超聲波、微波預(yù)處理對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合能力、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響

門德盈，王增麗，項(xiàng)全燕，陶 亮,2,3,*，代佳和,2,3，劉俐彤，田 洋,2,3,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與個(gè)性化食品制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

鈣是人體內(nèi)一種含量最豐富的必需微量礦物元素（占體質(zhì)量的1.5%～2.0%），人體骨骼系統(tǒng)中98%的成分為鈣元素，人體中鈣的攝入主要通過膳食提供[1-2]。鈣不僅是人體的重要組成成分，同時(shí)對(duì)人體健康具有重要的調(diào)控作用，如對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)、肌肉收縮、骨骼發(fā)育等生理活動(dòng)均具有一定影響[3]。但日常生活中許多因素會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)鈣缺乏癥，如飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境、生活習(xí)慣等[4]。目前，鈣缺乏癥是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問題，特別是在發(fā)展中國(guó)家[5]。人體最初的鈣缺乏是無癥狀的，對(duì)人們的生活影響較小，極易被忽視[6]。長(zhǎng)期鈣缺乏會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂病和骨軟化癥等不可逆轉(zhuǎn)的健康損害[7]。為減少鈣缺乏對(duì)人體造成的危害，市場(chǎng)上早已出現(xiàn)無機(jī)鈣、有機(jī)酸鈣、氨基酸鈣等補(bǔ)鈣產(chǎn)品[8]，但產(chǎn)品存在鈣生物利用度低，穩(wěn)定性差，胃腸道副作用大（便秘、脹氣、腸胃氣脹和腹脹）等弊端，越來越不被消費(fèi)者接受[9]。肽鈣螯合物作為新一代補(bǔ)鈣產(chǎn)品具有良好的溶解性，可以防止鈣沉淀，促進(jìn)鈣吸收[10]。目前，已有許多食品源蛋白肽與鈣結(jié)合促進(jìn)鈣吸收的研究，例如酪蛋白磷酸肽[11]、鹽鴨蛋清肽[12]、豬骨膠原肽[13]等。這些肽大部分來源于動(dòng)物性和奶制品原料，但素食者及對(duì)乳品不耐受人群更傾向于植物源蛋白肽。同時(shí)，植物蛋白具有來源廣泛、成本低、性能好等優(yōu)點(diǎn)[14]，部分研究者也已開始關(guān)注植物源蛋白肽，如大豆肽、谷物副產(chǎn)物肽均與Ca2+具有較好的螯合能力[15]。

核桃（Juglans regiaL.）作為世界四大干果之一，含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，且在抗骨質(zhì)疏松、降血壓、益智等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[16]，是一種食藥兼用的堅(jiān)果。核桃油是核桃加工的主要產(chǎn)品，榨油后會(huì)產(chǎn)生大量的核桃粕資源，目前核桃粕主要作為廢物處理或者加工成飼料，造成了一定的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，但核桃粕中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，尤其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)40%以上[17]，含有18 種氨基酸，包括8 種人體必需氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。研究發(fā)現(xiàn)，核桃粕中蛋白質(zhì)以谷蛋白為主，其溶解性較差，經(jīng)堿性蛋白酶水解制備的核桃粕蛋白肽其溶解性得到顯著提高[18]，是一種高效結(jié)合鈣離子的植物源蛋白肽。

超聲波是一種頻率高于20 kHz的聲波[19]，是一種安全、綠色無污染的技術(shù)，在食品加工中得到廣泛應(yīng)用[20]。超聲波技術(shù)的特殊效應(yīng)（空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)）具有輔助提取、加速反應(yīng)、改變蛋白質(zhì)分子特性等優(yōu)勢(shì)[21-22]。微波是一種電磁波，其頻率為300 MHz～300 GHz，可以在高頻條件下隨外部電場(chǎng)引起水極性取向的變化，從而進(jìn)一步引起分子運(yùn)動(dòng)和相互摩擦，對(duì)物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成一定的影響[23]。超聲波和微波會(huì)影響到肽的折疊動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致天然折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)一步影響肽的物化特性及產(chǎn)品應(yīng)用[24-25]。目前，將超聲波和微波技術(shù)運(yùn)用到肽與金屬離子螯合中的研究較少。本實(shí)驗(yàn)基于超聲波、微波對(duì)核桃粕蛋白肽進(jìn)行預(yù)處理，并通過紫外-可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、X射線衍射光譜對(duì)肽鈣螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表證，分析不同預(yù)處理對(duì)肽鈣螯合能力及結(jié)合位點(diǎn)的影響。通過pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和胃腸道消化確定核桃粕蛋白肽鈣螯合物的穩(wěn)定性，旨在探索超聲波、微波技術(shù)對(duì)核桃粕蛋白肽的影響及其螯合物的變化，為新型植物源蛋白肽鈣新產(chǎn)品的研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃粕蛋白肽選購(gòu)于中食都慶生物技術(shù)有限公司，分子質(zhì)量為180～1 000 Da，純度為95%。

無水氯化鈣 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸重慶川東化工有限公司；氫氧化鈉 天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸 晟發(fā)生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；鈣含量顯色檢測(cè)試劑盒 Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE超聲波設(shè)備 昆山市超聲儀器有限公司；M1-L213B微波設(shè)備 廣東美的廚房電器制造有限公司；HWS24恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；LC-4014離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；EPOCH2酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；UV-3600i Plus紫外-可見近紅外漫反射儀器 日本島津公司；FLS1000穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；D8 ADVANCE X射線衍射儀、Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司；204F1熱重分析儀 德國(guó)耐馳公司；FE28 pH酸度計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波、微波處理核桃粕蛋白肽及肽鈣螯合物的制備

核桃粕蛋白肽凍干粉溶于300 mL超純水中，形成10 mg/mL的核桃粕蛋白肽溶液。向核桃粕蛋白肽溶液中加入肽鈣質(zhì)量比為1∶5的CaCl2，形成pH值為7.0的混合溶液。利用超聲波設(shè)備和微波設(shè)備，超聲波（120、240、360、480 W）、微波（280、420、560、700 W）分別處理混合溶液5 min。處理后的混合溶液放置在55 ℃的恒溫水浴鍋中水浴60 min。螯合反應(yīng)后，利用離心機(jī)將混合溶液離心（4 000 r/min）20 min，棄去不溶物質(zhì)。隨后加入無水乙醇（溶液體積的6 倍），靜置20 min，以相同的離心條件進(jìn)行離心，收集沉淀物即核桃蛋白肽鈣螯合物（簡(jiǎn)稱螯合物）。保留上清液測(cè)定其鈣質(zhì)量濃度，計(jì)算肽鈣螯合率。

1.3.2 肽鈣螯合率的測(cè)定

利用Liao Wanwen等[26]的方法測(cè)定螯合率（鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法），并稍作修改。使用鈣含量顯色檢測(cè)試劑盒，按其要求配制鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液。在96 孔板中每孔先后加入50 μL鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液和150 μL檢測(cè)工作液，混勻。室溫避光孵育10 min。使用酶標(biāo)儀在575 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝1.576 4x+0.040 7（R2＝0.999）。測(cè)定樣品時(shí)，取1.3.1節(jié)中所述上清液1 mL，用超純水定容至100 mL，形成稀釋液，同上述步驟測(cè)定上清液鈣質(zhì)量濃度。螯合率的計(jì)算如式（1）所示：

式中：C1為混合物中的鈣質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C2為每孔樣品稀釋液中的鈣質(zhì)量濃度/（mg/mL）；n為稀釋倍數(shù)（100）。

1.3.3 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 紫外-可見吸收光譜測(cè)試

將未處理的核桃粕蛋白肽鈣螯合物（WPP-Ca）、超聲波處理核桃粕蛋白肽鈣螯合物（UP-WPP-Ca）和微波處理核桃粕蛋白肽鈣螯合物（MP-WPP-Ca）溶解在超純水中，形成0.1 mg/mL的肽鈣螯合物溶液。先用超純水對(duì)紫外-可見光譜儀進(jìn)行空白校正。校正完成后，將溶液在250～500 nm范圍內(nèi)安全掃描。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜測(cè)試

2 mg的WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca在200 mg溴化鉀中分別研磨并混勻。混勻樣品壓制成1 mm厚的透明薄片，放入傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。以分辨率為4.0 cm-1在4 000～400 cm-1掃描32 次。

1.3.3.3 熒光光譜測(cè)試

WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca粉末樣品經(jīng)研磨后溶解在超純水中，制備成3 mg/mL的溶液。溶液在發(fā)射波長(zhǎng)范圍為250～500 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.4 X射線衍射光譜測(cè)試

5 mg的WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca粉末樣品均勻研磨。樣品在X射線衍射儀中進(jìn)行測(cè)量。掃描角度（2θ）范圍為5°～90°，掃描速率為2 °/min。

1.3.4 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的穩(wěn)定性研究

1.3.4.1 pH值對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合物的影響

50.0mg的核桃粕蛋白肽鈣螯合物溶解于超純水中配成1.0 mg/mL的溶液。分別用1.0 mol/L的HCl和NaOH溶液，調(diào)節(jié)不同處理的樣品溶液pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，得到不同pH值組別樣品。不同pH值的樣品溶液在37 ℃恒溫水浴鍋中放置60 min。恒溫加熱后，加熱溶液在冰水浴冷卻至20 ℃，4 000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，超純水定容至50 mL，測(cè)定鈣離子質(zhì)量濃度。鈣離子質(zhì)量濃度的測(cè)定方法和1.3.2節(jié)中所提到的一致。最后用鈣離子保留率表示核桃粕蛋白肽鈣螯合物的pH值穩(wěn)定性，計(jì)算如式（2）所示：

式中：C3為核桃粕蛋白肽鈣螯合物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C4為上清液鈣離子質(zhì)量濃度/（mg/mL）；P為稀釋倍數(shù)（50）。

1.3.4.2 溫度對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合物的影響

參照Ke Hongling等[27]報(bào)道的方法進(jìn)行熱重分析，分析溫度對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合物的影響。3.0 mg的核桃粕蛋白肽鈣螯合物放置在坩堝中。利用熱重分析儀在25～900 ℃范圍內(nèi)以10 ℃/min進(jìn)行升溫測(cè)試，N2流速控制在30 mL/min。記錄樣品質(zhì)量變化，計(jì)算并繪制質(zhì)量損失率曲線。

1.3.4.3 體外消化對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合物的影響

采用Minekus等[28]報(bào)道的方法進(jìn)行體外胃腸道消化模擬，并稍作修改。配制螯合物與0.9%生理鹽水溶液比為1∶150（mg/mL）的樣品溶液。在樣品溶液中加入0.5 mL鹽酸溶液（1.0 mol/L）和160 mg胃蛋白酶，形成pH 2.0的消化液。消化液在37 ℃避光攪拌并且每隔30 min取出1 mL樣液，補(bǔ)充1 mL的新鮮反應(yīng)液，消化時(shí)間為2 h。胃液消化2 h后，向消化液中向加入11 mL NaHCO3溶液（0.5 mol/L）形成pH值為7.5的腸消化液。在此條件下添加18 mL的混合溶液（0.1 g/mL胰蛋白酶溶液與12 mg/mL膽酸鹽溶液體積比為2∶1），37 ℃避光攪拌。反應(yīng)進(jìn)行2 h，操作方法與模擬胃消化過程一致。消化結(jié)束后，腸消化液在100 ℃的條件下加熱10 min使酶失活，以終止消化。取上清液測(cè)定其鈣含量。基于鈣離子保留率評(píng)估核桃粕蛋白肽鈣螯合物的穩(wěn)定性，計(jì)算公式如1.3.4.1節(jié)所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲波、微波功率對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合率的影響

不同超聲波功率處理的核桃粕蛋白肽與鈣離子螯合率的結(jié)果如圖1A所示。在超聲波功率0～480 W范圍內(nèi)，螯合率隨超聲波功率增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)超聲波功率在240 W時(shí)，UP-WPP-Ca的螯合率達(dá)到最大值（（86.11±0.15）%），較WPP-Ca（（74.04±0.17）%）有所提升，表明超聲波預(yù)處理促進(jìn)了核桃粕蛋白肽與Ca2+的螯合，且在240 W時(shí)鈣螯合能力最強(qiáng)。原因可能是隨著超聲波功率增加，超聲波對(duì)核桃粕蛋白肽產(chǎn)生更多的空化、剪切和熱效應(yīng)，影響了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使肽暴露出更多的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[29-30]。同時(shí)超聲波促進(jìn)了Ca2+的均勻分散[31]，提高了核桃粕蛋白肽與Ca2+結(jié)合效率。但當(dāng)超聲波功率超過240 W時(shí)，超聲波的作用力使多肽結(jié)構(gòu)遭到破壞，不溶性多肽增加，肽與Ca2+結(jié)合能力下降[32]。不同微波功率處理的核桃粕蛋白肽與鈣離子螯合率的結(jié)果如圖1B所示。在微波功率0～700 W之間，螯合率隨著微波功率增大呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)微波功率在560 W時(shí)，MP-WPP-Ca的螯合率達(dá)到最大值（（77.69±0.30）%），較WPP-Ca的螯合率有所提升，表明微波處理后的核桃粕蛋白肽鈣螯合物具有較高的鈣螯合能力，且在560 W時(shí)鈣螯合能力最強(qiáng)。螯合能力提高的原因可能是微波使核桃粕蛋白肽在微波場(chǎng)的作用下進(jìn)行有規(guī)則的熱運(yùn)動(dòng)[33]，使核桃粕蛋白肽的表面具有更多可以與Ca2+結(jié)合的活性位點(diǎn)。但是當(dāng)微波功率超過560 W時(shí)，高功率造成體系溫度過高，導(dǎo)致核桃粕蛋白肽不穩(wěn)定，從而降低其與鈣結(jié)合的能力。

圖1 微波（A）和超聲波（B）功率對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合率的影響Fig.1 Effect of microwave (A) and ultrasonic (B) power on the calcium chelation rate of walnut meal protein peptide

結(jié)果表明，在處理時(shí)間為5 min的條件下，超聲波和微波功率分別為240 W和560 W時(shí)，核桃粕蛋白肽具有更好的鈣離子螯合能力，且超聲波提高核桃粕蛋白肽鈣螯合率的能力更強(qiáng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品均采用這兩個(gè)條件制備。

2.2 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜是一種研究物質(zhì)變化及新物質(zhì)產(chǎn)生的分析方法，官能團(tuán)特征峰的波長(zhǎng)和吸收強(qiáng)度變化可用于評(píng)估金屬螯合物的結(jié)構(gòu)變化[34]。WPP-Ca、UP-WPPCa和MP-WPP-Ca的紫外-可見光吸收光譜如圖2所示。超聲波和微波處理均改變了紫外吸收光譜。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的最大吸收峰分別出現(xiàn)在229、228 nm和229 nm處，與肽鍵中C＝O的n→π*躍遷相對(duì)應(yīng)[35]。超聲波使核桃粕蛋白肽中C＝O的原始結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增強(qiáng)了n→π*的遷移，從而使UP-WPP-Ca的光譜具有藍(lán)移趨勢(shì)，這與Qu Wenjuan等[30]的研究結(jié)果相似。此外在291 nm波長(zhǎng)處，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca都出現(xiàn)弱吸收峰，與WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。原因可能是超聲波、微波處理影響了肽中芳香族氨基酸殘基由π→π*的轉(zhuǎn)變[36]。紫外光譜中肽峰和強(qiáng)度的變化表明，超聲波和微波處理增加了核桃粕蛋白肽的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)（—CO—NH—、—NH—、—COOH），形成了UP-WPP-Ca、MPWPP-Ca的空間結(jié)構(gòu)。

圖2 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

當(dāng)金屬離子與配體原子（O、N和S）結(jié)合時(shí)，配位鍵的振動(dòng)會(huì)引起傅里葉變換紅外光譜的改變，由此可以揭示肽的有機(jī)基團(tuán)與Ca2+的相互作用。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的紅外光譜如圖3所示。不同組別的傅里葉變換紅外光譜具有明顯差異，表明超聲波和微波處理的核桃粕蛋白肽與Ca2+螯合反應(yīng)后部分氨基酸基團(tuán)發(fā)生了改變。WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPPCa分別在3 351.68、3 350.23 cm-1和3 346.86 cm-1處出現(xiàn)吸收峰。與WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca分別紅移了1.45 cm-1和4.82 cm-1，三者都處于N—H波段的伸縮振動(dòng)[37]。這些現(xiàn)象表明超聲波、微波處理引起了N—H的伸縮振動(dòng)，促使—NH2與Ca2+螯合?，F(xiàn)象進(jìn)一步說明了超聲波和微波處理使更多的氨基酸N—H帶（N端、賴氨酸、精氨酸殘基等）參與Ca2+螯合反應(yīng)。因此，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的伸縮振動(dòng)強(qiáng)度減弱?！狢＝O鍵的伸縮振動(dòng)會(huì)在紅外吸收光譜1 700～1 600 cm-1區(qū)域內(nèi)形成酰胺I帶[38]。與WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca出現(xiàn)的吸收峰從1 659.93 cm-1分別藍(lán)移到1 660.89 cm-1和1 663.30 cm-1，表明UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca中—C＝O的振動(dòng)強(qiáng)度增加，UP-WPP-Ca和MPWPP-Ca的分子內(nèi)氫鍵減少，更多的—C＝O提供了Ca2+的配位位點(diǎn)，Wang Xu等[36]研究黃瓜籽肽鈣螯合物也發(fā)現(xiàn)酰胺I帶相同的遷移現(xiàn)象。在1 600～1 500 cm-1區(qū)域內(nèi)的紅外吸收光譜為N—H彎曲振動(dòng)引起的酰胺II帶[9]。與WPP-Ca相比，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca出現(xiàn)的吸收峰從1 555.31 cm-1分別藍(lán)移到1 557.24 cm-1和1 556.27 cm-1，表明UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca中更多的N—H提供了Ca2+的配位位點(diǎn)，表現(xiàn)出與C＝O振動(dòng)強(qiáng)度相似的變化趨勢(shì)。此外，1 430～1 370 cm-1區(qū)域的傅里葉變換紅外光譜對(duì)應(yīng)羧酸鹽基團(tuán)（—COO—）的伸縮振動(dòng)[9]。WPP-Ca在1 415.01 cm-1處有一個(gè)吸收峰。MP-WPP-Ca的峰值藍(lán)移至1 416.94 cm-1，這可能是—COO—與Ca2+螯合時(shí)，引起羧酸鹽基團(tuán)的鍵長(zhǎng)拉伸，此現(xiàn)象與Hu Guanhua等[39]的研究具有同樣的藍(lán)移趨勢(shì)。UP-WPP-Ca的峰值從1 415.01 cm-1紅移至1 414.53 cm-1，原因可能是—COO—與Ca2+螯合時(shí)，引起羧酸鹽基團(tuán)的鍵長(zhǎng)收縮，此現(xiàn)象與Fang Shunxiang等[40]的研究結(jié)果類似。羧酸鹽基團(tuán)的伸縮振動(dòng)表明，超聲波、微波處理的核桃粕蛋白肽最終導(dǎo)致螯合物羧酸鹽基團(tuán)鍵長(zhǎng)的伸縮振動(dòng)。這些結(jié)果證實(shí)了核桃粕蛋白肽的—C＝O、—NH—、—COO—基團(tuán)參與了與Ca2+的螯合反應(yīng)。此外，UP-WPP-Ca和MP-WPPCa的吸收峰從1 110.80 cm-1分別藍(lán)移到1 113.21 cm-1和1 111.28 cm-1，表明相較于WPP-Ca，超聲波、微波處理增強(qiáng)了—C＝O鍵的拉伸振動(dòng)強(qiáng)度。在1 000～500 cm-1的區(qū)域內(nèi)，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca都出現(xiàn)了不同程度的吸收峰，這是由于C—H和N—H鍵被N—Ca鍵取代而產(chǎn)生的振動(dòng)。有研究報(bào)道，氨基、羰基、羧基、酰胺鍵及羧酸鹽基團(tuán)是多肽與Ca2+螯合的主要結(jié)合位點(diǎn)[41-42]，超聲波、微波處理影響到這些結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步提高了核桃粕蛋白肽鈣的螯合能力。

圖3 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.2.3 X射線衍射光譜分析

X射線衍射光譜常用于分析聚合物的結(jié)晶態(tài)與無定形態(tài)的微觀結(jié)構(gòu)[43]。從圖4可以看出，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca都有兩個(gè)主要的寬分散和弱分散衍射峰。說明三者都是一種無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)[44]。相較于WPP-Ca，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的峰較為狹窄且衍射峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這表明超聲波、微波預(yù)處理使核桃粕蛋白肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（即兩種處理方式引起核桃粕蛋白肽分子排列的變化），進(jìn)一步使核桃粕蛋白肽與Ca2+螯合形成更為有序的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 熒光光譜分析

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸可以在特定的激發(fā)波長(zhǎng)下產(chǎn)生內(nèi)源性熒光[45]，而且內(nèi)源性熒光猝滅是肽折疊的典型現(xiàn)象。肽的構(gòu)象變化、與金屬離子等小分子的相互作用可通過熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行判斷[46]。如圖5所示，UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)下降，原因可能是超聲波和微波處理的核桃粕蛋白肽與Ca2+之間形成更多的非共價(jià)相互作用，增加了核桃粕蛋白肽與Ca2+結(jié)合的芳香族氨基酸的數(shù)量，從而降低了熒光強(qiáng)度，這與2.2.1節(jié)紫外光譜芳香族氨基酸殘基的π→π*的遷移結(jié)果一致，與Wang Yilun等[47]的熒光光譜結(jié)果相似。MP-WPP-Ca的熒光強(qiáng)度高于UP-WPP-Ca的熒光強(qiáng)度，表明UP-WPP-Ca中更多的芳香族氨基酸與Ca2+螯合。這些研究結(jié)果表明，超聲波、微波處理可以促進(jìn)核桃粕蛋白肽中芳香族氨基酸與鈣離子的螯合。

圖5 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of walnut peptide-calcium chelate

2.3 核桃粕蛋白肽鈣螯合物穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.1 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的酸堿穩(wěn)定性

圖6顯示了WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca在酸性和堿性條件下的穩(wěn)定性。相較于WPP-Ca，UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca具有更好的酸堿穩(wěn)定性。在pH 6.0～10.0時(shí)，UP-WPP-Ca具有較好的穩(wěn)定性。在pH 6時(shí)，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的鈣離子保留率分別為（82.92%±1.68）%、（79.03%±1.85）%；在pH 10時(shí)，鈣離子保留率分別為（94.72%±1.94）%、（91.23%±1.72）%。在酸性環(huán)境（pH 2～6）中，MP-WPP-Ca的穩(wěn)定性高于UP-WPP-Ca的穩(wěn)定性。在pH 2時(shí)，鈣離子保留率分別為（25.49%±1.74）%（UP-WPP-Ca）和（30.81%±1.85）%（MP-WPP-Ca）。相較WPP-Ca，雖然在酸性環(huán)境下UP-WPP-Ca和MP-WPPCa的穩(wěn)定性有所提高，但在酸性環(huán)境下同樣具有低穩(wěn)定性的缺點(diǎn)。原因是帶正電荷的氫離子與帶正電荷的鈣離子競(jìng)爭(zhēng)核桃粕蛋白肽上的螯合位點(diǎn)，導(dǎo)致部分螯合的Ca2+丟失。堿性環(huán)境下，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca穩(wěn)定性較好，且均高于WPP-Ca。總之，超聲波、微波處理的核桃粕蛋白肽可以促進(jìn)螯合物酸堿穩(wěn)定性，提高Ca2+的保留率。

圖6 核桃粕蛋白肽鈣螯合物在酸堿環(huán)境中的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of walnut peptide-calcium chelates in acidic and alkaline environments

2.3.2 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的熱穩(wěn)定性

圖7為WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的熱重分析和微商熱重分析圖。WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca的熔點(diǎn)變化和化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異可以通過不同溫度環(huán)境下的熱解速率進(jìn)行確定。在初始加熱階段（25～130 ℃），WPP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca顯示一定程度的質(zhì)量損失。在這個(gè)階段，MP-WPP-Ca和WPP-Ca的質(zhì)量損失速率沒有顯著差異，分別在119.23 ℃和115.54 ℃出現(xiàn)最大質(zhì)量損失速率。但是UP-WPP-Ca的質(zhì)量損失速率顯著低于WPP-Ca和MP-WPP-Ca。表明UPWPP-Ca的熱敏感性降低。隨著溫度的持續(xù)升高，WPPCa、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca開始迅速分解。在有機(jī)降解過程中，非共價(jià)鍵（分子間/分子內(nèi)的氫鍵、靜電和疏水相互作用）都會(huì)發(fā)生斷裂。微商熱重分析曲線顯示W(wǎng)PP-Ca、UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca均處在吸熱狀態(tài)，WPP-Ca在343.48 ℃時(shí)達(dá)到最大質(zhì)量損失速率，而UPWPP-Ca、MP-WPP-Ca分別在327.64 ℃和343.82 ℃處達(dá)到最大質(zhì)量損失速率。UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的最大質(zhì)量損失速率顯著小于WPP-Ca的最大質(zhì)量損失速率。綜合結(jié)果表明，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的熱穩(wěn)定性優(yōu)于WPP-Ca。耐熱性的差異是由于螯合物形成的空間構(gòu)象的變化，這一結(jié)果可由2.2.2節(jié)中傅里葉變換紅外光譜變化證實(shí)。

圖7 核桃粕蛋白肽鈣螯合物的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of walnut peptide-calcium chelate

2.3.3 核桃粕蛋白肽鈣螯合物在模擬胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性

膳食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通常經(jīng)過胃腸道消化被吸收，胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)水解核桃粕蛋白肽形成更小的肽或氨基酸，同時(shí)胃腸道消化環(huán)境也會(huì)影響多肽的結(jié)構(gòu)和活性。因此，基于胃腸道消化環(huán)境可以用于評(píng)價(jià)膳食物質(zhì)的消化穩(wěn)定性[48]。核桃粕蛋白肽鈣螯合物在胃腸道環(huán)境中的鈣離子保留率如圖8所示。在體外胃腸消化過程中，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca具有顯著的高穩(wěn)定性。胃消化2 h后，WPP-Ca的鈣離子保留率為（86.07±0.77）%，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的鈣離子保留率分別為（89.22±0.46）%和（90.23±0.75）%。相較于WPPCa，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的鈣離子保留率均有所提高。結(jié)果表明UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca通過降低Ca2+的快速釋放，提高肽鈣螯合物的螯合能力和轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道的遞送能力，且MP-WPP-Ca比UP-WPP-Ca更穩(wěn)定，說明MP-WPP-Ca較UP-WPP-Ca更能耐受酸性環(huán)境。在腸道消化過程中（消化時(shí)間2～4 h），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，WPPCa、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的鈣離子保留率持續(xù)下降。原因可能是胃內(nèi)的酸性條件引起了螯合物的結(jié)構(gòu)變化，影響了Ca2+的結(jié)合能力。此外，胃蛋白酶、胰蛋白酶的存在可能導(dǎo)致肽的降解，降低了Ca2+的保留率。消化4 h時(shí)，WPP-Ca、UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca的鈣離子保留率分別為（81.01±0.42）%、（85.73±0.58）%和（83.11±1.58）%。腸道消化結(jié)果表明，UP-WPPCa和MP-WPP-Ca可提高螯合物的腸道消化穩(wěn)定性，且UP-WPP-Ca比MP-WPP-Ca更穩(wěn)定，在偏堿性環(huán)境下UPWPP-Ca較MP-WPP-Ca可以更好地提高核桃粕蛋白肽保留鈣離子的能力。胃腸道消化研究表明，UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca較WPP-Ca具有更強(qiáng)的鈣離子螯合能力，因此具有基于多肽載運(yùn)鈣離子提高鈣生物利用度的潛力，同時(shí)可避免腸道環(huán)境殘留過多的鈣離子形成難溶性氫氧化鈣，影響腸道健康或引起其他疾病。

圖8 核桃粕蛋白肽鈣螯合物在胃腸道消化中的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of walnut peptide-calcium chelate toward gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

本研究成功制備了具有較高Ca2+螯合能力、穩(wěn)定性強(qiáng)的UP-WPP-Ca和MP-WPP-Ca。超聲波、微波處理通過影響核桃粕蛋白肽結(jié)合鈣離子的位點(diǎn)（氨基、羰基、羧基、酰胺鍵及羧酸鹽基團(tuán)）和增加核桃粕蛋白肽的芳香族氨基酸殘基與Ca2+螯合數(shù)量提高了核桃粕蛋白肽鈣螯合能力。此外，超聲波和微波處理通過影響核桃粕蛋白肽的分子排列促使核桃粕肽鈣螯合物形成有序結(jié)構(gòu)。UPWPP-Ca和MP-WPP-Ca在不同pH值、溫度和模擬胃腸消化下較WPP-Ca保持了更高的穩(wěn)定性，即超聲波、微波處理的核桃粕蛋白肽在提高載鈣能力和生物利用度方面具有一定的潛在價(jià)值，對(duì)核桃粕蛋白肽鈣螯合物的加工生產(chǎn)及補(bǔ)鈣產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí)，關(guān)于UP-WPP-Ca、MP-WPP-Ca、WPP-Ca的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和促鈣吸收的能力差異還需開展進(jìn)一步的研究。