黃刺多糖中單糖含量與體外降血糖活性相關(guān)性分析

岳慶明，韓麗娟，鄧永蓉，馬娜娜，趙玉欣

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

黃刺，學(xué)名直穗小檗（Berberis dasystachyaMaxim.），是青藏高原一種藥食兩用的植物漿果資源。目前，市場上黃刺漿果相關(guān)產(chǎn)品有“三刺果汁[1]”“三刺果粉[2]”“三刺面霜[3]”等。黃刺果實中富含多種生物活性物質(zhì)，如小檗堿、植物甾醇、有機(jī)酸、黃酮、多糖和多酚等，一直以來備受科學(xué)界關(guān)注。黃刺多糖（Berberi dasystachyapolysaccharides，BDPs）作為一種功能性植物多糖，具有抗腫瘤、降血糖及抗氧化活性等功能[3-5]。

韓麗娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)黃刺果粉可改善糖尿病大鼠血液中的葡萄糖水平，并對血清及組織中的氧化應(yīng)激酶和丙二醛（malondialdehyde，MDA）具有調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究表明，分級醇沉的BDPs在抗氧化活性和降血糖活性方面具有良好效果[6]。Zhou Wen等[7]研究表明，超濾BDPs可有效改善2型糖尿病大鼠癥狀，提高機(jī)體抗氧化能力，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，通過逆轉(zhuǎn)2型糖尿病大鼠腸道菌群失調(diào)和代謝紊亂，調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物-腸道微生物的相互作用達(dá)到治療2型糖尿病目的。BDPs作為功能性多糖，其降血糖效果顯著。α-葡萄糖苷酶作為消化酶將淀粉和雙糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，加速葡萄糖生成速率；α-淀粉酶作為淀粉水解酶，水解后產(chǎn)生的糊精、葡萄糖等產(chǎn)物可導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生，針對兩種酶的抑制劑可延緩葡萄糖生成速率，抑制腸道消化吸收降低餐后血糖水平[8]，因此檢測這兩種體外酶抑制率可作為主要的體外降血糖活性評價體系。譚西等[9]研究表明，多糖的降血糖活性與多糖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究表明，不同產(chǎn)地的植物多糖中單糖含量及單糖組成不同且導(dǎo)致其生物活性會有所差異[10]。目前，國內(nèi)外對不同產(chǎn)地BDPs其體外降血糖活性的比較及其單糖含量與體外降血糖活性相關(guān)性研究鮮有報道。

You Shu等[11]研究表明，身體各組織長期暴露在高水平游離脂肪酸（或棕櫚酸）和葡萄糖條件下會對身體組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，稱為糖脂毒性損傷，尤其對胰島β細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重。高糖高脂引起的糖脂毒性（glucolipotoxicity，GLTy）是導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)祝M(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞功能受損。因此，預(yù)防胰島β細(xì)胞免受GLTy引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡對阻止2型糖尿病進(jìn)展至關(guān)重要[12]。通過無毒無害天然活性物質(zhì)保護(hù)已受GLTy損傷的胰島β細(xì)胞，進(jìn)而有效提高胰島細(xì)胞存活率達(dá)到治療和預(yù)防2型糖尿病效果迫在眉睫。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BDPs可提高H2O2誘導(dǎo)損傷的胰島細(xì)胞抗氧化酶活性，降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）和MDA水平，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)氧化損傷胰島細(xì)胞的作用[4]。然而，鮮見關(guān)于BDPs對GLTy誘導(dǎo)損傷的胰島細(xì)胞活性的報道。

本實驗以青海省5 個不同產(chǎn)地黃刺漿果為研究對象，超聲輔助熱水浸提不同產(chǎn)地BDPs，首先對其理化性質(zhì)及單糖組成、含量進(jìn)行對比分析研究；其次，通過建立高糖高脂雙誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)RIN-m5F胰島細(xì)胞GLTy模型，測定不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后細(xì)胞增殖活性、ROS、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平；最后采用Pearson相關(guān)性分析方法，對不同產(chǎn)地BDPs單糖含量與降血糖活性、胰島細(xì)胞增殖活性、ROS及TNF-α間的相關(guān)性進(jìn)行分析。以期明確黃刺單糖含量與體外降血糖活性相關(guān)性，為藥食同源黃刺漿果在降血糖方面開發(fā)利用及其構(gòu)效關(guān)系的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃刺漿果采自青海省周邊州縣互助縣（BDPs-I）、大通縣（BDPs-II）、循化縣（BDPs-IV）、湟源縣（BDPs-V）及西寧市（BDPs-III），采摘時間為2021年8月下旬—10月上旬果實成熟期。

RIN-m5F胰島細(xì)胞（胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞）賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；石油醚、無水乙醇、正丁醇、氯仿、甲醇（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（色譜純）上海安譜生物科技有限公司；α-淀粉酶、α-葡糖糖苷酶 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）生工生物工程（上海）股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 上海逍鵬生物科技有限公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司；ROS檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

QYLDZ-6真空冷凍干燥機(jī) 上海喬躍電子有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津企業(yè)有限公司；Reacti-thermo氮?dú)獯祾邇x、ICS5000離子色譜儀、酶標(biāo)儀、熱重儀、U3000液相色譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；SU8220冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立有限公司；BSC-1304IIA2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AE31E倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；H1850醫(yī)用離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Optilab T-rEX示差檢測器、DAWN HELEOS II激光光散射檢測器 美國懷亞特科技公司。

1.3 方法

1.3.1 BDPs提取

不同產(chǎn)地黃刺干果→粉碎過篩（100 目）→石油醚脫脂（40 ℃，料液比1∶5）→85%（V/V）乙醇溶液脫單糖（50 ℃，料液比1∶3）→超聲熱水浸提（80 ℃，料液比1∶30）→Sevag法除蛋白→D101大孔樹脂脫色→透析袋除小分子物質(zhì)→80%（V/V）乙醇溶液醇沉（4 ℃，靜置過夜）→冷凍干燥→得不同產(chǎn)地黃刺粗多糖。由圖1可見，相同條件下由不同產(chǎn)地黃刺干果制備的多糖組織形態(tài)存在較大差異，BDPs-I和BDPs-IV整體呈現(xiàn)細(xì)小顆粒狀和細(xì)膩粉末狀，BDPs-II以輕盈絮狀物為主，而BDPs-III和BDPs-V中呈大小不一的沙粒狀，說明黃刺粗多糖最終外貌形態(tài)與產(chǎn)地存在較大關(guān)聯(lián)。

圖1 不同產(chǎn)地BDPs外貌形態(tài)Fig.1 Pictures of BDPs from different geographical origins

1.3.2 BDPs化學(xué)成分測定

分別采用苯酚-硫酸法[13]、硫酸-咔唑法[14]、DNS試劑法[15]、考馬斯亮藍(lán)法[16]測定BDPs中的多糖、糖醛酸、還原糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 單糖組成分析

精確稱量BDPs樣品5 mg至色譜瓶，加入1mL 2mol/L三氟乙酸酸溶液，121 ℃加熱2 h。氮?dú)獯蹈?，加入甲醇清洗吹干，重?fù)操作2～3 次，加入無菌水溶解待測。采用離子色譜系統(tǒng)，色譜柱DionexTMCarboPacTMPA20（150 mm×3.0 mm，10 μm），進(jìn)樣量為5 μL。流動相A為0.1 mol/L NaOH溶液，流動相B為0.1 mol/L NaOH和0.2 mol/L NaAc混合液；流速0.5mL/min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度程序：0～30 min，95%～80% A、5%～20% B；30.1～45 min，60% A、40% B；45.1～60 min，95% A、5% B。

1.3.4 單糖含量測定

采用外標(biāo)法定量，通過配制不同濃度標(biāo)樣制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系信息如表1所示，再以樣品中各單糖對應(yīng)的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量濃度，進(jìn)一步計算各單糖含量。單糖含量（W）計算如式（1）所示：

表1 單糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 1 Standard curve parameters for determination of monosaccharide contents

式中：c為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為樣品提取液體積/mL；F為稀釋因子；M為樣品稱取總量/mg。

1.3.5 BDPs分子質(zhì)量測定

采用凝膠色譜儀、激光散射儀和示差檢測器連用測定BDPs分子質(zhì)量。將樣品溶解在0.1 mol/L NaNO3溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3）中，終質(zhì)量濃度為1 m g/m L，通過孔徑為0.4 5 μ m 的過濾器過濾后上機(jī)檢測。采用凝膠排阻色譜柱O h p a k S B-805 HQ（300 mm×8 mm）和Ohpak SB-803 HQ（300 mm×8 mm）串聯(lián)，柱溫45 ℃，進(jìn)樣量100 μL，流動相0.02% NaN3溶液和0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.6 mL/min，0～75 min內(nèi)等度洗脫[17]。

1.3.6 BDPs初級結(jié)構(gòu)表征

1.3.6.1 紫外光譜分析

將BDPs配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，用紫外-可見分光光度計在波長200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描[18]。

1.3.6.2 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的多糖粉末與KBr按1∶5的比例充分研磨混合后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[19]。

1.3.6.3 掃描電子顯微觀察

將表面涂有薄層金的BDPs在電子顯微鏡系統(tǒng)下掃描觀察[20]。

1.3.6.4 剛果紅試驗

精確稱取BDPs配制成3 mg/mL的多糖溶液，取1 mL BDPs溶液與0.2 mmol/L剛果紅溶液等體積混合，之后分別加入1 mol/L NaOH溶液控制最終溶液中NaOH濃度為0～0.5 mol/L，在200～600 nm下進(jìn)行全波長掃描測定其最大吸收波長[21]。

1.3.7 BDPs熱重分析

準(zhǔn)確稱取定量的BDPs多糖，使用熱重儀在氮?dú)猸h(huán)境下將多糖溫度由25 ℃升高到900 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進(jìn)行熱重分析[22]。

1.3.8 BDPs體外降血糖活性測定

1.3.8.1α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

參考文獻(xiàn)[23]稍作改動，配制質(zhì)量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 mg/mL的BDPs溶液，同時配制2 U/mL的α-葡萄糖苷酶。按表2添加各試劑，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測量吸光度。通過式（2）計算α-葡糖苷酶的抑制率：

表2 α-葡萄糖苷酶抑制率測定體系Table 2 Preparation of reaction systems for α-glucosidase inhibitory assay

式中：A1為空白組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為樣品組的吸光度；A4為樣品對照組的吸光度。

1.3.8.2α-淀粉酶抑制活性分析

參考文獻(xiàn)[24]稍作改動，配制質(zhì)量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 mg/mL的BDPs溶液及15 U/mLα-淀粉酶溶液。按表3添加各試劑，利用酶標(biāo)儀在540 nm處測定吸光度。按式（3）計算α-淀粉酶的抑制率：

表3 α-淀粉酶抑制率測定體系Table 3 Preparation of reaction systems for α-amylase inhibitory assay

式中：A1為空白組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為樣品組的吸光度；A4為樣品對照組的吸光度。

1.3.9 細(xì)胞實驗

RIN-m5F細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下（5% CO2、37 ℃）在含有10%（V/V）胎牛血清、1%（V/V）雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的完全培養(yǎng)基中生長直至細(xì)胞貼壁。在細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代、凍存及后續(xù)鋪板實驗。

1.3.10 GLTy誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞凋亡模型建立

前期課題組分別成功建立了45 mmol/L高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞和0.2 mmol/L高脂誘導(dǎo)胰島細(xì)胞的單一誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞毒性模型。在此基礎(chǔ)上混合兩種單一誘導(dǎo)劑溶液，使雙誘導(dǎo)劑中高糖終濃度為22.5 mmol/L，高脂終濃度為0.1 mmol/L進(jìn)行共同誘導(dǎo)，通過控制時間（12、24、36、48 h）確定最終RIN-m5F細(xì)胞GLTy模型。

1.3.11 不同產(chǎn)地BDPs對GLTy細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

1.3.11.1 實驗分組

空白對照組：無細(xì)胞+完全培養(yǎng)基；正常對照組（NC）：細(xì)胞+完全培養(yǎng)基；模型組（MC）：細(xì)胞+完全培養(yǎng)基+雙誘導(dǎo)劑；BDPs干預(yù)組：細(xì)胞+完全培養(yǎng)基+0.062 5 mg/mL BDPs溶液+雙誘導(dǎo)劑。

按細(xì)胞分組，使用對數(shù)生長期內(nèi)RIN-m5F胰島細(xì)胞，以1×105cells/mL的密度將細(xì)胞接種于96 孔板，加入100 μL完全培養(yǎng)基鋪板使細(xì)胞貼壁，之后棄去培養(yǎng)基，NC組加入完全培養(yǎng)基，其余組別均加入雙誘導(dǎo)劑經(jīng)細(xì)胞建模后，再此棄去培養(yǎng)基，NC組和MC組重新加入新完全培養(yǎng)基，其余多糖干預(yù)組加入BDPs多糖進(jìn)行干預(yù)。每組做6 個復(fù)孔平行，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.11.2 不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后細(xì)胞增殖活性測定

按1.3.11.1 節(jié)實驗分組處理細(xì)胞，待細(xì)胞處理完成后，采用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，每孔加入100 μL CCK-8溶液（V（CCK-8試劑）∶V（無血清培養(yǎng)基）＝1∶10），于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5 h，在450 nm處測定吸光度，通過式（4）計算測定經(jīng)不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后細(xì)胞存活率：

式中：A1為NC、MC、BDPs干預(yù)組的吸光度；A2為空白對照組的吸光度；A3為NC組的吸光度。

1.3.11.3 不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平和TNF-α水平測定

按1.3.11.1節(jié)實驗分組處理細(xì)胞，通過2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽熒光探針法測定ROS水平，參照酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒說明書測定各組細(xì)胞上清液中TNF-α水平。

1.3.11.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

按1.3.11.1節(jié)實驗分組接種細(xì)胞至6 孔板處理細(xì)胞，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量及生長狀態(tài)，10 倍鏡下觀察并留取圖像[4]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BDPs的化學(xué)組成分析

5 種BDPs中的蛋白質(zhì)、還原糖、多糖及糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果如表4所示，BDPs中化學(xué)組成存在一定的差異。其中BDPs-I中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他產(chǎn)地多糖，為58.41%（P＜0.05）。BDPs-II中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.22%，顯著高于其他產(chǎn)地多糖（P＜0.05），但與BDPs-IV 中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異并不顯著。BDPs-III和BDPs-IV中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于其他多糖（P＜0.05），均為0.22%，5 種BDPs中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.22%～0.40%之內(nèi)，說明蛋白質(zhì)去除較干凈。BDPs-III中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.67%，且與其他BDPs差異顯著（P＜0.05）。由此可知，通過超聲輔助熱水浸提同一提取方法所得不同產(chǎn)地BDPs化學(xué)組成均存在顯著差異。

表4 不同產(chǎn)地BDPs化學(xué)組成Table 4 Chemical compositions of BDPs from different regions

2.2 BDPs的單糖組成及含量分析

采用Thermo IC5000離子色譜系統(tǒng)，利用電化學(xué)檢測器對BDPs單糖組成進(jìn)行分析檢測。BDPs單糖組成離子色譜圖如圖2所示，結(jié)果表明各產(chǎn)地BDPs中共有單糖含有8 種，分別是Fuc、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA。其中BDPs-III和BDPs-V單糖組成中比其他3 個樣品多含有一種Ara。由此可知不同產(chǎn)地BDPs中多糖組成存在差異。

圖2 不同產(chǎn)地BDPs單糖組成離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of monosaccharide compositions of BDPs from different regions

由表5可知，BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV樣品單糖組成一致，均由8 種單糖組成，但各單糖組分所占百分比卻大相徑庭。而BDPs-III和BDPs-V多糖樣品由Fuc、Ara、Rha、Gal、Glc、Xly、Man、Glc-UA、Gal-UA 9 種單糖組成，各單糖組分所占百分比也不相同；通過比較其他3 種多糖樣品發(fā)現(xiàn)，Ara僅存在于BDPs-III和BDPs-V中，且BDPs-III中Ara含量是BDPs-V的2 倍。由此可知不同產(chǎn)地黃刺粗多糖中單糖含量存在較大差異，推測可能與黃刺漿果產(chǎn)地海拔、氣候條件、生長環(huán)境等不同有著密不可分的關(guān)系。

表5 不同產(chǎn)地BDPs單糖含量占比Table 5 Monosaccharide contents in BDPs from different regions%

2.3 BDPs的分子質(zhì)量分析

結(jié)合圖3分子質(zhì)量分析圖和表6分子質(zhì)量分布表可知，BDPs-III重均分子質(zhì)量最小（8.673 kDa），BDPs-IV重均分子質(zhì)量最大（1 322.854 kDa）。說明BDPs分子質(zhì)量大小受到產(chǎn)地影響較大，推測可能與產(chǎn)地海拔、環(huán)境氣候、年降雨質(zhì)量等外界因素有較大關(guān)聯(lián)。

表6 不同產(chǎn)地BDPs分子質(zhì)量分布Table 6 Molecular mass distribution of BDPs from different regions

圖3 BDPs分子質(zhì)量分析圖Fig.3 Molecular mass analysis of BDPs

2.4 BDPs的初級結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 紫外光譜分析

如圖4所示，對BDPs進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)BDPs均在200 nm左右波長處有強(qiáng)烈吸收峰，為多糖特征峰；在260 nm和280 nm左右處有較弱吸收峰，表明BDPs中可能均存在少量蛋白質(zhì)及核酸，與蛋白質(zhì)含量測定的結(jié)果一致。

圖4 不同產(chǎn)地BDPs紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectra of BDPs from different regions

2.4.2 紅外光譜分析

如圖5所示，在3 432 cm-1左右顯現(xiàn)出1 個寬而強(qiáng)的吸收峰，此峰是由多糖分子間亦或是分子內(nèi)因O—H的伸縮振動引起的。而在2 928 cm-1附近的吸收峰為烷基C—H的伸縮振動引起的[18]。在1 746 cm-1和1 616 cm-1附近出現(xiàn)弱吸收峰表明多糖中存在酯羰基（—CO—）和羧基（COO—）[4]。此外，在1 442 cm-1附近存在吸收峰，推測BDPs中含有糖醛酸[20]，這與粗多糖中糖醛酸含量測定結(jié)果相一致。1 248 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰可能是由C—O糖苷鍵的伸縮振動引起的[25]，1 070 cm-1和1 024 cm-1處波峰表明黃刺粗多糖中存在吡喃糖，而779 cm-1處波峰顯示的信號表明吡喃糖是以β型結(jié)構(gòu)存在于BDPs中[5]。通過紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地BDPs糖苷鍵連接方式一致，均由β-糖苷鍵連接且是具有吡喃糖環(huán)骨架構(gòu)型的雜多糖。

圖5 不同產(chǎn)地BDPs紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of BDPs from different regions

2.4.3 掃描電子顯微鏡觀察分析

由圖6可知，BDPs結(jié)構(gòu)形態(tài)呈現(xiàn)一定的差異性，BDPs-I以片狀結(jié)構(gòu)組成，表面較為平整且結(jié)構(gòu)疏松，存在孔洞（圖6A）。BDPs-II存在條帶狀結(jié)構(gòu)，有細(xì)微裂縫（圖6B）。BDPs-III表面整體較為光滑，但存有細(xì)微裂縫（圖6C），推測由于較小的分子質(zhì)量賦予了BDPs-III較為細(xì)膩光滑的外貌形狀。BDPs-IV表面粗糙、凹凸不平，呈石泥堆積狀（圖6D），由此推測可能是由于BDPs-IV擁有較大的分子質(zhì)量有關(guān)。BDPs-V表面無孔洞及裂縫，且有大小不一顆粒狀存在（圖6E）。掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地BDPs外貌形態(tài)差異明顯，造就該現(xiàn)象的原因可能與BDPs分子質(zhì)量大小有密不可分的關(guān)系。

圖6 不同產(chǎn)地黃刺粗多糖掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of BDPs from different regions

2.4.4 剛果紅試驗結(jié)果

由圖7可以看出，隨著NaOH濃度的增大，BDPs剛果紅試劑作用產(chǎn)生絡(luò)合物的最大吸收波長均呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢，造成這種結(jié)果的原因可能是因為BDPs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大，在水溶液中呈現(xiàn)無規(guī)卷曲構(gòu)象，說明BDPs均不具備三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 不同NaOH濃度下BDPs與剛果紅絡(luò)合物的最大吸收波長Fig.7 Maximum absorption wavelengths of BDPs and Congo red complex at different NaOH concentrations

2.5 BDPs熱穩(wěn)定性結(jié)果分析

如圖8所示，BDPs在50～850 ℃范圍間其熱穩(wěn)定性效果均存在較大差異。BDPs-I、BDPs-II、BDPs-IV在整體溫度范圍內(nèi)其熱解過程分為2 個階段，其中BDPIII和BDPs-V在整體溫度范圍內(nèi)其熱解過程分為3 個階段。BDPs-I～BDPs-V樣品第一階段質(zhì)量損失率依次為7.12%、7.68%、9.26%、9.47%、9.55%，第一階段最大質(zhì)量損失速率分別出現(xiàn)在97.92、97.74、101.61、97.73、99.34 ℃。這一階段損失了樣品中水分，表明樣品中含有不同含量的結(jié)合水以及部分吸附水[22]。其次也印證了由于多糖相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步造就了多糖在50～200 ℃范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定，同時說明該溫度范圍的熱處理不會引起多糖的熱分解，說明BDPs可應(yīng)用于巴氏殺菌食品、藥品等需高溫處理的領(lǐng)域[26]。該階段BDPs-I質(zhì)量損失最低，損失率為7.12%。說明第一階段中BDPs-I中水分含量較低，其穩(wěn)定性較好。

圖8 不同產(chǎn)地BDPs熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of BDPs from different regions

第二階段BDPs-I～BDPs-V樣品質(zhì)量損失率依次為66.17%、68.25%、61.23%、64.37%、65.51%，該階段最大質(zhì)量損失速率分別出現(xiàn)在BDPs-I：252.57；BDPs-II：300.32 ℃；BDPs-III：303.81 ℃；BDPs-IV：247.59 ℃；BDPs-V：303.81 ℃。表明不同產(chǎn)地BDPs樣品第二階段發(fā)生熱解的溫度點(diǎn)各不相同，且各溫度點(diǎn)相差較大，其發(fā)生熱解溫度點(diǎn)跨度范圍為237.98～460.12 ℃。推測該階段是由于高溫?zé)峤膺^程使得BDPs樣品中多糖糖苷鍵斷裂而造成的一次較大的質(zhì)量損失。

樣品BDPs-III和BDPs-V第三階段熱解過程分別為587.22～845.83 ℃和543.36～845.93 ℃，該階段樣品質(zhì)量損失率分別為5.26%和7.05%，最大質(zhì)量損失速率出現(xiàn)在699.12 ℃和688.80 ℃。推測可能是樣品中色素以及未去除干凈的雜質(zhì)在688 ℃以上高溫條件下發(fā)生的熱解而造成的較小的質(zhì)量損失，由此說明BDPs-III和BDPs-V中含有少量雜質(zhì)。

2.6 BDPs的體外降血糖活性

BDPs對α-葡萄糖苷酶抑制率見圖9a。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～16 mg/mL），雖然BDPs對α-葡萄糖苷酶抑制效果顯著低于阿卡波糖陽性組（P＜0.05），但其對α-葡萄糖苷酶仍具有較強(qiáng)的抑制能力，且抑制率與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。BDPs-III對α-葡萄糖苷酶抑制能力較其他產(chǎn)地BDPs強(qiáng)，于16 mg/mL質(zhì)量濃度下其抑制率為66.56%（P＜0.05）。不同產(chǎn)地BDPs對α-葡萄糖苷酶半抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值由小到大依次為BDPs-III（3.717 mg/mL）＜BDPs-V（14.556 mg/mL）＜BDPs-I（15.701 mg/mL）＜BDPs-II（17.155 mg/mL）＜BDPs-IV（17.697 mg/mL）。由此可見，BDP-III對于α-葡萄糖苷酶抑制能力強(qiáng)于其他產(chǎn)地BDP，該結(jié)果與Ji Xiaolong等[27]所報道的低分子質(zhì)量的多糖由于其分子內(nèi)氫鍵較弱，會有更多的游離氨基和羥基，更利于多糖發(fā)揮生物活性的結(jié)論一致。

圖9 不同產(chǎn)地BDPs體外降血糖活性Fig.9 In vitro hypoglycemic activitiesof BDPs from different regions

BDPs對α-淀粉酶活性抑制率測定見圖9b。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.5～16 mg/mL），雖然BDPs對α-淀粉酶抑制效果顯著低于阿卡波糖陽性組（P＜0.05），但其對α-淀粉酶表現(xiàn)較好的抑制能力，且抑制率與樣品質(zhì)量濃度之間存在一定的劑量依賴關(guān)系。在低質(zhì)量濃度范圍（0.5～4 mg/mL）內(nèi)，BDPs-III對α-淀粉酶抑制能力顯著優(yōu)于其他產(chǎn)地樣品，在高質(zhì)量濃度范圍（8～16 mg/mL）內(nèi)，BDPs-I對α-淀粉酶抑制能力顯著優(yōu)于其他產(chǎn)地樣品。在最大質(zhì)量濃度條件下，BDPs-I對α-淀粉酶抑制率顯著優(yōu)于其余樣品，其最大抑制率為67.41%（P＜0.05），其余4 種BDPs樣品抑制率彼此并無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。其中不同產(chǎn)地BDPs對α-淀粉酶IC50值按序依次為BDPs-I（9.875 mg/mL）＜BDPs-V（10.056 mg/mL）＜BDPs-III（11.782 mg/mL）＜BDPs-IV（13.208 mg/mL）＜BDPs-II（16.264 mg/mL）。由此可見BDPs-I對于α-淀粉酶抑制效果最優(yōu)。

2.7 不同產(chǎn)地BDPs對RIN-m5F胰島細(xì)胞的保護(hù)作用

2.7.1 建立GLTy胰島細(xì)胞模型

由圖10可知，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度不變（葡萄糖終濃度為22.5 mmol/L，棕櫚酸終濃度為0.1 mmol/L），高糖高脂雙誘導(dǎo)劑作用12 h后，細(xì)胞存活率相比NC組顯著上升（P＜0.05）。之后隨著建模時間延長，相比NC組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）。當(dāng)誘導(dǎo)劑不變，雙誘導(dǎo)劑作用24 h后，細(xì)胞存活率為（53.3±5.01）%，顯著低于NC組（P＜0.01），且其值接近50%，后續(xù)可采用該條件建立GLTy胰島細(xì)胞模型。隨著后續(xù)時間延長至36～48 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率顯著低于NC組，且值遠(yuǎn)小于50%，故不考慮其作為GLTy胰島細(xì)胞模型建模條件。

圖10 結(jié)合高糖高脂雙誘導(dǎo)RIN-m5F細(xì)胞GLTy模型篩選Fig.10 Determination of culture time for induction of GLTy in RIN-m5F cells by glucose and palmitic acid

2.7.2 BDPs對GLTy誘導(dǎo)胰島細(xì)胞活性影響

如圖11所示，通過高糖高脂聯(lián)合誘導(dǎo)24 h后，與NC組相比，MC組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），說明GLTy細(xì)胞模型具有一定的可靠性和穩(wěn)定性。通過不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后，細(xì)胞存活率均顯著高于MC組細(xì)胞（P＜0.01），同時經(jīng)不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后，細(xì)胞存活率均高于NC組細(xì)胞（P＞0.05），其中BDPs-I組細(xì)胞存活率高達(dá)（105.47±3.32）%。由此可知不同產(chǎn)地BDPs對GLTy誘導(dǎo)的胰島損傷細(xì)胞均具有促進(jìn)胰島細(xì)胞生長作用，其中BDPs-I其增殖效果最優(yōu)。

圖11 BDPs對RIN-m5F胰島細(xì)胞的增殖活性Fig.11 Proliferation-promoting effect of BDPs on RIN-m5F cells subjected to glucolipotoxicity

2.7.3 BDPs對GLTy誘導(dǎo)胰島細(xì)胞ROS和TNF-α水平影響

如圖12所示，高糖高脂的糖脂毒性作用于細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS和TNF-α水平明顯增加，顯著高于NC組（P＜0.01）。經(jīng)過不同產(chǎn)地BDPs組干預(yù)24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS和TNF-α水平相比模型組有顯著下降趨勢（P＜0.05）。不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后可抑制ROS和TNF-α產(chǎn)生，其ROS抑制效果按優(yōu)劣排序依次為：BDPs-V＞BDPs-I＞BDPs-IV＞BDPs-III＞BDPs-II；其TNF-α抑制效果按優(yōu)劣排序依次為：BDPs-I＞BDPs-V＞BDPs-II＞BDPs-III＞BDPs-IV。通過對ROS和TNF-α抑制優(yōu)劣可知，不同BDPs對ROS和TNF-α抑制產(chǎn)生效果存在較大差異，其中BDPs-V對ROS水平的抑制產(chǎn)生作用最強(qiáng)，BDPs-I對TNF-α水平的抑制效果最優(yōu)。由此說明高糖高脂誘導(dǎo)細(xì)胞使胞內(nèi)ROS和TNF-α水平升高，經(jīng)不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后可以降低GLTy損傷的RIN-m5F細(xì)胞內(nèi)ROS和TNF-α水平，可抑制GLTy造成的細(xì)胞氧化損傷。

圖12 BDPs對ROS水平（a）和TNF-α質(zhì)量濃度（b）的影響Fig.12 Effects of BDPs on ROS levels (a) and TNF-α concentrations (b)

2.7.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖13所示，未經(jīng)處理的NC組RIN-m5F胰島細(xì)胞整體呈聚集圓球狀或梭狀；經(jīng)高糖高脂誘導(dǎo)24 h后MC組RIN-m5F胰島細(xì)胞發(fā)生皺縮及細(xì)胞潰爛導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞密度逐漸降低等細(xì)胞形態(tài)變化。然而經(jīng)過不同產(chǎn)地BDPs干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，細(xì)胞密度明顯增加，細(xì)胞邊界逐漸變圓滑。這表明不同產(chǎn)地BDPs對受損胰島細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗糖脂毒性能力。

圖13 BDPs干預(yù)后的RIN-m5F細(xì)胞形態(tài)圖Fig.13 Morphological changes of RIN-m5F cells after BDP interventions

2.8 相關(guān)性分析

通過化學(xué)方法測定不同產(chǎn)地中多糖、糖醛酸、蛋白及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)合各產(chǎn)地單糖組成進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖14a所示，僅有Man與多糖、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)間呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.52、0.54，其中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與Fuc、Xyl、Glc-UA等單糖存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，Glc、Gal-UA與糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性。除Fuc、Xly與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性外，其余單糖與蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)間相關(guān)性較弱。還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與單糖組成間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，尤其是Fuc、Xly、Glc-UA，其與還原糖呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.66，其余單糖與還原糖間存在較弱的相關(guān)性。

圖14 多糖化學(xué)組成、降血糖活性與單糖組成相關(guān)性熱圖Fig.14 Heatmaps of correlation between monosaccharide composition and chemical composition and hypoglycemic activity

為探明BDPs中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與降血糖活性間的關(guān)系，將二者數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析研究。如圖14b所示，BDPs中單糖含量與降血糖活性具有較強(qiáng)的相關(guān)性。其中α-葡萄糖苷酶與Glc呈現(xiàn)正相關(guān)性，Gal、Rha兩種單糖與α-淀粉酶具有正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.65以上，說明當(dāng)多糖中存在Rha、Gal、Glc等單糖有助于提高其降血糖能力。除此之外，與α-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)正相關(guān)性的單糖還有Gal-UA和Glc-UA，其余單糖與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性且相關(guān)性均不顯著。細(xì)胞增殖活性與Man、Rha和Gal呈現(xiàn)正相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.052（P＞0.05）、0.17（P＞0.05）和0.25（P＞0.05），其余單糖與細(xì)胞增殖活性均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其中Fuc和Xly與細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)較強(qiáng)的顯著負(fù)相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)均為-0.91（P＜0.05）。細(xì)胞ROS水平與單糖Rha、Gal、Glc、Gal-UA、Glc-UA等單糖及糖醛酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)性，其中與Gal-UA、Gal正相關(guān)性較強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)均在0.67以上（P＞0.05），與其余單糖呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性尤其與Man間負(fù)相關(guān)較強(qiáng)。細(xì)胞TNF-α水平與Fuc、Glc、Xly、Gal-UA、Glc-UA等單糖及糖醛酸含量呈現(xiàn)正相關(guān)性，其中Fuc、Xly、Gal-UA具有較強(qiáng)的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.68（P＞0.05），與其余單糖呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。由此說明BDPs降血糖活性、細(xì)胞增殖活性、ROS水平及TNF-α水平與單糖組成之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。

3 討論

本研究中，首先采用化學(xué)方法對不同產(chǎn)地BDPs進(jìn)行化學(xué)成分測定說明不同產(chǎn)地黃刺粗多糖中化學(xué)組成含量存在較大差異；不同產(chǎn)地粗多糖中單糖組成存有差異。表明各樣品間化學(xué)組成和單糖組成及含量與樣品產(chǎn)地、生長環(huán)境、果實品質(zhì)等因素息息相關(guān)[28]。于小芳[29]、黃國英[30]等也證實多糖化學(xué)組成和單糖組成及含量與其產(chǎn)地有較大關(guān)系。

在一定實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 個產(chǎn)地黃刺粗多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制能力，但抑制率均小于阿卡波糖對照組，這可能是與BDPs為粗多糖有關(guān)，因多糖未進(jìn)行純化處理故而導(dǎo)致生物活性不高。李井雷等[31]研究羊肚菌胞外多糖體外降血糖結(jié)果，顯示該多糖對α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制率均小于阿卡波糖對照組，在高濃度下抑制率分別達(dá)到20%和40%左右，而黃刺粗多糖在高質(zhì)量濃度下抑制率可達(dá)60%左右，說明BDPs降血糖活性優(yōu)于羊肚菌胞外多糖，而黃刺粗多糖純化后的降血糖活性有待進(jìn)一步研究。Ji Xiaolong等[27]報道，多糖的降血糖活性與多糖分子質(zhì)量大小和單糖組成復(fù)雜程度有著直接關(guān)系，表明多糖分子質(zhì)量越小，單糖組成種類越多會使得多糖具有更高降血糖活性，這也可能是BDPs擁有較高的降血糖活性的原因之一。

胰島細(xì)胞的GLTy是導(dǎo)致其功能障礙的重要原因之一，其與炎癥因子，氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[32]，因此，預(yù)防胰島細(xì)胞凋亡及促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖、抑制胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激降低炎癥因子水平是防治糖尿病的有效途徑之一。長期暴露于高水平高糖高脂中的胰島β細(xì)胞會發(fā)生胰島細(xì)胞損傷，同時ROS水平及TNF-α顯著升高[33]，這與本文研究結(jié)果一致。胡朝恩等[34]發(fā)現(xiàn)高糖高脂造成的GLTy會使胰島細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子和免疫因子，抑制胰島β細(xì)胞增殖，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙。本研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)合高糖高脂聯(lián)合誘導(dǎo)可成功建立胰島β細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活性，與模型組相比，經(jīng)BDPs干預(yù)后細(xì)胞存活率顯著上升，ROS和TNF-α水平顯著下降，其中BDPs-I展現(xiàn)了最優(yōu)的增殖活性，最大程度降低了TNF-α水平。BDPs-I相比其他產(chǎn)地BDPs樣品對受損胰島β細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖作用，同時通過降低ROS和TNF-α水平緩解胰島細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護(hù)胰島細(xì)胞免受GLTy侵?jǐn)_的目的。

已有研究表明，植物多糖的單糖組成及含量與生物活性有著密不可分的關(guān)系，倪力軍等[35]研究發(fā)現(xiàn)8 種多糖樣品中，除Glc以外其余單糖與抗氧化活性均具有較強(qiáng)的相關(guān)性。黨參多糖對HepG2的細(xì)胞活性與其單糖的種類存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)含有Gal-UA相對較高的黨參多糖其細(xì)胞活性較強(qiáng)[36]。因此，為探究BDPs中單糖含量與降血糖活性間的相關(guān)性，本研究通過Pearson相關(guān)性分析方法分析BDPs與降血糖活性間的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)Rha、Gal與降血糖活性相關(guān)檢測指標(biāo)（α-淀粉酶抑制率）呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)，推測多糖中含有的Rha、Gal、Gal等單糖有助于提高降血糖能力。Xly與細(xì)胞存活率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其余單糖與細(xì)胞存活率相關(guān)性較弱，由此推測BDPs其較高的細(xì)胞增殖活性可能與多糖高級結(jié)構(gòu)及復(fù)雜連接方式有關(guān)。Man與ROS呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，說明Man可有助于抑制ROS積累，提高ROS清除效率，對GLTy損傷的細(xì)胞起到較強(qiáng)的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

不同產(chǎn)地BDPs在初級結(jié)構(gòu)表征、體外降血糖活性及細(xì)胞水平均存在較大的差異，其中BDPs-I具有優(yōu)良的化學(xué)組成、單糖組成及含量，體現(xiàn)了較優(yōu)的體外降血糖活性。通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低ROS水平和TNF-α水平達(dá)到保護(hù)胰島細(xì)胞因受GLTy而造成的細(xì)胞凋亡，篩選出最佳產(chǎn)地樣品為BDPs-I。BDPs中單糖含量Rha、Gal與降血糖活性（α-淀粉酶抑制率）存在較強(qiáng)的正相關(guān)性，Man與ROS呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究為BDPs在糖尿病治療中的應(yīng)用提供了一定依據(jù)，為BDPs在GLTy胰島凋亡模型引起的糖尿病防治中的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。