十二烷基苯磺酸鈉暴露對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)胚胎發(fā)育毒性和仔魚神經(jīng)毒性的影響

田海軍,姜漢軍,任勝杰,楊治國

(1.信陽農(nóng)林學院水產(chǎn)學院,河南 信陽 464000;2.浙江淡水水產(chǎn)研究所,浙江 湖州 313001)

表面活性劑被廣泛應用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中,可顯著改變表(界)面的物理化學性質(zhì),具有潤濕、乳化、起泡以及增溶、分散、洗滌、防腐、抗靜電等多項功能[1]。據(jù)中國洗滌用品工業(yè)協(xié)會統(tǒng)計預測,2022年我國表面活性劑市場總量達461.5萬 t,預計未來幾年內(nèi)將呈現(xiàn)增長的發(fā)展態(tài)勢[2]。表面活性劑中陰離子型占比最多,約占65%～80%[2]。陰離子型表面活性劑統(tǒng)稱直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS),國內(nèi)檢出頻率較高的是十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate,SDBS)[3]。此外,水體陰離子表面活性劑相關分析方法中使用的參考標準物質(zhì)也均為SDBS。

陰離子表面活性劑隨著工農(nóng)業(yè)和生活污水進入水環(huán)境中,在水面形成泡沫,會破壞水體溶解氧的動態(tài)平衡,造成水質(zhì)惡化,影響水生生物的生長。GB 3097—1997《國家海水水質(zhì)標準》規(guī)定:1類海水中ρ(LAS)≤0.03 mg·L-1,2～4類海水中ρ(LAS)≤0.1 mg·L-1。GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》規(guī)定ρ(LAS) ≤ 0.20 mg·L-1。

諸多學者開展了表面活性劑對水生生物毒性研究,水體SDBS的毒性研究對象有凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[4]、安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)[5]、黃河鯉(Cyprinuscarpio)[6]、褐點石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)[7]、刺參(Apostichopusjaponicus)[8]、雙小核草履蟲(Parameciumprimaurelia)[9]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[10]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)[11]和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[12]等。上述研究集中在急性毒性及生理生化影響方面,有關環(huán)境相關濃度下SDBS對魚類的亞急性毒性效應尤其是神經(jīng)毒性方面的研究尚鮮見報道。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)肉質(zhì)鮮美,是我國的特種經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一。環(huán)境問題嚴重制約了黃顙魚養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展,如水污染等給黃顙魚養(yǎng)殖帶來嚴重影響[13-14],急需加強水環(huán)境污染物對黃顙魚影響的機理研究。當前尚未有SDBS對黃顙魚毒性的相關研究報道。黃顙魚作為毒理學實驗材料,具有繁殖技術成熟、胚胎發(fā)育觀察容易、全基因組測序已完成、便于開展分子毒理學研究等優(yōu)點。

水環(huán)境暴露能更真實地反映SDBS等陰離子表面活性劑在實際環(huán)境中的暴露影響情況,有利于科學評估陰離子表面活性劑的水環(huán)境生態(tài)風險。為評估水體SDBS濃度對黃顙魚早期發(fā)育階段的胚胎發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性的影響,筆者探討了不同SDBS濃度暴露下黃顙魚胚胎的孵化死亡率和畸形率,檢測了仔魚腦組織的乙酰膽堿酯酶活性及相關基因的轉錄水平以及5-羥色胺含量及相關基因的轉錄水平,探討其神經(jīng)毒性的潛在機制,為進一步評估水體陰離子表面活性劑污染對水生動物的毒性作用機制提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用黃顙魚親本來自武漢市水產(chǎn)科學研究所,親本雌雄比例為1∶1,雌魚體長(171.3±9.0)mm,體重(101.4±16.5)g;雄魚體長(242.1±11.6)mm,體重(193.4±19.6)g。親本共300尾在學院實訓基地水泥池中流水加曝氣方式培育,設棕櫚產(chǎn)卵巢,半球形(直徑25 cm,深12 cm);培育水溫(24.5±0.3)℃,pH值 為7.0～7.5,ρ(DO)為6.70～9.50 mg·L-1;光暗周期為12 h∶12 h,每日投喂 2 次黃顙魚專用飼料。黃顙魚產(chǎn)卵后收集并清洗受精胚胎,置于培養(yǎng)箱中,溫度設置為(24.5±0.3)℃,于 4 h 后置于顯微鏡下挑除死亡胚胎,選取正常發(fā)育受精胚胎,分組暴露于不同濃度的SDBS溶液中。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:SDBS為分析純(國藥集團河南化學試劑有限公司),乙酰膽堿酯酶(AChE)和5-羥色胺(5-HT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

儀器:體式顯微鏡(Olympus-SZ61,日本奧林巴斯),全自動樣品冷凍研磨儀(JXFSTPRP-64L,上海凈信),高速冷凍離心機(Eppendorf 5424R,德國艾本德),酶標儀(DR200-BC,無錫德朗),熒光定量PCR儀(CFX-96,美國Bio-Rad)。

1.3 胚胎及仔魚暴露實驗

隨機挑選受精 4 h 后發(fā)育正常、大小相近的黃顙魚胚胎進行染毒暴露實驗。參考GB 3838—2002規(guī)定,結合課題組前期測定SDBS對黃河鯉急性毒性和生理生化指標的影響[6]以及淮河上游大型水庫水樣中陰離子表面活性劑濃度部分斷面超標(0.3～0.8 mg·L-1)的實際現(xiàn)狀,確定 0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1作為實驗暴露質(zhì)量濃度(配制SDBS溶液的水質(zhì)為超純水,實測質(zhì)量濃度分別為0、0.19、0.38、0.58、0.77 mg·L-1,后面統(tǒng)一為設計暴露濃度),間隔 24 h更換新配制的暴露溶液,以保證濃度恒定。設置 3 組平行,暴露實驗容器采用 12孔細胞培養(yǎng)板,每孔放置 30 枚胚胎,暴露溶液每 24 h 更換1次,保證各組濃度保持不變。暴露期間水溫保持(24.5±0.3)℃,光暗周期設置為 12 h∶12 h。及時挑出死亡胚胎以防對其他胚胎造成污染,并統(tǒng)計胚胎孵化累計死亡率和畸形率(畸形胚胎數(shù)/孵化脫膜胚胎總數(shù)×100%),胚胎發(fā)育中如出現(xiàn)卵黃異常、腦和脊髓分化異常、體彎曲、心包異常等現(xiàn)象均統(tǒng)計為胚胎畸形。暴露至孵化出5日齡仔魚停止。

1.4 神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿酯(AChE)酶活性和5羥色胺(5-HT)含量

每個暴露組隨機取6尾5日齡正常仔魚的腦組織混樣。另外,每個暴露組采集全部的5日齡成活畸形仔魚腦組織進行混樣,共30個生物學重復。用去離子水清洗 2～3 次,加入0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液 300 μL,置于 2.5 mL離心管內(nèi) 4 ℃勻漿 400 s,加入 700 μL磷酸鹽緩沖溶液進行清洗轉移。4 ℃下 2 500 r·min-1離心 10 min(離心半徑為13.5 cm),取上清液待測AChE酶活性和5-HT含量。在酶標儀上測定吸光度值,記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.5 熒光定量 PCR 檢測相關基因的相對表達量

每個暴露組取10尾5日齡仔魚腦組織混樣作為一個重復,共3個生物學重復,液氮速凍后儲存在-80 ℃冰箱中以進行基因表達分析。置于冰上勻漿,用 TRIzol 試劑抽提總RNA,逆轉錄為 cDNA,引物序列見表 1。PCR 反應程序設定如下:cDNA 模板2.0 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL,熒光預混液12.5 μL,雙蒸水8.5 μL,95 ℃ 預變性3 min,95 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃ 延伸20 s(循環(huán)40 次),72 ℃最終延伸5～10 min。設定對照組仔魚的乙酰膽堿酯酶基因(ache)、5羥色胺基因(5-ht)的 mRNA 相對表達量為1.00,結果采用2-ΔΔCt相對表達量算法確定 mRNA 的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 26.0軟件進行,統(tǒng)計學差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯檢驗(Duncan′s test)比較,檢驗時需驗證數(shù)據(jù)的方差齊性(方差不齊時可采用Welch ANOVA或Brown-Forsythe ANOVA進行分析),P<0.05表示有顯著性差異。

表1 神經(jīng)遞質(zhì)相關基因熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 胚胎孵化累計死亡率與畸形率變化

如圖1所示,與對照相比,不同暴露濃度下黃顙魚胚胎孵化死亡率和胚胎畸形率分別提高7.8～23.4和4.5～14.5百分點,均呈顯著上升趨勢(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標差異顯著(P<0.05)。

如圖2所示,顯微鏡(4×10倍)觀察發(fā)現(xiàn),暴露處理后黃顙魚胚胎存在著心包水腫(心臟異常)、卵黃水腫、身體卷曲、脊椎彎曲、頭部畸形等現(xiàn)象。

a—心包水腫,b—卵黃水腫,c—身體卷曲,d—脊椎彎曲,e—頭部畸形。

2.2 神經(jīng)遞質(zhì)AChE酶活性和5-HT含量變化

如圖3所示,伴隨著暴露濃度的升高,黃顙魚仔魚腦組織AChE酶活性和5-HT含量呈下降趨勢,均顯著低于對照(P<0.05)。與對照相比,各劑量暴露組正常仔和畸形仔魚腦組織AChE酶活性分別顯著降低12.0%～50.5%和15.0%～53.9%(P<0.05),5-HT含量分別顯著降低2.6%～9.9%和3.0%～11.1%(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標差異顯著(P<0.05)。

2.3 腦組織ache和5-ht基因mRNA相對表達量變化

如圖4所示,不同暴露濃度下仔魚腦組織ache和5-ht基因相對表達量隨SDBS暴露濃度的升高而下降。與對照相比,ache基因mRNA轉錄水平在高濃度暴露組(0.8 mg·L-1)中被顯著抑制(P<0.05),5-ht基因mRNA轉錄水平在0.4～0.8 mg·L-1濃度暴露組中被顯著抑制(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同暴露濃度間某指標差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 SDBS暴露處理對黃顙魚胚胎影響及細胞毒性機制

SDBS暴露處理的黃顙魚胚胎孵化畸形率提高了4.5～14.5百分點(P<0.05),死亡率提高了7.8～23.4百分點(P<0.05)。與葉遼遼等[12]測得ρ(SDBS)≥ 2.5 mg·L-1時大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)胚胎孵化率下降、畸形率上升有一定差異。上述結果證實SDBS暴露會導致胚胎孵化率下降和畸形率上升,但是效應濃度不同可能是不同魚種的敏感性及孵化水溫差異等因素導致。分析其胚胎發(fā)育毒性的原因,可能是SDBS與細胞膜表面疏水部分結合,破壞了胚胎細胞膜結構[15]。另外,由于SDBS暴露時會形成泡沫,可能導致水體溶解氧濃度下降,間接造成胚胎發(fā)育影響。同時,SDBS能通過抑制機體的抗氧化作用從而造成細胞遺傳物質(zhì)的損傷,影響DNA轉錄與表達等[16]。鄭璐[17]研究發(fā)現(xiàn),6種表面活性劑均能引起細胞質(zhì)粒pBR322的DNA損傷,分析其原因為表面活性劑與細胞質(zhì)粒DNA直接結合導致。在這6種表面活性劑中磺酸型表面活性劑誘導細胞DNA損傷的毒性較強,推測其具有一定的遺傳毒性?？讕沎18]研究了陰離子表面活性劑導致細胞毒性的完整過程,通過熒光顯微鏡在線觀察到HPTS-Cn陰離子熒光表面活性劑首先與人皮膚成纖維細胞(HF)、人肝癌細胞系(HepG2)和人肝星形細胞(LX-2)細胞膜結合,隨后進入細胞并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹;同時,還觀察到了細胞骨架的破壞、隧道納米管(TNTs)的斷裂以及囊泡的產(chǎn)生。吳光潔[19]研究發(fā)現(xiàn),隨著十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露濃度的增加,鯉魚肝細胞損傷逐漸加重,出現(xiàn)肝細胞空化、核遷移、核溶解、肝血竇擴張充血等現(xiàn)象。以上研究初步探討了陰離子表面活性劑對細胞的毒性影響,但具體的細胞毒性機制需要更進一步的研究。

3.2 SDBS暴露處理對黃顙魚神經(jīng)毒性及機制

ACh和5-HT是神經(jīng)元間重要的信息傳遞物質(zhì),其含量水平與黃顙魚的各項生理活動密切相關。測定黃顙魚腦組織中能夠調(diào)節(jié)ACh信息傳遞活動的AChE酶活性來作為神經(jīng)行為變化的進一步證據(jù)。AChE酶能夠降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,與神經(jīng)傳導密切相關,對黃顙魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育至關重要,是常被用于評估神經(jīng)毒性的生理學指標之一[20]。當AChE酶活性受到抑制時會導致乙酰膽堿在突觸和神經(jīng)肌肉接頭處過度積累,進一步影響正常的神經(jīng)傳遞進程。實驗結果表明,經(jīng)過十二烷基苯磺酸鈉暴露后,黃顙魚仔魚腦組織中AChE酶活性顯著下降,ache基因的mRNA表達水平也下調(diào),表明SDBS暴露可能抑制了黃顙魚仔魚AChE酶的合成和表達,妨礙了膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的正常運作。吳光潔[19]研究發(fā)現(xiàn),鯉(Cyprinuscarpio)腦AChE酶活性隨著十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露濃度的升高而降低。金葉飛[21]研究發(fā)現(xiàn),在亞急性濃度的十二烷基苯磺酸鈉暴露14 d,隨著暴露濃度的增加,鯽(Carassiusauratus)魚腦組織的AChE酶活性被顯著抑制(P<0.05)。張江慧[22]研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4和8 mg·L-1的水體十二烷基苯磺酸異丙胺鹽暴露對異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)腦AChE酶活性產(chǎn)生波動影響。 GUIHERMINO等[22]對十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉等表面活性劑的研究中發(fā)現(xiàn),無論是體內(nèi)試驗還是體外試驗,這些表面活性劑均會明顯抑制AChE酶活性。表面活性劑抑制AChE酶活性的原因可能是它改變了蛋白質(zhì)表面的電荷,從而改變了酶在溶液中的性質(zhì),使得酶活性下降[22]。體外試驗觀測到表面活性劑影響AChE酶活性的最低質(zhì)量濃度分別為12.5～100 mg·L-1,而體內(nèi)試驗的最低質(zhì)量濃度分別為2～11.9 mg·L-1,這些數(shù)值與受污染的地表水中表面活性劑的質(zhì)量濃度(0.5～10 mg·L-1)基本相當[23-25]。

課題組還測定了黃顙魚腦組織中5-HT含量和5-ht基因的mRNA轉錄水平來進一步研究SDBS誘導神經(jīng)毒性分子的機制。其中,暴露后仔魚腦組織中5-HT含量顯著下降,相關基因的mRNA轉錄水平也下調(diào)。大量研究證實,5-HT是脊椎動物調(diào)劑運動輸出的重要神經(jīng)遞質(zhì)[26-27]。進一步研究表明,5-HT還可以與多巴胺、γ-氨基丁酸和谷氨酸等其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相互作用,共同調(diào)節(jié)學習和記憶能力、高水平的認知能力以及恢復認知功能等[26-27]。該研究中5-ht基因的轉錄水平下調(diào)提示,亞急性SDBS的暴露可能通過干擾5-ht基因的轉錄水平影響黃顙魚的神經(jīng)系統(tǒng)。

3.3 SDBS暴露胚胎發(fā)育毒性與仔魚神經(jīng)毒性之間的聯(lián)系

SDBS暴露處理后黃顙魚胚胎孵化畸形率和死亡率均顯著提高。造成胚胎發(fā)育毒性的原因可能有3個方面:一是SDBS與細胞膜表面疏水部分結合,破壞了胚胎細胞膜結構[15];二是SDBS暴露形成泡沫,導致水體溶解氧濃度下降,對胚胎發(fā)育造成影響;三是SDBS能通過抑制機體的抗氧化作用從而造成細胞遺傳物質(zhì)的損傷,影響DNA轉錄與表達等[16]。魚類的胚胎畸形多發(fā)生于神經(jīng)胚期,此時神經(jīng)管的正常發(fā)育和分化是器官發(fā)生的基礎,胚胎處于神經(jīng)胚時期對外界刺激最為敏感[28-30]。推測SDBS暴露處理對胚胎神經(jīng)管發(fā)育產(chǎn)生影響,造成其不能正常分化為腦和脊髓,后期會形成仔魚的頭部畸形和脊椎畸形;在孵化Ⅰ期的畸形胚胎表現(xiàn)為弓背或彎尾、卵黃囊膨大等現(xiàn)象,各種畸形胚胎在發(fā)育進程中逐步死亡。實驗發(fā)現(xiàn)暴露處理后黃顙魚胚胎存在著心包水腫(心臟異常)、卵黃水腫、身體卷曲、脊椎彎曲、頭部畸形等現(xiàn)象,這些畸形可能和神經(jīng)管發(fā)育分化成器官時遭受到SDBS暴露引起的胚胎神經(jīng)毒性有關。

4 結論

綜上所述,SDBS暴露顯著提高了黃顙魚胚胎孵化的死亡率和畸形率,SDBS通過抑制AChE酶活性和5-HT含量影響神經(jīng)傳導,抑制神經(jīng)遞質(zhì)相關基因表達,從而對黃顙魚產(chǎn)生胚胎發(fā)育毒性及神經(jīng)毒性作用。