是一種細(xì)胞線粒體酶,在肝組織中分布最多,肝損傷時血液中的GLDH升高;Arg-1主要分布于肝細(xì)胞核、微粒體,是肝臟中一種重要的水解酶;α-GST 是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶,存在于肝小葉中心細(xì)胞,其分子量小,在肝損傷早期階段就會透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液[28]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),PNP、GLDH、Arg-1和α-GST可以作為肝損傷早期檢測生物標(biāo)志物,且較傳統(tǒng)肝功能檢測有較強的靈敏性[9]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),ALD模型組大鼠血清中PNP、GLDH、Arg-1和α-GST在肝損傷時出現(xiàn)較早,且變化更為明顯。

4 結(jié)論

通過動態(tài)觀察ALD大鼠血清中肝功能指標(biāo)、早期生物標(biāo)志物、相關(guān)細(xì)胞因子以及肝組織中脂質(zhì)過氧化指標(biāo),結(jié)果表明,保肝顆粒在酒精性肝損傷早期即可起到較好的保護(hù)作用,且其可以通過減少炎性因子釋放、增強機體的抗氧化能力,從而減輕肝臟損傷,恢復(fù)肝臟功能。