孔石莼多糖無(wú)花果果酒釀造工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

叢懿潔

（威海海洋職業(yè)學(xué)院 食品與藥品系，山東 威海 264300）

孔石莼（Ulva pertusaKjellm）屬綠藻門(mén)石莼科石莼屬，是一種可食用的大型綠藻[1]。在黃、渤海地區(qū)產(chǎn)量非常豐富，是威海沿海地區(qū)分布較廣泛的野生海藻[2]。孔石莼中含有豐富的多糖，包括纖維素多糖、水溶性陰離子多糖及淀粉等?？资欢嗵蔷哂锌寡趸?、抗菌、抗病毒、降血糖、降膽固醇以及治療心腦血管等疾病的作用。徐軍[3]對(duì)石莼多糖的提取及其抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，石莼多糖對(duì)羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory con centration，IC50）值分別為2.4 mg/mL和11.5 mg/mL，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。馮學(xué)珍等[1]優(yōu)化石莼多糖的提取工藝并測(cè)定其清除DPPH自由基的IC50值為0.87 mg/mL。

無(wú)花果（Ficus caricaL.）屬于小漿果，其因花朵從內(nèi)膨大構(gòu)成果實(shí)本體、花位于果內(nèi)而具有特殊性。《圣經(jīng)》中無(wú)花果被美稱(chēng)為“神圣之果”、“生命之果”[4]。無(wú)花果果軟肉嫩，酸甜可口，富含多種活性成分，如活性多糖、黃酮、多酚、過(guò)氧化歧化酶、花青素、維生素C等。DEL CARO A等[5]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)花果果皮中幾乎覆蓋了所有的酚類(lèi)物質(zhì)。VEBERIC R等[6]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)花果中富含黃酮類(lèi)物質(zhì)，如槲皮素蕓香糖苷、蘆丁、花色素苷、表兒茶素等。孫小華[4]研究無(wú)花果果酒的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)無(wú)花果的總抗氧化能力、對(duì)DPPH自由基清除率與羥自由基抑制率隨著果酒發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。另外，無(wú)花果還含有佛手柑內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素、苯甲醛等抗癌成分，具有健脾益胃、潤(rùn)肺止咳、解毒消腫等功效[7]。

目前，無(wú)花果因保存期較短，大部分新鮮食用，少部分被加工成無(wú)花果干、無(wú)花果醬等，市面關(guān)于無(wú)花果酒的產(chǎn)品相對(duì)較少。本試驗(yàn)擬以山東威海地產(chǎn)無(wú)花果為原料，添加孔石莼多糖，制備孔石莼多糖無(wú)花果果酒，采用單因素和響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期對(duì)孔石莼等海藻類(lèi)資源、無(wú)花果的精深加工提供思路，對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展起到促進(jìn)作用[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼：取自威海海邊；無(wú)花果：山東威海大型超市；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇：東莞市勛業(yè)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（1.8×105U/g）：日本天野酶制品株式會(huì)社；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（5×104U/g）：上海華上翔洋生物技術(shù)有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠(chǎng)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；維生素C：維克奇生物科技有限公司；檸檬酸（食品級(jí)）：河北拓海生物科技有限公司；白砂糖：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

FSD-100粉碎機(jī)：鄭州中谷機(jī)械設(shè)備有限公司；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DZW-6020真空干燥箱：上海鉑溫儀器有限公司；QQM500D臺(tái)式低速離心機(jī)：上海啟前電子科技有限公司；JGG均質(zhì)機(jī)：溫州市利宏機(jī)械科技有限公司；TJE06A榨汁杯：浙江蘇泊爾股份有限公司；HH-US 恒溫水浴箱：江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司；PAL-109酒精濃度計(jì)：阜陽(yáng)菲勒科技有限公司；JC-400-SE恒溫培養(yǎng)箱：青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司；MIK-PH8.0 pH計(jì)：杭州美控自動(dòng)化技術(shù)有限公司；LH-T55手持糖度儀：浙江陸恒環(huán)境科技有限公司；FA1204B電子天平：青島聚創(chuàng)世紀(jì)環(huán)保科技有限公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 孔石莼多糖提取

將孔石莼清洗，烘干、粉碎，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡48 h后過(guò)濾，烘干得脫脂孔石莼[10-11]。將烘干后的孔石莼粉碎制得粉末，過(guò)60目篩。向孔石莼粉末按料液比1∶50（g∶mL）加水，并加入500 U/g纖維素酶，于50 ℃條件下超聲40 min提取孔石莼多糖。沸水浴15 min，鈍化酶活。200目絹布過(guò)濾提取液，3 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液進(jìn)行真空濃縮，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇進(jìn)行醇沉，搖勻，靜置6 h，1 500 r/min離心5 min，得孔石莼多糖沉淀。加入適量的水溶解，真空濃縮干燥48 h。將干燥好的樣品研磨成粉末狀置于4 ℃冰箱里，備用[12-13]。

1.3.2 孔石莼多糖無(wú)花果果酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

新鮮無(wú)花果→酶解、打漿→調(diào)整成分→接種發(fā)酵→陳釀→成品

操作要點(diǎn)[14-15]：

選取新鮮、無(wú)破損、成熟度較好的威海青皮無(wú)花果為原料，清洗、去蒂、切分后，添加2倍無(wú)花果質(zhì)量的水，用榨汁機(jī)打漿約2 min，打漿時(shí)添加0.02%的檸檬酸護(hù)色，打漿后立即加入0.02%偏重亞硫酸鉀，進(jìn)行抑菌。隨后向無(wú)花果漿中加入0.3%的果膠酶，45 ℃水浴酶解2 h，90 ℃滅酶5 min。冷卻后過(guò)濾，5 000 r/min條件下離心15 min，得到無(wú)花果汁。

向無(wú)花果汁中添加適量的白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度，添加檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3.4左右。隨后添加一定量的孔石莼多糖。取1 g干酵母加入10 mL 2%葡萄糖溶液中，混合均勻后于37 ℃活化30 min備用。在90 ℃水浴條件下滅菌5 min，冷卻至室溫后添加一定量經(jīng)活化后的釀酒酵母菌種，混勻后入罐發(fā)酵（入罐前用SO2熏罐），在一定的溫度條件下發(fā)酵一定時(shí)間，至液體逐漸澄清，酒精度不再發(fā)生變化，終止發(fā)酵。在4 ℃條件下陳釀30 d，添加2%的皂土溶液進(jìn)行澄清，用100目的濾布進(jìn)行過(guò)濾，而后灌裝得到孔石莼多糖無(wú)花果果酒成品。

1.3.3 孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在初始糖度22°Bx，酵母接種量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，以感官評(píng)分和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，改變單一因素，分別考察初始糖度（18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx）、酵母接種量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、孔石莼多糖添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇初始糖度（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為4個(gè)因素，以果酒感官評(píng)分（Y1）和酒精度（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

1.3.4 測(cè)定方法

（1）感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]

按照GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則第1部分：優(yōu)選評(píng)價(jià)員》[17]對(duì)評(píng)價(jià)員進(jìn)行篩選和培訓(xùn)，最終選取10名優(yōu)選評(píng)價(jià)員。結(jié)合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，根據(jù)果酒的特點(diǎn)，確定果酒的外觀(guān)、香氣、滋味、典型性為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。10名優(yōu)選評(píng)價(jià)員從4個(gè)方面對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿(mǎn)分為100分，最終結(jié)果取10人的平均分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

（2）抗氧化活性測(cè)定

①DPPH自由基清除率的測(cè)定[19]：分別取0.05 mL、0.07 mL、0.09 mL、0.11 mL、0.13 mL、0.15 mL、0.17 mL果酒樣品于具塞比色管中，用純水補(bǔ)充至2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL搖勻，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，取上清液于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；同時(shí)取相同系列體積的果酒樣品，用純水補(bǔ)充至2mL，加入2 mL無(wú)水乙醇溶液混合均勻，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)2；以2 mL無(wú)水乙醇溶液和2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合后在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0為空白對(duì)照；以0.2 mg/mL維生素C溶液作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

②A(yíng)BTS自由基清除率[20]：分別取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL果酒樣品于具塞比色管中，用純水補(bǔ)充至2 mL，加入ABTS工作液2 mL搖勻，室溫條件下避光反應(yīng)20 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)i；以純水替代樣品為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；以0.2 mg/mL 維生素C作陽(yáng)性對(duì)照。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

（3）理化及微生物指標(biāo)測(cè)定

酒精度：參照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的酒精計(jì)法[21]；總糖、總酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]；pH值：pH計(jì)測(cè)定；菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[22]；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[23]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 9.0作圖，采用Design-Expert 13.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始糖度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響

在酵母接種量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，考察初始糖度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 初始糖度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of initial sugar degree on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖1可知，隨著初始糖度的升高，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度均呈現(xiàn)先升高后略有降低的趨勢(shì)，而殘?zhí)橇肯染徛黾佣罂焖偕仙?。?dāng)初始糖度達(dá)到22°Bx時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度均到最高，分別為93.5分和11.8%vol，而此時(shí)殘?zhí)橇砍士焖偕仙墓拯c(diǎn)。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)初始糖度較低時(shí)，酵母完全利用了體系中的糖進(jìn)行繁殖，糖不足導(dǎo)致酒精度較低，達(dá)不到正常果酒的口感，此時(shí)制備的果酒的感官評(píng)分和酒精度均較低。隨著初始糖度的升高，環(huán)境體系能夠充分滿(mǎn)足酵母的增長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)初始糖度進(jìn)一步升高，過(guò)高糖度開(kāi)始抑制酵母繁殖，使發(fā)酵不完全，產(chǎn)生的酒精較少，產(chǎn)品的口感也開(kāi)始變差[24]。因此，選擇最佳初始糖度為22°Bx。

2.1.2 酵母接種量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響

在初始糖度22 °Bx，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，考察酵母接種量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酵母接種量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響Fig. 2 Effects of yeast inoculation on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酵母接種量＜0.04%時(shí)，隨著酵母接種量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度均逐漸升高；當(dāng)酵母接種量達(dá)到0.04%時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度均最高，分別為94.3分和12.1%vol；當(dāng)酵母接種量＞0.04%時(shí)，隨著接種量的繼續(xù)增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分和酒精度逐漸降低，此時(shí)因酵母接種量較大，酵母自身大量繁殖和產(chǎn)生的代謝物抑制酒精的產(chǎn)生，感官品質(zhì)也因此受到影響[25]。殘?zhí)橇吭诮湍附臃N量為0.02%～0.06%范圍內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由于酵母接種量越多，越有利于酵母將糖類(lèi)物質(zhì)充分分解。因此，選擇最佳酵母接種量為0.04%。

2.1.3 孔石莼多糖添加量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響

在初始糖度22°Bx，酵母接種量0.04%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，考察孔石莼多糖添加量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 孔石莼多糖添加量對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響Fig. 3 Effects of Ulva pertusa polysaccharide addition on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖3可知，隨著酵母接種量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)孔石莼多糖添加量＜0.3%時(shí)，隨著多糖添加量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分隨之增加；當(dāng)孔石莼多糖添加量達(dá)到0.3%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高為93.8分；當(dāng)孔石莼多糖添加量＞0.3%，隨著多糖添加量的繼續(xù)增加，可能由于孔石莼多糖累積到一定程度對(duì)果酒風(fēng)味產(chǎn)生影響，因此感官評(píng)分下降?？资惶砑恿繉?duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒的酒精度影響不顯著（P＞0.05），當(dāng)孔石莼多糖添加量從0.1%增加至0.5%時(shí)，產(chǎn)品的酒精度大致穩(wěn)定在11.6%vol～12.0%vol。殘?zhí)橇砍尸F(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。綜合感官評(píng)分和酒精度兩個(gè)指標(biāo)，選擇孔石莼多糖最佳添加量為0.3%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響

在初始糖度22 °Bx，酵母接種量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵時(shí)間8 d的條件下，考察發(fā)酵溫度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響Fig. 4 Effects of fermentation temperature on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分和酒精度整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而殘?zhí)橇砍氏陆第厔?shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，酵母生長(zhǎng)緩慢，酒精積累不足，酒香氣不足，感官評(píng)分較低；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到26 ℃時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分和酒精度均達(dá)到最高，分別為94.5分和12.1%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度高于26 ℃時(shí)，酵母大量繁殖消耗糖分，酒精度下降，同時(shí)因營(yíng)養(yǎng)成分消耗完導(dǎo)致酵母菌死亡，使酒體產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)，感官評(píng)分下降[26]。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為26 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響

在初始糖度22 °Bx，酵母接種量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃的條件下，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒品質(zhì)的影響Fig. 5 Effects of fermentation time on the quality of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分和酒精度整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間較短時(shí)，果酒的酒精度不夠，口感較差，感官評(píng)分較低；當(dāng)達(dá)到第8天時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分達(dá)到最高為94.5分，此時(shí)果酒發(fā)酵充分，有較好的果香氣、酒香氣以及果酒正常的口感；隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，酒精度穩(wěn)定，但酒體產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物使感官評(píng)分明顯下降。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＜8 d時(shí)，發(fā)酵不充分，酒精度不夠；在第8天時(shí)，酒精度達(dá)到最高為11.7%vol；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞8 d時(shí)，酒精度不再增高，保持穩(wěn)定狀態(tài)，此后體系中產(chǎn)酒能力已達(dá)到最大值。殘?zhí)橇侩S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為8 d。

2.2 孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 13.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface for fermentation conditions optimization of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 13.0對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分和酒精度的回歸方程如下：

Y1=93.54+1.71A+1.78B+1.45C+1.74D+1.83AB+0.2AC-0.75AD+4.3BC+0.63BD-1.30CD-8.29A2-8.70B2-4.43C2-4.29D2

Y2=11.82-0.43A+0.28B+0.63C+0.35D+0.08AB+0.38AC-0.75AD+0.60BC+0.28BD-0.15CD-0.78A2-1.44B2-1.18C2-0.47D2

由表4可知，感官評(píng)分和酒精度的兩個(gè)回歸模型均為極顯著（P＜0.000 1）；且失擬項(xiàng)P（感官評(píng)分）=0.055 5和P（酒精度）=0.194 5，均不顯著。說(shuō)明感官評(píng)分（Y1）、酒精度（Y2）兩項(xiàng)回歸方程擬合度均較好，可以用其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行估算[27]。

感官評(píng)分回歸方程的決定系數(shù)R2=0.964 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.928 2，即92.82%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用該模型進(jìn)行分析，即模型中92.82%的孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分變化來(lái)自于此試驗(yàn)中的自變量A、B、C、D。通過(guò)F值得到影響產(chǎn)品感官評(píng)分的各因素順序?yàn)榻湍附臃N量（B）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞初始糖度（A）＞發(fā)酵溫度（C）。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C、D和交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)感官評(píng)分的影響呈極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)感官評(píng)分的影響呈顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。

酒精度回歸方程的決定系數(shù)R2=0.930 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.860 0，即86%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用該模型進(jìn)行分析，即模型中86%的孔石莼多糖無(wú)花果果酒的酒精度變化來(lái)自于此試驗(yàn)中的自變量A、B、C、D。通過(guò)F值得到影響產(chǎn)品酒精度的各因素順序?yàn)榘l(fā)酵溫度（C）＞初始糖度（A）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞酵母接種量（B）。由P值可知，一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酒精度的影響呈極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B、D和交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)D2對(duì)酒精度的影響呈顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。

變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）（感官評(píng)分）=2.02%和CV（酒精度）=4.04%，說(shuō)明試驗(yàn)的穩(wěn)定性較高。信噪比（感官評(píng)分）=18.527 9和信噪比（酒精度）=12.011 3，均大于4，表明試驗(yàn)的可信度比較高。綜合來(lái)看，感官評(píng)分和酒精度的兩個(gè)回歸模型擬合度均較好，試驗(yàn)操作可信度均較高，都能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)果酒相應(yīng)的品質(zhì)[28]。

根據(jù)單因素試驗(yàn)，在最優(yōu)單因素條件下，果酒的酒精度大致穩(wěn)定在11.4%vol～12.1%vol，滿(mǎn)足果酒酒精度的基本要求，同時(shí)根據(jù)評(píng)價(jià)員反饋，在此范圍的酒精度變化對(duì)產(chǎn)品口感影響不大。評(píng)價(jià)員更加關(guān)注果酒的香氣、滋味、典型性等感官品質(zhì)，因此選擇以感官評(píng)分作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)并分析。各交互因素的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6。

圖6 各因素間交互作用對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒感官評(píng)分及酒精度影響的響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the sensory score and alcohol content of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖6可知，響應(yīng)面的曲面坡度較陡，等高線(xiàn)呈橢圓形，即酵母接種量與初始糖度、酵母接種量和發(fā)酵溫度間的交互作用對(duì)感官評(píng)分影響較大，響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)結(jié)果與回歸模型方差分析一致。

Design-Expert 13.0軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行最優(yōu)求解得出，孔石莼多糖無(wú)花果果酒理論預(yù)測(cè)的最佳發(fā)酵條件為：初始糖度21.865°Bx，酵母接種量0.042%，發(fā)酵溫度26.239 ℃，發(fā)酵時(shí)間8.264 d，在此條件下，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的理論預(yù)測(cè)感官評(píng)分為94.026分，酒精度為12.027%vol。

結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件，修訂孔石莼多糖無(wú)花果果酒發(fā)酵條件為初始糖度22°Bx，酵母接種量0.04%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d，其他因素不變，在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒的感官評(píng)分為93.8分，酒精度為11.8%vol，與理論預(yù)測(cè)值相差較小。因此，此試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂糜趦?yōu)化孔石莼多糖無(wú)花果果酒的發(fā)酵工藝。

2.3 孔石莼多糖無(wú)花果果酒抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

由圖7（a）可知，當(dāng)樣品體積＜0.11 mL時(shí)，隨著樣品量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒和維生素C樣品的DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)樣品體積＞0.11 mL時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒和維生素C樣品的DPPH自由基清除率均趨于平穩(wěn)，最大值分別達(dá)到94.4%和97.4%。對(duì)于相同體積的樣品，果酒對(duì)DPPH自由基清除能力低于維生素C。

圖7 孔石莼多糖無(wú)花果果酒對(duì)DPPH（a）及ABTS（b）自由基清除率的影響Fig. 7 Effects of DPPH (a) and ABTS (b) free radical scavenging rates of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由圖7（b）可知，當(dāng)樣品體積＜0.2 mL時(shí)，隨著樣品量的增加，孔石莼多糖無(wú)花果果酒和維生素C樣品的ABTS自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)樣品體積＞0.2 mL時(shí)，孔石莼多糖無(wú)花果果酒和維生素C樣品的ABTS自由基清除率均趨于平穩(wěn)，最大值分別達(dá)到95.8%和97.6%。對(duì)于相同體積的樣品，果酒的ABTS自由基清除能力低于維生素C[29]。表明孔石莼多糖無(wú)花果果酒對(duì)DPPH、ABTS自由基有一定的清除作用。

2.4 孔石莼多糖無(wú)花果果酒的理化和微生物指標(biāo)

最佳發(fā)酵條件下制備的孔石莼多糖無(wú)花果果酒各項(xiàng)理化、微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 孔石莼多糖無(wú)花果果酒理化和微生物指標(biāo)Table 6 Physicochemical and microbiological indexes of Ulva pertusa polysaccharide fig fruit wine

由表6可知，孔石莼多糖無(wú)花果果酒總糖含量（以葡萄糖計(jì)）為（53.8±0.79）g/L、總酸（以酒石酸計(jì)）含量為（3.8±0.11）g/L、菌落總數(shù)＜1 CFU/mL、大腸菌群未檢出，各項(xiàng)指標(biāo)均符合NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》[30]的相關(guān)規(guī)定。

3 結(jié)論

該研究采用單因素和響應(yīng)面法對(duì)孔石莼多糖無(wú)花果果酒的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為初始糖度22°Bx，酵母接種量0.04%，孔石莼多糖添加量0.3%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d。在此條件下得到的孔石莼多糖無(wú)花果果酒澄清、透亮、有光澤，具有無(wú)花果的典型性，酒味醇厚，香氣怡人，感官評(píng)分為93.8分，酒精度為11.8%vol。孔石莼多糖無(wú)花果果酒的DPPH和ABTS自由基清除率分別達(dá)到94.4%和95.8%，表明研制的果酒具備一定的抗氧化能力。本研究結(jié)果為威海等沿海地區(qū)海藻類(lèi)、無(wú)花果等資源深加工提供一定思路，具備一定的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)價(jià)值。