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      氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的二氫吡啶

      2024-05-13 21:06:38劉文秋董寧孫瑩瑩
      中國標(biāo)準(zhǔn)化 2024年4期
      關(guān)鍵詞:二氫吡啶飼料

      劉文秋 董寧 孫瑩瑩

      摘 要:本文建立一種氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定飼料產(chǎn)品中二氫砒啶含量的方法。采用避光的環(huán)境,在飼料樣品中添加保護(hù)劑降低二氫砒啶的光化學(xué)反應(yīng),采用乙腈提取待測(cè)物,經(jīng)濃縮和固相微萃取凈化,采用BSTFA進(jìn)行衍生,衍生物通過GCMS氣化分離以及選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)二氫吡啶衍生物的電子轟擊(EI)質(zhì)譜碎片進(jìn)行解析,特征碎片離子(m/z)206、178、251、151、150、195為定性離子,206為定量離子。該分析方法中二氫吡啶在3~150 mg/kg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,樣品分析精密度RSD<3%,樣品中二氫吡啶的檢出限0.3 mg/kg。結(jié)果表明,這項(xiàng)方法靈敏、穩(wěn)定、可靠,有效避免了飼料中二氫吡啶在處理過程中的降解,并有效排除了主要雜質(zhì)的干擾,適用于飼料產(chǎn)品中二氫吡啶的定量分析與確證。

      關(guān)鍵詞:二氫吡啶,氣相色譜質(zhì)譜,避光,衍生,飼料

      DOI編碼:10.3969/j.issn.1002-5944.2024.04.035

      0 前 言

      二氫吡啶(diludine),化學(xué)名稱2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氫吡啶,添加于飼料中作為抗氧化劑及畜禽促生長劑,能顯著促進(jìn)家畜、家禽、魚、蝦、牛羊等動(dòng)物的生長,改善產(chǎn)肉、產(chǎn)蛋與繁殖性能[1]。《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003)規(guī)定每1000 kg牛飼料中可添加100~150 g二氫吡啶,每1000 kg種肉雞飼料中可添加150 g二氫吡啶[2]。畜禽類飼料主要以玉米、大豆餅、肉骨粉等為主,輔氨基酸等營養(yǎng)成分以及促生長劑、維生素等添加劑,配方設(shè)計(jì)多樣、組成成分復(fù)雜,給二氫吡啶的檢測(cè)帶來了非常嚴(yán)重的雜質(zhì)干擾。在現(xiàn)有研究中,二氫吡啶含量測(cè)定多采用紫外分光光度法、氣相色譜電子俘獲檢測(cè)器法、高效液相色譜法等檢測(cè)技術(shù)[3-4],不能區(qū)分目標(biāo)物與雜質(zhì),已不能滿足對(duì)二氫吡啶檢測(cè)的需求。

      另外,二氫吡啶中-N H-的給電子共軛效應(yīng)與-COOR的吸電子共軛效應(yīng),導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,光穩(wěn)定性較差。有研究表明,在自然光、漫射光、鎢燈光等光源下,二氫吡啶均會(huì)發(fā)生不同程度的光化學(xué)反應(yīng)[5],《中華人民共和國藥典》和《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003)都提出了“避光、密閉保存”“現(xiàn)混現(xiàn)喂”的規(guī)定。這一點(diǎn),筆者也通過試驗(yàn)證實(shí)了二氫吡啶含量持續(xù)下降的現(xiàn)象。如何在分離純化過程中保持二氫吡啶的穩(wěn)定性并有效降低基質(zhì)的干擾,是飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量測(cè)定的巨大難題和挑戰(zhàn)。

      本文對(duì)飼料中二氫吡啶檢測(cè)方法進(jìn)行研究,探討了基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法,通過避光操作和添加紫外線吸收劑、BSTFA衍生化等措施,著重提高方法的穩(wěn)定性;通過固相萃取凈化、質(zhì)譜分析等方式,解決飼料產(chǎn)品復(fù)雜的基質(zhì)干擾、準(zhǔn)確定性定量;方法的檢出限、準(zhǔn)確性能滿足飼料產(chǎn)品中二氫吡啶的含量測(cè)定,為飼料產(chǎn)品更科學(xué)準(zhǔn)確地管控質(zhì)量安全提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 試劑

      二氫吡啶(98.00%),TRC公司;N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,99%),Supelco公司;乙腈,色譜純。

      C 1 8 、P S A 吸附劑(c l e a n e r t ? P S A ,cleanert?C18):博納艾杰爾科技公司。

      紫外線吸收劑:4-甲基芐亞基樟腦、丁基甲氧基二苯甲?;淄?、苯基苯并咪唑磺酸、對(duì)氨基苯甲酸、甲氧基肉桂酸乙基己酯、對(duì)甲氧基肉桂酸異戊酯等,均為分析純。

      1.1.2 儀器和設(shè)備

      氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 5975C,配EI源):美國安捷倫公司。

      旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100):上海愛朗儀器公司。

      離心機(jī)(冷凍離心機(jī)L535R):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司。

      1.2 方法

      1.2.1 前處理方法

      稱取2 g(精確至0.001 g )飼料,加入2~3種紫外線吸收劑混合物0.2 g,混勻。加入40 mL乙腈,振蕩搖勻,超聲萃取5 min,加入1 g氯化鈉并劇烈振蕩,5000 r/min離心5 min,移取上清液。40 ℃減壓旋蒸至約1 mL,乙腈定容至2 mL。添加1 gPSA、無水硫酸鎂與C18的混合吸附劑粉末對(duì)定容液進(jìn)行凈化處理,高速振蕩1~3 min,渦旋后5000 r/min離心3 min。上清液過0.45 μm濾膜,取濾液50 uL,加入100 uL BSTFA,80 ℃加熱20 min,冷卻后供上機(jī)分析。

      前處理全程均采用棕色器皿并避光操作。采用遮光窗簾阻擋室外陽光,操作時(shí)關(guān)閉實(shí)驗(yàn)臺(tái)近處燈光,盡可能減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境的光照強(qiáng)度和光照時(shí)長。

      1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件

      色譜柱:DB-5 ms,30 m×0.25 um×0.25 mm;進(jìn)樣口溫度:260 ℃;載氣流速:1 mL/min;分流比:50∶1;色譜柱升溫程序見表1;離子源溫度:150℃;SCAN模式、SIM模式、定性離子、定量離子等參數(shù)見表2;二氫吡啶衍生化物結(jié)構(gòu)圖見圖1。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 光線對(duì)穩(wěn)定性的影響

      比較了10 ug/mL未衍生標(biāo)準(zhǔn)溶液在正常光線條件下,每1 h測(cè)定一次的響應(yīng)值(見圖2),結(jié)果表明響應(yīng)值隨著時(shí)間的推移整體呈下降趨勢(shì),5 h內(nèi)連續(xù)下降了近30%。

      2.2 添加紫外線吸收劑與衍生化對(duì)穩(wěn)定性的影響

      在2 g樣品中添加200 μg二氫砒啶,加入4-甲基芐亞基樟腦、甲氧基肉桂酸乙基己酯各0.1 g,混勻后進(jìn)行前處理并采用BSTFA衍生化,待測(cè)溶液每1 h測(cè)定一次(圖3)。結(jié)果表明在本試驗(yàn)的光照和GCMS加熱條件下,待測(cè)物響應(yīng)值基本一致,波動(dòng)較小,穩(wěn)定性良好。

      2.3 衍生化條件的優(yōu)化

      2.3.1 待測(cè)溶液是否氮吹至干的比較

      在衍生溫度、時(shí)間、BSTFA用量一致的情況下,比較了待測(cè)溶液經(jīng)氮吹至干后加BSTFA(A)與待測(cè)溶液不經(jīng)氮吹直接加BSTFA(B)兩種方式下,50 μg/mL二氫吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值變化(圖4)。結(jié)果表明,兩種情況下響應(yīng)值沒有明顯變化,氮吹對(duì)衍生化效率影響較小,為了減少目標(biāo)物損失的機(jī)會(huì)以及提高操作效率,因此采用待測(cè)溶液不經(jīng)氮吹的方式。

      2.3.2 衍生化時(shí)間的優(yōu)化

      在衍生化溫度、BSTFA用量一致的情況下,比較了50 μg/mL待測(cè)溶液分別加熱10 min、20 min、30 min、60min后的響應(yīng)值變化(見圖5)。結(jié)果表明衍生化產(chǎn)物隨著時(shí)間的增加而上升,20 min的響應(yīng)值最高,時(shí)間增加響應(yīng)值下降,因此選擇衍生化時(shí)間為20 min。

      2.4 方法標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線、檢出限

      本文方法中二氫吡啶的檢出限為0.3 mg/kg(SN>3),線性范圍為3~150 mg/kg,定量限為3 mg/kg(SN>10),詳見表3。方法中目標(biāo)物的峰形及分離度均良好,有效排除了樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。二氫吡啶衍生物的色譜圖見圖6,特征離子質(zhì)譜圖見圖7。

      2.5 方法準(zhǔn)確度

      以配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料為例,稱取2 g樣品,分別添加100 mg/L的二氫吡啶標(biāo)液溶液0.2 mL、0.4 mL、2 mL,制備3個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品,每個(gè)水平制備3個(gè)平行樣,按前處理方法處理后上機(jī)測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表4。結(jié)果表明,二氫吡啶的回收率在84.7%~92.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%~2.66%,滿足配合飼料、預(yù)混合飼料、濃縮飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量的分析測(cè)定要求。

      3 結(jié) 論

      本研究開發(fā)了飼料中二氫砒啶的GCMS外標(biāo)定量檢測(cè)方法,結(jié)果顯示在避光環(huán)境下,飼料樣品中加入紫外線吸收劑,用乙腈溶液提取,在40℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮定容,經(jīng)C18、PSA固相微萃取吸附劑凈化后,凈化液與BSTFA于80 ℃衍生20 min,即可得到80%以上的回收率,排除了飼料產(chǎn)品中主要雜質(zhì)的干擾。方法的檢出限、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性均能滿足飼料產(chǎn)品中二氫吡啶含量的分析測(cè)試要求,同時(shí)有效解決了二氫吡啶在處理過程中的降解問題。

      參考文獻(xiàn)

      [1]王彥波.多功能飼料添加劑二氫吡啶的研究進(jìn)展[J].飼料博覽,2005,12(6):35-37.

      [2]獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2003年版).中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第307號(hào)公告附件[Z].2003.

      [3]金甌,鄭之詹,郭慧. HPLC法測(cè)定二氫吡啶的含量[J].飼料研究,2007,12(12):24-25.

      [4]ODYNETS A G, PARINOVV V Y , KIMENIS A A , e tal. Metabolism of diludine in experimental animals[J].Pharmaceutical Chemistry Journal, 1986, 20(4): 243-246.

      [5]梅其炳,商澎,趙德化.五種二氫吡啶光穩(wěn)定性比較[J].中國藥學(xué)雜志,1998,33(5):291-294.

      作者簡介

      劉文秋,本科,工程師,標(biāo)準(zhǔn)中心主任,研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析方法及標(biāo)準(zhǔn)化。

      董寧,博士研究生,高級(jí)工程師,研發(fā)經(jīng)理,研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析方法及專利。

      孫瑩瑩,博士研究生,高級(jí)工程師,技術(shù)研發(fā)中心主任,研究方向?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)分析技術(shù)及自動(dòng)化設(shè)備應(yīng)用。

      (責(zé)任編輯:張佩玉)

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