黑果枸杞多糖結(jié)構(gòu)表征及對乙醇誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞損傷的影響

錢 榮，安佳鑫，續(xù)曉琪,2,*，張 濤，陳愛君，李 莎，徐 虹

（1.南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇 南京 211816；2.保齡寶生物科技有限公司，山東 德州 251200；3.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.，LRM）是一種茄科多年生刺灌木，廣泛地分布在中國西北部，果實被稱為黑枸杞[1]。黑枸杞是我國傳統(tǒng)的藥食同源滋補食物，具有多種生物活性，例如抗疲勞、保護肝臟、降低血糖、保護腦皮質(zhì)神經(jīng)元、增強免疫功能等[2-6]。黑枸杞常見的食用方法是熱水浸泡后飲用，此時大量水溶性多糖溶于水中，因此，挖掘黑枸杞水溶多糖結(jié)構(gòu)和功能對其在食品工業(yè)的開發(fā)和應(yīng)用具有研究意義。多糖的生物活性取決于其主要結(jié)構(gòu)和鏈構(gòu)象，據(jù)已有報道，黑果枸杞多糖（LyciumruthenicumMurr.polysaccharide，LRMP）為高度分支的α(1→3)鍵連接的β-半乳糖基，具有不同的分支鏈取代基[7-9]，在β(1→6)-半乳糖的側(cè)鏈中，末端阿拉伯糖殘基數(shù)量增加的同時半乳糖殘基減少，表明阿拉伯糖殘基附著在半乳糖的O-3位置[10]，但是LRMP溶解液的高分子鏈構(gòu)象尚未明晰。

近年來，胃黏膜損傷導(dǎo)致的胃部疾病頻發(fā)，這與不恰當?shù)纳罘绞接嘘P(guān)，例如不規(guī)律的飲食方式、過大壓力和過度飲酒等[11]。胃黏膜上皮細胞（gastric mucosal epithelial cells，GES-1）頂端與相鄰細胞側(cè)膜緊密連接形成抵擋胃酸的黏膜屏障[12]，組成維持消化道健康的重要一環(huán)。據(jù)報道，多種功能性多糖具有保護胃黏膜的作用，例如，Liao Bingwu等[13]研究表明，猴頭菇多糖可保護GES-1細胞免受H2O2誘導(dǎo)的損傷；Yang Ke等[14]從鐵皮石斛葉片中分離出的多糖可抑制造成GES-1細胞損傷的炎癥因子。因此，本研究使用乙醇誘導(dǎo)的GES-1細胞損傷模型模擬酒精對人體胃黏膜屏障的影響，并探究LRMP是否具有相似的抑制GES-1細胞損傷的功能。

本研究從市售的黑枸杞中分離純化了一種水溶性多糖LRMP，分析其單糖組成、糖苷鍵的連接方式、分子質(zhì)量和鏈構(gòu)象等結(jié)構(gòu)參數(shù)，在此基礎(chǔ)上，利用GES-1細胞模型評估該多糖對乙醇誘導(dǎo)的細胞損傷的影響，并通過氧化損傷和線粒體染色的結(jié)果探究其作用機理，旨在為LRMP作為功能性多糖在健康食品中開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞干果 青海秦仁堂商貿(mào)有限公司；GES-1武漢賽維爾生物科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、乙腈、乙醇、磷酸鈉、巖藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖酸、半乳糖酸等（均為分析純）美國Sigma-Aldrich公司；細胞計數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒 南京草本源生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752S紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；DEAE Fast Flow瓊脂凝膠柱（3.8 cm×10 cm）、?KTATMUPC 100系統(tǒng) 美國GE公司；U3000高效液相色譜儀、Nicolet Nexus 470光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）美國Agilent公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）柱上海默克技術(shù)有限公司；OHpak SB-806 HQ色譜柱（8.0 mm×300 mm）昭和電工科學儀器（上海）有限公司；Viscostar-II黏度計 美國懷雅特技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 LRMP的分離純化

將干燥的黑枸杞干果按1∶4質(zhì)量比浸入蒸餾水，80 ℃加熱攪拌4 h后，離心收集上清液，加入3 倍體積的95%乙醇溶液，4 ℃過夜沉淀并收集粗多糖。采用離子交換柱層析色譜法將收集的粗多糖進行梯度洗脫純化，洗脫條件：使用?KTATMUPC 100系統(tǒng)和DEAE Fast Flow柱（3.8 cm×10 cm），0.2～2.0 mol/L NaCl溶液線性洗脫，洗脫速率為5 mL/min，以2 min/管收集洗脫液，最終收集NaCl濃度為1.4～1.6 mol/L的樣品，透析并冷凍干燥后進行實驗。使用H2SO4-苯酚法[15]和Bradford法[16]測定LRMP總碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 LRMP的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 單糖組成分析

采用PMP衍生-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對LRMP樣品單糖組成進行分析。首先，稱取2 mg LRMP樣品溶解在2 mol/L TFA溶液中，120 ℃條件下水解反應(yīng)3 h，用NaOH溶液中和水解產(chǎn)物，并用PMP標記；隨后，將產(chǎn)物過膜，使用U3000 HPLC系統(tǒng)和XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）進行組分分析。以巖藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖酸和半乳糖酸作為標準品。通過標準品的保留時間和紫外信號響應(yīng)值確定單糖組成。HPLC條件：流動相A為乙腈，流動相B為0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.7），流動相A與B體積比為17∶83；進樣體積20 μL；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長245 nm。

1.3.2.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

將LRMP樣品與干燥的KBr混合，壓片后進行實驗。樣品的光譜采用Nicolet光譜儀分析并記錄，波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.2.3 甲基化分析

使用改良法甲基化LRMP樣品，將LRMP樣品溶解在2 mol/L TFA中，121 ℃條件下水解2 h并用NaBH4還原，然后乙?；瘜⑵鋯翁寝D(zhuǎn)換為部分甲基化的糖醇乙酸酯。隨后使用GC-MS分析乙酰化樣品，通過質(zhì)譜鑒定甲基化糖的峰，結(jié)合GC的峰面積和相應(yīng)的響應(yīng)值估計其相對分子質(zhì)量，并通過有效的碳反應(yīng)計算部分甲基化糖醇乙酸酯的響應(yīng)因子。使用的毛細管柱為RXI-5 SIL MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），GC-MS條件：以3 ℃/min速率升至250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣；流速為1.0 mL/min；注射端口和檢測器的溫度為250 ℃。

1.3.3 LRMP分子特征及鏈構(gòu)象分析

使用高性能尺寸排阻色譜（high-performance sizeexclusion chromatography，HPSEC）、多角度激光散射儀和折射率檢測器系統(tǒng)測定LRMP的分子特征，使用OHpak SB-806 HQ色譜柱（8.0 mm×300 mm）進行樣品分離，流動相為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含150 mmol/L NaCl的10 mmol/L Na2HPO4溶液（pH 7.4）），樣品的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，進樣量為50 μL。得到分子質(zhì)量/kDa、重均分子質(zhì)量（mw/kDa）、數(shù)均分子質(zhì)量（mn/kDa）和均方半徑（Rg），使用ASTRA 6.2.1軟件計算特性黏度（[η]）和流體力學半徑（Rh），計算參考式（1）、（2）：

式中：Vh為流體動力學體積/nm3，由串聯(lián)黏度計得到；γ為2.5；NA為阿伏伽德羅常數(shù)/mol-1。

1.3.4 GES-1細胞實驗

1.3.4.1 細胞培養(yǎng)條件及存活率測試

GES-1培養(yǎng)在1640完全培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，使用0.25%胰蛋白酶進行消化和傳代。在倒置顯微鏡下觀察后取狀態(tài)良好的細胞進行消化并計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度至1×105個/mL，并接種于96 孔板中，每孔100 μL，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h直至貼壁。小心棄去上清液，加入含不同質(zhì)量濃度LRMP樣品的培養(yǎng)基中孵育；其中，LRMP樣品質(zhì)量濃度梯度為200、400、600 μg/mL，提前溶解在1640培養(yǎng)基中（不含血清和雙抗），孵育時間梯度為12、24、48 h并作為實驗組，以在1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同時間的細胞作為對照組，僅添加培養(yǎng)基作為空白組。孵育結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，以細胞存活率表示細胞活性，參考式（3）計算：

1.3.4.2 構(gòu)建GES-1乙醇損傷模型

GES-1按照濃度1×105個/mL接種在96 孔板中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h直至貼壁[17]。棄去上清液，換成含有不同體積分數(shù)（3%、5%、7%、10%和20%）乙醇溶液的1640培養(yǎng)基（不含血清和雙抗）孵育15 min，按照式（3）計算細胞存活率，得到50%存活率時對應(yīng)的乙醇體積分數(shù)。將未添加乙醇的空白對照組和乙醇損傷模型組的細胞存活率與添加不同質(zhì)量濃度（200、400、600 μg/mL）LRMP樣品孵育后再建模的細胞存活率作對比，分析LRMP樣品對乙醇損傷細胞的抑制作用。

1.3.4.3 LRMP對細胞乙醇損傷的保護效果評價

總SOD活力測定：按照1.3.4.1節(jié)方法布板并加樣孵育12 h，用含乙醇的培養(yǎng)基處理細胞15 min，乙醇溶液的體積分數(shù)為1.3.4.2節(jié)細胞損傷模型所得結(jié)果。通過反復(fù)冷凍和解凍破壞細胞并釋放細胞內(nèi)成分，2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液。用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度，根據(jù)總SOD試劑盒計算細胞液中總SOD的活力。

吖啶橙/溴乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）熒光染色檢測：根據(jù)1.3.4.2節(jié)構(gòu)建細胞損傷模型，用2 mL PBS（含1% AO+1% EB）處理20 min。棄去上清液，用PBS洗滌細胞兩次。在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。使用Image J 1.47b軟件對熒光圖像進行定量分析。通過計算綠色和橙紅色熒光的比例評估LRMP對GES-1乙醇損傷的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 LRMP的一級結(jié)構(gòu)

通過熱水提取和色譜柱純化，LRMP的產(chǎn)率相對于干質(zhì)量果實為（5.16±0.82）%，LRMP樣品純度較高，其中總糖相對含量為（88.60±1.97）%，蛋白質(zhì)相對含量為（2.31±0.36）%；如表1所示，LRMP主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖醛酸6 種單糖組成。

表1 LRMP單糖組成及物質(zhì)的量占比Table 1 Composition and content of monosaccharides in LRMP

LRMP的FTIR如圖1所示，3 450 cm-1和2 935 cm-1處的吸收峰分別是由O—H和C—H拉伸振動引起。1 620 cm-1和1 418 cm-1處的吸收峰分別由COO—基團的不對稱和對稱拉伸振動引起。1 330 cm-1處的吸收峰由O—H變形振動引起。在1 090 cm-1和995 cm-1處的吸收峰表明LRMP結(jié)構(gòu)中的糖環(huán)存在吡喃糖[18-19]。根據(jù)單糖組成的結(jié)果，半乳糖是LRMP的主要單糖組分，其次是阿拉伯糖和葡萄糖。

圖1 LRMP的FTIRFig.1 FTIR spectrum of LRMP

甲基化反應(yīng)后進行GC-MS分析是解析多糖結(jié)構(gòu)的有效方法，結(jié)合圖1，獲得多種糖殘基的物質(zhì)的量占比（表2），結(jié)果表明LRMP是具有許多單糖分支點的多糖，殘基的連接方式共有12 種。阿拉伯糖殘基類型包括末端阿拉伯呋喃糖和(1→5)-阿拉伯呋喃糖；葡萄糖殘基包括末端葡萄糖和(1→4)-葡萄糖；木糖殘基類型包括末端木糖和(1→4)-木糖；半乳糖殘基包括末端半乳糖、(1→3)-半乳糖、(1→4)-半乳糖、(1→6)-半乳糖和(1→3,6)-半乳糖。其中，最主要的糖苷鍵末端單元為阿拉伯呋喃糖-(1→，物質(zhì)的量占比為19.82%；其他糖苷鍵末端單元為半乳糖-(1→、葡萄糖-(1→和木糖-(1→，物質(zhì)的量占比分別為4.44%、3.51%和2.69%；最主要的糖苷鍵分支單元為在3號位取代的→3,6)-半乳糖-(1→和→3)-半乳糖-(1→糖苷鍵，物質(zhì)的量占比分別為14.1%和7.51%；其余未取代的殘基為→4)-葡萄糖-(1→、→4)-木糖-(1→、→5)-阿拉伯呋喃糖-(1→、→3)-半乳糖-(1→和→6)-半乳糖-(1→，物質(zhì)的量占比分別為14.48%、11.41%、8.04%、7.51%和5.63%。這表明LRMP的主鏈可能由(1→3)-半乳糖或(1→6)-半乳糖構(gòu)成，與Lv Xiaopeng等[9]分離純化得到的LRP4-A結(jié)果大致相似。

表2 LMRP的連接分析結(jié)果Table 2 Glycosidic linkage analysis of LMRP

2.2 LRMP分子質(zhì)量及鏈構(gòu)象分析

從圖2A可知，LRMP的HPSEC圖峰形單一且分布對稱，多分散性指數(shù)（mw/mn）為1.30，接近1，說明LRMP的平均分子質(zhì)量分布較均一。LRMP的mw為（1 589.0±21.9）kDa，Rg為（80.4±1.0）nm，[η]和Rh分別為（1 437.34±2.73）mL/g和（83.49±0.50）nm（表3）。

圖2 LRMP分子質(zhì)量及鏈構(gòu)象Fig.2 Molecular mass and chain conformationanalysis of LRMP

表3 LMRP的mw、分子大小、[η]參數(shù)Table 3 mw,molecular size and [η]parameters of LRMP

由圖2B、C可知溶液中的鏈構(gòu)象參數(shù)。構(gòu)象參數(shù)αs為的指數(shù)值，αs＝0.33時，高分子鏈在溶液中為球狀鏈；當αs＝0.5～0.6時，高分子鏈為柔性鏈；當αs＝1時，高分子鏈在溶液中呈剛性鏈[20]。馬克-霍溫克方程的指數(shù)αη也可表征多糖構(gòu)象，αη＝0.22時，高分子鏈在溶液中為球狀鏈；當αη＝0.5～0.8時，高分子鏈為柔性鏈；當αη＝1～2時，高分子鏈在溶液中呈剛性鏈[21]。高聚物的結(jié)構(gòu)參數(shù)ρ（ρ＝Rg/Rh）是高聚物在溶液中的特性參數(shù)，當ρ＝0.78時，高分子鏈在溶液中為球狀鏈；當ρ＝1時，高分子鏈在溶液中呈半剛性鏈；當ρ＝2時，高分子鏈在溶液中呈剛性鏈[22]。圖2B的αs（0.578）和圖2C的αη（0.968 9）表明LRMP在0.15 mol/L NaCl溶液（pH 7.4）中以柔性鏈或半剛性鏈形式存在，ρ為0.96表明LRMP呈線性無規(guī)卷曲，和αs、αη的結(jié)果相符。周聲怡[23]的研究表明，堿提枸杞多糖在溶液中多呈現(xiàn)柔性鏈構(gòu)象，而酸提或熱水提枸杞多糖在溶液中會有剛性鏈構(gòu)象，這可能是高溫釋放更多的阿拉伯糖與半乳糖，多糖鏈結(jié)構(gòu)變短造成。

2.3 GES-1細胞模型

2.3.1 乙醇損傷GES-1模型條件

LRMP對GES-1細胞的毒性如圖3A所示。當孵育12、24 h和48 h后，細胞活性均保持在100%左右，與猴頭菇多糖[13]和鐵皮石斛葉多糖[14]處理后的細胞活性相比，無明顯細胞毒性。

圖3 乙醇損傷GES-1模型Fig.3 Evaluation of ethanol-induced damage in GES-1 cells

如圖3B所示，GES-1的細胞損傷率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增大，當乙醇體積分數(shù)為5%時，細胞損傷率為（50.00±5.32）%。在顯微鏡下觀察GES-1的細胞形態(tài)，相比正常GES-1（圖3C），乙醇損傷后GES-1變圓（圖3D）。因此，采用體積分數(shù)5%乙醇溶液為后續(xù)實驗構(gòu)建損傷模型。

如圖4A所示，經(jīng)5%乙醇損傷的GES-1細胞活性顯著下降，但當使用200、400、600 μg/mL LRMP進行預(yù)孵育后再建模，細胞活性分別為（63.4±3.2）%、（78.2±3.9）%和（86.4±4.3）%，相較模型組分別提高了13.4%、28.2%和36.4%，表明用LRMP預(yù)處理可以保護乙醇誘導(dǎo)的細胞損傷，顯著提高細胞存活率。

圖4 LRMP樣品對乙醇損傷GES-1細胞活性（A）和SOD活力（B）的影響Fig.4 Protective effect of LRMP on ethanol-induced injure in GES-1 cells (A) andits influence on SOD activity (B)

SOD具有抗氧化活性，能清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）。如圖4B所示，與模型組相比，提前孵育LRMP后再進行乙醇損傷，GES-1中總SOD活力顯著提高，樣品質(zhì)量濃度為600 μg/mL時，SOD活力與對照組無顯著差異。這表明LRMP處理后的細胞在乙醇損傷時，具有更強的抗氧化能力，低水平的ROS更有利于細胞增殖[24]。結(jié)果表明，LRMP可以抑制乙醇對細胞的氧化損傷，增強乙醇損傷后細胞清除自由基的能力，具有保護胃黏膜損傷的潛力。

2.3.2 AO/EB熒光染色結(jié)果

乙醇攝入可能影響細胞的許多功能[25]，本研究中的細胞模型表明，乙醇可以破壞GES-1的細胞膜，導(dǎo)致細胞膜通透性異常，最終導(dǎo)致細胞凋亡。AO可以穿透活細胞完整的細胞膜并對細胞進行染色，產(chǎn)生綠色熒光；當細胞壞死時，AO和EB在細胞中結(jié)合，導(dǎo)致橙紅色核染色質(zhì)和橢圓形細胞，紅色熒光比例的增加代表更多的細胞凋亡[26-27]。如圖5A所示，與對照組相比，模型組的紅色熒光數(shù)量增加，紅綠熒光比顯著提高到1.13±0.05，遠高于對照組（0.66±0.03）（圖5B），這表明更多的GES-1在乙醇損傷后出現(xiàn)非自然凋亡。在預(yù)先用LRMP樣品孵育的GES-1實驗組中，紅綠熒光比分別為0.65±0.03、0.73±0.03、0.59±0.03，紅色熒光的分布和強度顯著降低，基本恢復(fù)至對照組水平。這表明LRMP樣品對GES-1的乙醇損傷具有更好的保護作用。多糖樣品對細胞損傷修復(fù)或預(yù)防的功效已有報道[28]，本研究證實了LRMP能夠恢復(fù)細胞的SOD活力，提高抗氧化能力，減輕氧化損傷導(dǎo)致的細胞凋亡，對乙醇誘導(dǎo)損傷的GES-1有保護作用。

圖5 LRMP對乙醇損傷GES-1細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of LRMP on ethanol-induced apoptosis in GES-1 cells

3 結(jié)論

本研究采用熱水提取法從黑枸杞果實中提取多糖，并對LRMP的單糖組成、糖苷鍵連接方式、鏈構(gòu)象等信息進行測定。結(jié)果表明，LRMP由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖和半乳糖醛酸組成，結(jié)構(gòu)末端主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖殘基組成，在溶液中呈典型的無規(guī)卷曲構(gòu)象，Rg為（80.4±1.0）nm。在細胞實驗中，LRMP（600 μg/mL）可以顯著抑制乙醇對GES-1細胞造成的損傷，恢復(fù)細胞內(nèi)SOD活性，通過抑制氧化損傷降低GES-1細胞凋亡率。綜上，LRMP有提高免疫力、抗氧化、保護胃黏膜等生物活性，具有作為功能性多糖用于健康食品開發(fā)的潛力。