骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體靜脈移植對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用研究

馬 驄，李 剛，馬亮亮，李 想，張永潑

1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450003；2.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）小兒外科，河南 鄭州 450003；3.河南省組織細(xì)胞庫(kù)有限公司，河南 鄭州 450000

脊髓損傷是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥，從病理解剖上可將脊髓損傷分為原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷，主要表現(xiàn)為四肢功能活動(dòng)障礙、大小便功能障礙等，容易給患者的脊髓造成嚴(yán)重的功能損傷［1］。脊髓損傷的主要危害為各系統(tǒng)都可出現(xiàn)臨床癥狀，且癥狀取決于損傷的部位，還有可能造成患者的下肢功能障礙，且神經(jīng)傳導(dǎo)通路最終都是傳到腦部，頸椎、胸椎和腰椎損傷也可能發(fā)生大小便控制障礙［2］。此外，患者還會(huì)出現(xiàn)疼痛、感覺(jué)異常、肢體痙攣，同時(shí)導(dǎo)致患者社會(huì)參與度下降，給患者的生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。干細(xì)胞研究是繼人類(lèi)基因組大規(guī)模測(cè)序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命科學(xué)領(lǐng)域。隨著我國(guó)醫(yī)療水平的不斷提升，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）不僅能夠有效抑制炎癥的產(chǎn)生，同時(shí)還能促進(jìn)神經(jīng)軸突以及血管的再生，對(duì)于恢復(fù)患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能具有較好的作用［3］。外泌體具有在體內(nèi)進(jìn)行生物信息傳輸?shù)淖饔?。有研究?］表明靜脈注射BMSCs對(duì)于治療外泌體具有較好的作用，且在各種腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷等治療及后續(xù)修復(fù)中具有較好的作用?；诖?，本研究將以大鼠模型實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，分析BMSCs 來(lái)源的外泌體靜脈移植對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用，以期為我國(guó)臨床外泌體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療提供一定的指導(dǎo)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年10 月—2014 年3 月河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的78 例大鼠為研究對(duì)象，大鼠體重為175～200 g，由省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。應(yīng)用隨機(jī)拋球法將大鼠分為手術(shù)組（n=26）、對(duì)照組（n=26）、外泌體組（n=26）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

本實(shí)驗(yàn)采用脊髓打擊器、倒置顯微鏡、CO2孵育箱、透射電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、L-DMEM 培養(yǎng)基、外泌體提取試劑盒ExoQuick-TCExosomeIsolationReagent、CD9、CD63、LuxolFastBlue髓鞘染色液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

應(yīng)用脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷模型后，對(duì)照組不作處理，手術(shù)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上實(shí)施切開(kāi)減壓術(shù)，而外放體組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上實(shí)施外放體移植，具體措施如下。（1）大鼠BMSCs 分離培養(yǎng)。采用全骨髓貼壁法進(jìn)行BMSCs 的體外分離和培養(yǎng)，腹腔內(nèi)應(yīng)用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）、75%乙醇進(jìn)行全身消毒。在無(wú)菌條件下分開(kāi)兩個(gè)股骨脛骨，剪斷干骺端露出髓腔，將L-DMEM 培養(yǎng)液從骨髓中排出。經(jīng)1 000 r/min 離心5 min 后，將上清液用10%的體積含量的L-DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行再懸浮，再用1×106/L 的濃度進(jìn)行接種，在37 ℃、5%CO2的恒溫下培養(yǎng)。24 h 時(shí)進(jìn)行第一次半量換液，其后2 d 進(jìn)行全劑量換液。采用倒置顯微鏡對(duì)BMSCs 進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，在80%～90%的貼壁細(xì)胞中進(jìn)行融合，0.25%的胰酶將其消化，以1∶2的比例進(jìn)行傳代。（2）外泌體的分離及觀察。將用不含外泌體的血漿制備的P2 代MSCs 培養(yǎng)24 h。采集培養(yǎng)液，按照ExoQuick 推薦的方法取20 mL 培養(yǎng)液，用3 000 g 的相對(duì)離心力（3 000 倍重力加速度）離心15 min，將細(xì)胞殘?jiān)?，?∶1/5 的上清液加入外泌體萃取液，混合均勻，4 ℃孵化一晚，放入離心機(jī)，1 500 g 離心30 min，去上清，底部沉淀即為外泌體。應(yīng)用透射電鏡觀察并對(duì)其進(jìn)行表征、PBS 重懸及BCA 蛋白含量的檢測(cè)。調(diào)整之后的濃度控制為200 μg/mL，放置于80 ℃的溫度中保存。保存完成之后放置于室溫中吸附多余的液體進(jìn)行晾干。在造模24 h 后，取2 只外泌體大鼠經(jīng)4%戊二醛深度麻醉后，取T10脊髓節(jié)段，經(jīng)常規(guī)脫水、浸透等處理，電鏡下觀察外泌物是否已抵達(dá)脊髓［5］。（3）外泌體表面標(biāo)志物鑒定。用20 mL 的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后放入300 μL 的溶解液混合冰溶解30 min，再放入4 ℃低溫超高速離心機(jī)10 000 r/min 離心5 min，將其上清分裝，用BCA 方法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。提取30 μg總蛋白，將其放入1/4上樣緩沖液中，99 ℃水浴10 min。將30 μL 的樣品分離，再用半干燥方法將其電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，37 ℃封閉2 h，CD9 和CD63（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜，用等滲緩沖鹽溶液沖洗薄膜5 min×4次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG（1∶1 000比例稀釋?zhuān)?7 ℃孵育2 h，PBS沖洗2次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定暗室曝光。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）分別采用BBB 評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)構(gòu)造后1、3、7、14、21、28 d 的后肢功能情況［6］。BBB 評(píng)分共22 個(gè)等級(jí)：0 分為后腿完全麻痹；21 分為功能正常。采用兩位有經(jīng)驗(yàn)的觀察者雙盲評(píng)定，主要觀察關(guān)節(jié)的活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷和運(yùn)動(dòng)幅度，前肢、后肢和尾巴的協(xié)調(diào)。斜板實(shí)驗(yàn)：將大鼠放在與平板垂直軸線相垂直的平板上，各測(cè)試傾斜板傾斜度每次增大5°，當(dāng)大鼠在最大角度停留5 s 后，記錄斜板傾斜度為斜板實(shí)驗(yàn)得分。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的觀察者對(duì)不同時(shí)間段的結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。（2）脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察［7］：對(duì)脊髓損傷后28 d 各組大鼠進(jìn)行心臟麻醉沖洗實(shí)驗(yàn)，將4%的多聚甲醛注入大鼠心臟，并取出脊髓組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等處理。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，蘇木素染色5 min，水洗3次，鹽酸乙醇分色20 s，再用1%伊紅液在水中浸泡5 min；髓鞘（LFB）染色：用Luxol固藍(lán)液浸泡一夜，用95%乙醇浸泡3 min，用乙醇浸泡3 min，用0.05%碳酸鋰溶液浸泡15 min，再用70%乙醇進(jìn)一步分化30 s，直至能清晰地辨別出灰白，觀察各組脊髓組織形態(tài)學(xué)改變。采用尼氏（Nissl）染色染色：用1%甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)切片進(jìn)行10 min 的觀察，然后用常規(guī)的梯度法進(jìn)行脫水，觀察神經(jīng)元存活數(shù)目。所有指標(biāo)觀察均取5張計(jì)數(shù)平均值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料，組間比較行LSD-t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較行單樣本t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有大鼠均在術(shù)前1 d、術(shù)后1 d 行BBB 評(píng)分，術(shù)前1 d 評(píng)分結(jié)果顯示所有大鼠的運(yùn)動(dòng)功能均能正常開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，術(shù)后1 d評(píng)分結(jié)果顯示，所有大鼠均未出現(xiàn)異常死亡情況，可常規(guī)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

2.1 BMSCs的形態(tài)觀察

在體外培養(yǎng)24 h后，觀察到部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞的大小和形狀以圓形居多，見(jiàn)圖1。培養(yǎng)4～5 d 后細(xì)胞壁的數(shù)量逐漸增多，且呈現(xiàn)出集落的增長(zhǎng)趨勢(shì)。培養(yǎng)10 d后，細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)出融合趨勢(shì)，且胰酶消化開(kāi)始出現(xiàn)傳代，傳至2 代之后，細(xì)胞呈現(xiàn)出單一均勻趨勢(shì)，與BMSCs 的生長(zhǎng)形態(tài)一致，見(jiàn)圖2。

圖1 體外培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞形態(tài)

圖2 體外培養(yǎng)10 d后的細(xì)胞形態(tài)

2.2 三組大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)情況

所有大鼠術(shù)前BBB 評(píng)分均為21 分，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組后肢得分正常，術(shù)后1 d 對(duì)照組及外泌體組BBB 得分均為0，大鼠下肢功能減退，以臥式拖動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)，但隨著時(shí)間的增加，大鼠的BBB 評(píng)分逐一恢復(fù)。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組大鼠BBB評(píng)分高于對(duì)照組和外泌體組，術(shù)后7、14、21、28 d外泌體組大鼠BBB 評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)斜板評(píng)分高于對(duì)照組及外泌體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分情況（±s）

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分情況（±s）

a 表示與同一時(shí)間段手術(shù)組比較，P＜0.05；b 表示與同一時(shí)間段對(duì)照組比較，P＜0.05。

項(xiàng)目術(shù)前1 d術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后21 d術(shù)后28 d手術(shù)組（n=26）21.00±0 19.80±0.75 20.30±0.67 20.90±0.33 21.00±0 21.00±0 21.00±0對(duì)照組（n=26）21.00±0 0±0a 0.90±0.87a 2.50±1.07a 6.90±0.98a 10.50±0.84a 12.50±1.07a外泌體組（n=26）21.00±0 0±0a 1.61±0.85a 6.30±0.94ab 12.70±1.58ab 16.60±1.07ab 17.01±0.68ab

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分情況（±s）

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分情況（±s）

a 表示與同一時(shí)間段手術(shù)組比較，P＜0.05；b 表示與同一時(shí)間段對(duì)照組比較，P＜0.05。

項(xiàng)目術(shù)前1 d術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后21 d術(shù)后28 d手術(shù)組（n=26）80.00±0 75.00±3.32 78.80±2.41 79.00±2.12 80.00±0 80.00±0 80.00±0對(duì)照組（n=26）80.00±0 29.00±3.15a 30.00±2.35a 34.00±3.15a 43.00±4.21a 49.00±4.58a 52.50±4.25a外泌體組（n=26）80.00±0 30.00±3.32a 32.50±3.55a 43.00±3.51ab 55.50±4.37ab 62.51±2.65ab 65.00±3.32ab

2.3 脊髓組織形態(tài)學(xué)變化

術(shù)后28 d，手術(shù)組的脊髓組織HE 染色體等均正常，神經(jīng)元數(shù)目減少。術(shù)后28 d 脊髓組織HE 染色，見(jiàn)圖3。手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，神經(jīng)纖維排列規(guī)整，細(xì)胞基質(zhì)較均勻，見(jiàn)圖4。對(duì)照組損傷區(qū)脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖5。外泌體組損傷區(qū)脊髓組織炎性浸潤(rùn)較少，組織較連續(xù)、結(jié)構(gòu)較清晰，見(jiàn)圖6。

圖3 術(shù)后28 d脊髓組織HE染色

圖4 手術(shù)組脊髓組織HE染色

圖5 對(duì)照組損傷區(qū)脊髓組織HE染色

圖6 外泌體組損傷區(qū)脊髓組織HE染色體損傷

3 討論

脊髓損傷是當(dāng)前臨床中較為常見(jiàn)的一種癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)完全性癱瘓、肢體功能喪失、大小便完全失禁等，增加患者的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類(lèi)多能干細(xì)胞，是目前臨床上最常用的一種干細(xì)胞，結(jié)合造血干細(xì)胞移植可以增加移植成功率，加快造血再生［8］。在大劑量的化療后，BMSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞一起注入，有利于患者的血液細(xì)胞恢復(fù)，而且副作用小、安全性高。有研究［10］表明，MSCs 相較于其他的細(xì)胞能夠分泌出更多的外泌體。

本研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)24 h后，觀察到部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞的大小和形狀以圓形居多。有研究［11-12］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)中使用CD9、CD63 進(jìn)行陽(yáng)性的檢驗(yàn)，最終得出的實(shí)驗(yàn)的提取物為MSCs，與本研究的結(jié)果一致。MSCs 外泌體是由MSC 分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡。Zhang等［13］的研究結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能抑制細(xì)胞因子、抑制NF-κBp65信號(hào)途徑，降低caspase-3、caspase-8、caspase-9 等細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)一直以來(lái)都是臨床重點(diǎn)關(guān)注的課題。本研究通過(guò)選擇大鼠實(shí)驗(yàn)為研究對(duì)象，采用脊髓打擊器的方式對(duì)大鼠進(jìn)行打擊并建構(gòu)模型，分析術(shù)后的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)打擊后，大鼠的各項(xiàng)下肢功能有喪失的情況，且BBB 評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分急劇下降，后續(xù)有恢復(fù)的情況，但整體的恢復(fù)無(wú)法達(dá)到打擊之前的狀態(tài)。且本研究中對(duì)照組及外泌體組的BBB評(píng)分低于手術(shù)組；外泌體組的BBB評(píng)分高于對(duì)照組；外泌體組術(shù)后各項(xiàng)斜板評(píng)分高于對(duì)照組，提示外泌體靜脈移植對(duì)脊髓損傷具有一定的恢復(fù)作用。本研究中術(shù)后28 d，手術(shù)組的脊髓組織HE 染色體等均正常，神經(jīng)元數(shù)目減少。分析其原因?yàn)?，通過(guò)外泌體靜脈移植BMSCs的外泌體可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入組織損害，并能攜帶生物信息進(jìn)行修復(fù)，而以滴鼻方式移植后6 h，可在大腦皮層、海馬等區(qū)域觀察到外泌體的存在［14］。

綜上所述，BMSC 外泌體靜脈移植對(duì)脊髓損傷有明顯的改善作用，可以提高患者的運(yùn)動(dòng)能力，減輕脊髓損傷，并能加速脊髓損傷的恢復(fù)。