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    PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間細胞凋亡的影響

    2024-05-20 07:17:22羅瑞明陳雪妍王金霞胡麗筠
    食品科學 2024年9期
    關(guān)鍵詞:膜電位羊肉線粒體

    張 倩,羅瑞明,陳雪妍,李 榮,王金霞,胡麗筠

    (寧夏大學食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川 750021)

    磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路是一條重要的信號途徑,參與調(diào)控多種生物學過程,包括細胞增殖、存活和凋亡等。該通路的異?;罨c多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1],如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等。AKT是PI3K信號通路最重要的下游效應(yīng)器之一,是參與調(diào)控細胞增殖、存活、凋亡的重要蛋白。AKT的激活可以抑制凋亡,促進細胞生長和增殖。而另一方面,PI3K/AKT信號通路的異?;罨瘎t會抑制凋亡信號的傳遞,從而抑制細胞凋亡,造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2]。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在細胞的凋亡、存活、增殖以及細胞骨架的改變等活動中,其調(diào)節(jié)細胞凋亡的機理主要有3 個:1)AKT對重組人β-防御素-2類的促凋亡蛋白進行直接抑制,或者對某些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)出的促凋亡信息進行一系列調(diào)控,此外,AKT處于激活的情況下,還可以對與凋亡有關(guān)的因子,例如半胱天冬蛋白酶的S196位點磷酸化,進而使之失去活性,從而對凋亡起到抑制作用[3];2)對其他與Forkhead有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,如Forkhead等轉(zhuǎn)錄因子被磷酸化后,可對凋亡相關(guān)因子配體等促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄功能起到抑制作用,降低促凋亡的信號,從而增強細胞生存能力;3)AKT的上游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)靶基因mTOR可激活A(yù)KT,并通過調(diào)控特定mRNA翻譯和蛋白合成,在細胞增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    因此,PI3K/AKT調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制十分復(fù)雜,在細胞程序性死亡過程中至關(guān)重要。對PI3K/AKT在細胞代謝中作用的研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT還可以通過代謝途徑調(diào)節(jié)細胞的凋亡[4]。周永君等[5]研究表明肉豆蔻木脂素在50、100 μmol/L和200 μmol/L條件下以劑量依賴關(guān)系抑制胃癌細胞增殖,誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡,下調(diào)PI3K和AKT蛋白表達水平,上調(diào)B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)-關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2-associated X,BAX)、胱天蛋白酶(cysteine aspastic acid-specific protease,Caspase)-3和Caspase-9表達水平(P<0.05)。Chen Cheng等[6]發(fā)現(xiàn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)通過激活PI1K/AKT信號通路驅(qū)動缺氧誘導(dǎo)因子-3α積累,從而加速死后牛肌肉的糖酵解。Wang Tongting等[7]探討槲皮素對雞胸肌嫩度的影響及相關(guān)機制,發(fā)現(xiàn)槲皮素可促進LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化,上調(diào)ATG7、Beclin-1等蛋白,且PI3K/AKT/mTOR通路介導(dǎo)了該過程。PI3K抑制劑(LY294002)是一種PI3K信號途徑的非特異性小分子化合物,可以抑制PI3Kα/δ/β。2017年,徐余超等[8]采用實時聚合酶鏈式反應(yīng)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)等方法研究LY294002對MGC-803細胞增殖、周期及凋亡的作用,發(fā)現(xiàn)LY294002對人乳腺癌細胞系MGC-803的PI3K/AKT/mTOR信號通路中的多個重要分子均有不同程度的抑制,并伴隨PI3K、AKT、4EBP、P70S6K等mRNA及磷酸化蛋白的表達量顯著降低,且LY294002可抑制人乳腺癌細胞的生長,改變細胞周期,促進細胞凋亡。

    PI3K/AKT信號通路與細胞凋亡密切相關(guān),目前已有多項研究揭示了該通路在各種癌癥中的作用,如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等,其研究重點主要集中在信號通路的調(diào)控、靶向治療的開發(fā)及臨床應(yīng)用等方面。雖然大量文獻報道指出PI3K/AKT信號通路在細胞凋亡途徑中具有重要的調(diào)控作用,但目前仍不明確PI3K/AKT信號途徑如何調(diào)控冷卻灘羊肉貯藏期間肌細胞凋亡途徑,及其對凋亡級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生何種作用。因此,本研究以4 ℃條件下不同貯藏期灘羊后腿肉為研究對象,采用10 μmol/L PI3K抑制劑LY294002溶液對灘羊肉進行注射處理,分別貯藏0、2、4、6、8 d,通過WB分析PI3K、AKT蛋白的表達情況,以此驗證PI3K/AKT信號通路抑制的有效性,同時測定灘羊肉貯藏期間能量因子、氧化應(yīng)激水平、線粒體損傷程度以及Caspase-3活性的變化,以探索PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間細胞凋亡途徑的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    灘羊右后腿肉由寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司提供。選擇9 只6 個月齡去勢的公灘羊,在宰殺前進行集中飼養(yǎng)。按照GB 12694—2016《畜禽屠宰加工衛(wèi)生規(guī)范》的要求進行宰殺后,在-20 ℃的冰箱中進行1 h冷凍,將肉塊的中心溫度降低到0 ℃,然后用密封袋進行包裝,轉(zhuǎn)入0~4 ℃冰箱中保存。

    PI3K抗體、AKT抗體、過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、NaOH、K2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、蒽酮試劑美國Sigma公司;HY-10108 LY294002、Tris-HCl緩沖液、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium,EDTA-2Na)、二氯二氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)、甘露醇 美國MedChemExpress公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜美國Bio-Rad公司;蛋白預(yù)染Marker 杭州弗德生物科技有限公司;線粒體提取試劑盒、ATP含量檢測試劑盒、糖原含量檢測試劑盒、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒北京索萊寶科技有限公司;琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒、檸檬酸合酶(citrate synthase,CS)南京建城生物工程研究所;線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒 上海一研生物科技有限公司;液氮 寧夏寧鋼盈德氣體有限公司;蔗糖、硫酸、H2O2、甘油 國藥集團化學試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JY-SPGT垂直電泳儀 耶拿分析儀器(上海)有限公司;GPC 1000凝膠圖像分析儀 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;UV-3600i Plus紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司;BCD-536WKN食品專用冰箱合肥美的電冰箱有限公司;F-4700熒光分光光度計上海元析儀器有限公司;Spectramax M2酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;ST16 ST16R冷凍高速離心機 上海土森視覺科技有限公司;HWS恒溫水浴鍋杭州瑞誠儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品采集

    選用寧夏鹽池縣大夏牧區(qū)的灘羊作為實驗材料,采集在0~4 ℃條件下貯藏的冷卻灘羊后腿肉(從腰椎與薦椎連接處斬下的后腿部位肌肉),剔除可見的脂肪及結(jié)締組織,快速采集約150 g肉樣,作為0 d樣品。其余樣品切割成約150 g大小一致的塊狀,并將其隨機分成兩組,一組為對照組,另一組為LY294002組,每組各15 個樣本。對照組不做任何處理,LY294002組以料液比10∶1(g/mL)注射10 μmol/L LY294002溶液。置于0~4 ℃、相對濕度85%條件下成熟,分別采集貯藏0、2、4、6、8 d后樣品測定相應(yīng)指標。對于不便立即測定的指標,在采樣點取樣品后,立即放入液氮中冷藏,并轉(zhuǎn)入-80 ℃冷藏待用。每組樣本分別進行至少3 個以上生物學重復(fù)。

    1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)及WB

    SDS-PAGE(10%分離凝膠和5%濃縮凝膠)分離蛋白質(zhì)后,將目標蛋白質(zhì)(50 μg)轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜上;在TBST溶液(20.0%吐溫-1、20 mmol/L NaCl、150 mmol/L Tris、10 mmol/L KCl,pH 5.7)中用4%無脂牛奶封閉PVDF薄膜,之后在4 ℃條件下使用各種不同的一抗(PI3K抗體(1∶500)、AKT抗體(1∶500))孵育過夜。在用TBST溶液清洗3 次(每次10 min)后,使用抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶4 000)在室溫條件下反應(yīng)1.5 h。經(jīng)TBST洗滌緩沖液漂洗3 次后二氨基聯(lián)苯胺顯色,蛋白質(zhì)的表達水平通過Quantity-One 4.6.2程序進行定量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)標。

    1.3.3 線粒體提取

    參照Chen Jiao等[9]的方法。取2 g肉樣剪碎,置于20 mL線粒體分離液(0.2 mol/L甘露醇;0.075 mol/L蔗糖;2.0 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4;0.2 mmol/L EDTA),轉(zhuǎn)移到均質(zhì)機中以8 000×g研磨4 min,隨后,將勻漿液在4 ℃、9 000×g條件下離心15 min,所得沉淀物即為線粒體,其蛋白質(zhì)濃度用BCA法測定。

    1.3.4 ATP含量測定

    取待測肉樣0.1 g,實驗操作按照ATP含量檢測試劑盒的要求,使用紫外分光光度計于340 nm波長處進行測定。

    1.3.5 糖原含量測定

    利用蒽酮法并略加改進,繪制標準曲線[10]。將0.1 g肉樣與1.5 mL 2 mol/L NaOH溶液混合,保持沸騰20 min。隨后,將冷卻的混合物與8 mL超純水混合,并以5 000×g離心10 min。按照糖原含量檢測試劑盒的要求進行后續(xù)操作,使用酶標儀于620 nm波長處測定吸光度。

    1.3.6 線粒體標志酶活性測定

    用于檢測SDH、CS活性的提取物使用Wang Yingying等[11]提出的方法制備。將1 g冷凍樣品加入9 mL 10 mmol/L冷均質(zhì)溶液(80 mmol/L K2HPO4、15 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L KCl、1.2 mol/L NaCl,pH 7.4),然后在冰浴中以12 000 r/min勻漿30 s。隨后,4 ℃、13 000×g離心15 min。之后,收集上層細胞使用ELISA試劑盒檢測SDH和CS的活性。

    1.3.7 線粒體ROS水平測定

    參照Yans等[12]的方法并稍作修改,使用熒光測定法分析ROS含量。將3 g冷凍樣品加入到15 mL 50 mmol/L預(yù)冷磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.4)中,12 000×g勻漿,間隔20 s,并在4 ℃、5 000×g條件下離心20 min。隨后,將上清液與等體積緩沖溶液(10 μmol/L DCFHDA、10 mmol/L Tris-HCl、15 mmol/L蔗糖、0.15 mmol/L EDTA-2Na、0.9 g/100 mL NaCl,pH 7.4)混合,并于37 ℃培養(yǎng)20 min。使用熒光分光光度計在450 nm波長處測量孵育前后的熒光強度。

    1.3.8 MPTP開放程度測定

    取待測樣品0.1 g,實驗操作按照MPTP檢測試劑盒的要求進行,使用紫外分光光度計于540 nm波長處測定。

    1.3.9 線粒體膜電位測定

    按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)說明書操作。使用熒光分光光度計于540 nm波長處測定。

    1.3.10 Caspase-3活性測定

    取0.1 g組織肉樣,按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作,使用酶標儀在405 nm波長處測定吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K和AKT蛋白的表達量變化

    PI3K蛋白家族參與細胞存活、生長、代謝和血糖穩(wěn)態(tài)等多種細胞功能的調(diào)控,PI3K和AKT蛋白的降解程度可以反映出PI3K/AKT通路受到抑制的程度[13]。WB結(jié)果顯示,對照組和LY294002組PI3K蛋白在貯藏過程中逐漸降解,8 d時幾乎完全降解(圖1A);同時發(fā)現(xiàn)對照組的條帶始終深于LY294002組,表明LY294002促進了PI3K蛋白的降解,驗證了PI3K/AKT通路受到抑制的有效性。

    圖1 PI3K抑制劑對冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K(A)和AKT(B)蛋白表達情況的影響Fig.1 Effect of PI3K inhibitor on the protein expression of PI3K (A) and AKT (B) in chilled Tan sheep meat during storage

    LY294002可通過抑制PI3K活性抑制PI3K/AKT通路下游的AKT表達及活化,從而阻止所有由AKT調(diào)控的下游信號傳導(dǎo)途徑[14]。WB結(jié)果顯示,對照組和LY294002組AKT蛋白的表達隨貯藏時間的延長逐漸減弱,而內(nèi)參蛋白GAPDH并未變化(圖1B);同時發(fā)現(xiàn)對照組的條帶始終深于LY294002組,表明LY294002抑制了AKT蛋白的表達,再次驗證了PI3K/AKT信號通路受到阻礙。如圖2所示,灘羊?qū)φ战M和LY294002組PI3K和AKT蛋白表達量隨貯藏時間的延長逐漸減少,且LY294002組蛋白相對表達量整體低于對照組,表明LY2940002抑制劑促進了PI3K和AKT蛋白在貯藏期間的分解,有效驗證了PI3K/AKT信號通路被LY294002抑制。

    圖2 PI3K抑制劑對冷卻灘羊肉貯藏期間PI3K和AKT蛋白相對表達量的影響Fig.2 Effect of PI3K inhibitor on the relative protein expression of PI3K and AKT in chilled Tan sheep meat during storage

    2.2 PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間能量因子的影響

    ATP的生成在骨骼肌收縮、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及維持細胞正常功能等生命活動中都發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用,將ATP保持在一定的水平對細胞而言非常重要[15]。由圖3可知,貯藏0~2 d時,LY294002組的ATP含量以更快的速率下降,隨后緩慢下降,但ATP仍會被消耗;8 d時灘羊肉對照組和LY294002處理組ATP含量分別降至140.15、110.26 μmol/mg,是由于ATP合成減少和ATP消耗增加所致。結(jié)果表明,LY294002可有效促進ATP的降低,其作用于PI3K/AKT信號通路后,加速ATP的減少而影響細胞凋亡,主要是由于ATP與細胞膜上的ATP受體相結(jié)合,抑制PI3K,進而抑制AKT,促進BAX的表達和Bcl-2基因相關(guān)啟動子磷酸化,從而加速凋亡信號的傳遞,抑制細胞生長和增殖,揭示了PI3K/AKT信號途徑可通過促進ATP的減少而影響細胞凋亡。

    圖3 冷卻灘羊肉貯藏期間ATP含量變化Fig.3 Changes of ATP content in chilled Tan sheep meat during storage

    冷卻灘羊肉貯藏期間,LY294002處理組和對照組糖原含量變化如圖4所示。對照組和LY294002處理組糖原含量隨貯藏時間的延長整體呈下降趨勢。貯藏初期2 d時,對照組糖原含量顯著高于LY294002處理組(P<0.05),表明注射抑制劑LY294002后加速了糖原分解,由于抑制PI3K/AKT信號途徑可以降低細胞內(nèi)的葡萄糖利用率,從而降低糖原合成的速率,因此導(dǎo)致糖原含量的下降。研究表明,抑制PI3K/AKT信號途徑后降低糖原含量有助于促進細胞凋亡。具體而言,降低糖原含量可以增加細胞內(nèi)單磷酸腺苷(adenosine 5’-monophosphate,AMP)∶ATP比值,進而激活下游的AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號途徑,抑制mTOR信號途徑,提高細胞凋亡的水平。

    圖4 冷卻灘羊肉貯藏期間糖原含量變化Fig.4 Changes of glycogen content in chilled Tan sheep meat during storage

    2.3 PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體標志酶活性的影響

    SDH是衡量線粒體功能的標志酶。如圖5所示,貯藏初始狀態(tài)下(0 d)灘羊肉線粒體中SDH活力為140.27 U/L,且LY294002組在貯藏過程中(4~8 d)顯著低于對照組(P<0.05)。SDH活性隨著貯藏時間的延長呈逐漸降低的趨勢。貯藏6 d時對照組和LY294002組線粒體SDH的活性分別為96.21 U/L和81.03 U/L,相比于初始狀態(tài)分別降低了31.41%和42.23%(P<0.05),SDH活力的下降說明隨著貯藏時間的延長,線粒體的生理功能逐漸下降[16]。主要是因為抑制PI3K/AKT信號途徑會降低細胞內(nèi)的氧化磷酸化過程,從而影響線粒體內(nèi)的SDH活性,導(dǎo)致LY294002處理組SDH活性低于對照組,同時會使細胞代謝受到影響,進而促進細胞凋亡。CS是三羧酸循環(huán)中一個重要的調(diào)節(jié)酶[17]。由圖6可知,對照組和LY294002組的CS活性在貯藏0~2、4~8 d均顯著下降,2~4 d顯著上升(P<0.05),其原因是在貯藏過程中,可能發(fā)生基因的表達,導(dǎo)致CS活性上升。貯藏0~4 d,對照組CS活性顯著高于LY294002組(P<0.05),表明PI3K/AKT通路被阻斷后會降低細胞內(nèi)的氧化磷酸化過程,并降低CS活性,進而影響線粒體細胞凋亡。

    圖5 冷卻灘羊肉貯藏期間SDH活性的變化Fig.5 Changes of SDH activity in chilled Tan sheep meat during storage

    圖6 冷卻灘羊肉貯藏期間CS活性的變化Fig.6 Changes of CS activity in chilled Tan sheep meat during storage

    2.4 PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體氧化應(yīng)激水平的影響

    如圖7所示,貯藏期間,LY294002組線粒體ROS水平整體呈上升趨勢,貯藏6 d時,LY294002組ROS水平明顯高于對照組(P<0.05),主要因為PI3K/AKT信號途徑參與線粒體逆轉(zhuǎn)運輸,防止線粒體內(nèi)過多的ROS產(chǎn)生,但是當該信號途徑受到抑制時,線粒體功能可能會受到破壞,導(dǎo)致ROS的升高。研究表明,PI3K/AKT信號通路的抑制會加重線粒體的氧化損傷,從而導(dǎo)致細胞凋亡。

    圖7 冷卻灘羊肉貯藏期間ROS水平的變化Fig.7 Changes of ROS levels in chilled Tan sheep meat during storage

    2.5 PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體損傷程度的影響

    由圖8 可知,冷卻貯藏0~8 d 期間,對照組和LY294002組光密度值均呈降低趨勢,而光密度值與MPTP開放程度成反比,說明MPTP開放程度顯著增大(P<0.05),原因可能是抑制PI3K/AKT信號途徑會引發(fā)線粒體內(nèi)外膜電位的破壞、ROS的產(chǎn)生和細胞凋亡等一系列反應(yīng),多種因素誘導(dǎo)MPTP呈不可逆的開放狀態(tài),進而導(dǎo)致線粒體內(nèi)氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生下降,從而產(chǎn)生ROS、Ca2+等物質(zhì),導(dǎo)致線粒體外膜通透性改變,并釋放一系列細胞凋亡相關(guān)蛋白,例如細胞色素c等,最終引發(fā)細胞凋亡。整個貯藏過程中,與對照組相比,LY294002組MPTP開放程度變化顯著(P<0.05),表明PI3K/AKT通路抑制后可能直接作用于構(gòu)成MPTP的分子蛋白,使絲/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化,影響MPTP的結(jié)構(gòu)和功能,促進其開放。

    圖8 冷卻灘羊肉貯藏期間MPTP開放程度變化Fig.8 Changes of MPTP opening degree in chilled Tan sheep meat during storage

    線粒體膜電位的降低是由MPTP精細調(diào)控引起[18]。由圖9可知,對照組和LY294002組線粒體膜電位隨貯藏時間的延長均呈下降趨勢,LY294002組0~2 d和4~6 d線粒體膜電位下降率分別為29.17%和69.23%,對照組0~2 d和6~8 d呈顯著下降趨勢(P<0.05);貯藏期間,對照組線粒體膜電位整體高于LY294002組。以上結(jié)果表明,抑制PI3K/AKT信號途徑后對線粒體膜電位的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響,使線粒體膜電位下降,進而導(dǎo)致Ca2+的過多積累,激活凋亡途徑中的酶、蛋白酶等,損傷線粒體膜以及DNA等重要細胞器件,從而引起細胞凋亡。此外,線粒體膜電位下降也會導(dǎo)致細胞色素c等細胞中與凋亡相關(guān)蛋白的釋放,進而啟動凋亡途徑。

    圖9 冷卻灘羊肉貯藏期間線粒體膜電位的變化Fig.9 Changes of mitochondrial membrane potential in chilled Tan sheep meat during storage

    2.6 PI3K/AKT信號通路對冷卻灘羊肉貯藏期間Caspase-3活性的影響

    由圖10所示,對照組和LY294002組Caspase-3活性均在貯藏2 d時達到峰值,之后呈明顯降低的趨勢;與對照組相比,LY294002組貯藏0~6 d時的Caspase-3活力較高,主要由于PI3K/AKT信號途徑可以調(diào)節(jié)Caspase-3的表達和活性,Caspase-3能夠靶向并降解多種細胞蛋白質(zhì),引發(fā)細胞形態(tài)學和功能性變化,以及間接激活其他的Caspase,進而引發(fā)細胞凋亡。說明LY294002抑制PI3K/AKT信號途徑后會導(dǎo)致Caspase-3活性增加,促進細胞凋亡。

    圖10 冷卻灘羊肉貯藏期間Caspase-3活性的變化Fig.10 Changes of caspase-3 activity in chilled Tan sheep meat during storage

    3 討論

    氧化應(yīng)激和能量代謝均可導(dǎo)致細胞凋亡。已有研究表明,氧化應(yīng)激可通過調(diào)控腎小球內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)基因的表達,導(dǎo)致腎小球細胞損傷[19]。張志梅[20]研究發(fā)現(xiàn),降糖藥二甲雙胍可顯著抑制人紅系白血病K562細胞的糖酵解,并可通過PI3K/AKT/mTOR信號途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致諸如活性羰基化合物等能量物質(zhì)代謝紊亂,從而導(dǎo)致細胞的破壞和死亡[21]。本研究中得到的結(jié)果與上述研究一致,LY294002組線粒體ROS的總體水平與對照組相比有較大差異(P<0.05),這表明PI3K/AKT途徑可能通過加重線粒體的氧化損傷,并與ROS交互,從而導(dǎo)致細胞凋亡。肝臟是生物體最重要的物質(zhì)及能量代謝中心,線粒體是細胞“能量供給源”,可通過多種途徑調(diào)控各種重要的生命活動,其中PI3K/AKT途徑就是其中之一。Wang Qifei等[22]研究表明,PI3K/AKT信號通路在缺氧條件下可通過參與缺氧誘導(dǎo)因子-1α的合成和糖酵解發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究顯示,AKT能夠刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運載體1,進而提高葡萄糖代謝效率[23]。本實驗中,PI3K/AKT信號通路通過加速ATP和糖原含量的下降,對細胞凋亡造成影響。抑制劑LY294002可使肌肉組織的pH值、ATP含量急劇降低,并與肌肉組織中其他能量代謝發(fā)生作用,從而導(dǎo)致肌肉組織的凋亡。此外,AKT還能夠激發(fā)己糖激酶和磷酸果糖激酶,這兩種物質(zhì)對糖分解都有限速作用,從而提高代謝水平[24]。

    SDH是線粒體呼吸鏈復(fù)合物II中的底物酶,它與其他呼吸鏈底物酶一起參與線粒體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移和ATP合成[25]。當SDH活性下降時,線粒體內(nèi)的ATP合成可能會受到影響,進而影響細胞內(nèi)的代謝和生存。降低ATP水平可能會激活A(yù)MPK信號途徑,從而抑制mTOR信號途徑,提高細胞凋亡的水平。本研究發(fā)現(xiàn),貯藏期間對照組CS活性顯著高于LY294002組(P<0.05),表明PI3K/AKT信號途徑會導(dǎo)致線粒體膜電位的降低,從而影響氧化磷酸化過程的進行,并降低SDH的活性,導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。CS參與三羧酸循環(huán)代謝途徑,本實驗結(jié)果表明,PI3K/AKT通路被阻斷后,使CS活性下降,三羧酸循環(huán)途徑和細胞代謝途徑的進行會受到影響,從而導(dǎo)致細胞生存受損,促進細胞凋亡的發(fā)生。本研究也表明,PI3K/AKT信號途徑在線粒體膜電位和MPTP的調(diào)節(jié)中具有重要的作用,抑制該途徑會導(dǎo)致膜電位的下降和MPTP開放程度的增加,進而啟動凋亡途徑。這與Wang Linlin等[26]研究發(fā)現(xiàn)MPTP開放受到ROS和Ca2+的影響,在死后肌肉壓痛過程中介導(dǎo)細胞凋亡中起重要作用的結(jié)果相一致。

    PI3K/AKT是一個抗細胞凋亡的重要途徑,而Bcl-2基因家族是其下游抗細胞凋亡分子,在調(diào)節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[27]。Caspase-3在線粒體途徑中起著關(guān)鍵作用,其活化是引起細胞凋亡的關(guān)鍵[28]。已知PI3K/AKT信號通路可調(diào)控多種組織器官的凋亡,而PI3K/AKT信號通路的活化可抑制凋亡。PI3K可抑制Caspase-3激活,發(fā)揮抗細胞凋亡作用[29-30]。當PI3K/AKT信號通路的基因表達降低時,能夠在肝內(nèi)膽管細胞癌中上調(diào)BAX、Caspase-3和Caspase-9基因的表達,從而引起細胞凋亡[31]。硫化氫可調(diào)控BCL-2的表達,引起骨髓間充質(zhì)干細胞線粒體凋亡[32]。本研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號途徑可以促進Caspase-3靶向各種細胞蛋白進行降解,引發(fā)細胞形態(tài)學和功能性變化,進而引發(fā)細胞凋亡。Karahashi等[33]也發(fā)現(xiàn),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以提高BAX的表達,并促進細胞的凋亡。抑制PI3K/AKT信號途徑后也會影響其他與細胞凋亡相關(guān)的協(xié)同分子表達,例如p53和BCL-2家族等。此外,在STC-1小鼠中LPS治療可使BCL-2/BAX下降,Caspase 3的表達升高引起腸道內(nèi)分泌細胞的凋亡[34]。

    4 結(jié)論

    WB結(jié)果表明,隨著貯藏時間的延長,PI3K和AKT蛋白表達量均減少,驗證了PI3K/AKT信號通路被抑制的有效性。貯藏期間,與對照組相比,LY294002處理使線粒體ATP、糖原含量、SDH和CS活性顯著下降(P<0.05);線粒體ROS水平不斷增加,細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和MPTP開放程度增加,膜電位顯著下降;凋亡因子Caspase-3活性顯著高于對照組(P<0.05),表明PI3K/AKT信號途徑通過促進ROS產(chǎn)生并與PI3K相互作用,介導(dǎo)了下游Caspase-3的活化,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損傷,進一步誘導(dǎo)細胞凋亡途徑的發(fā)生。

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