基于銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后的模型

譚天華,宋京海

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院,北京 100730;2. 北京醫(yī)院/國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院,北京100730)

肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù),每年全球有超過(guò)80萬(wàn)人被診斷患有肝癌,而且?guī)缀跸嗤瑪?shù)量的患者因此喪失生命[1]。肝癌的預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療策略的制定一直是臨床研究的重點(diǎn)之一[2]。目前,臨床醫(yī)生主要依靠臨床特征和病理學(xué)指標(biāo)來(lái)判斷肝癌患者的預(yù)后,然而這些傳統(tǒng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)存在一定的局限性,無(wú)法做到個(gè)體化[3]。因此,尋找新的預(yù)測(cè)指標(biāo)和生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估肝癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。鐵死亡是鐵依賴的新型細(xì)胞程序性死亡方式,主要進(jìn)程包括鐵積累、脂質(zhì)過(guò)氧化、修復(fù)系統(tǒng)受損,可造成細(xì)胞死亡和膜破壞,促進(jìn)鐵死亡可作為誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡的治療手段[4]。鐵死亡在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,NRF2、Rb、MT1G等多種基因參與肝癌細(xì)胞抵抗索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡[5]。銅死亡通過(guò)銅離子與三羧酸循環(huán)的脂質(zhì)組分結(jié)合,促進(jìn)鐵硫蛋白損傷、脂酰化蛋白聚集,產(chǎn)生毒性應(yīng)激導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[6]。鐵、銅離子具有劑量依賴性細(xì)胞毒性,能相互作用共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[7]。本研究通過(guò)構(gòu)建基于銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因的模型,評(píng)估了其與肝癌患者生存期、免疫功能的關(guān)系,以尋找預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的標(biāo)志物,為臨床研究提供參考。

1 資料和方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 使用TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌患者RNA序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、相關(guān)臨床特征數(shù)據(jù)和突變數(shù)據(jù),對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理,分離出mRNA和LncRNA,并提取了臨床信息和計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷,最終納入370例肝癌患者,按照1∶1的比例將合并后的數(shù)據(jù)集隨機(jī)分為訓(xùn)練組(即訓(xùn)練模型數(shù)據(jù),通過(guò)訓(xùn)練組的數(shù)據(jù)確定擬合曲線的參數(shù),185例)和測(cè)試組(即測(cè)試已經(jīng)訓(xùn)練好的模型的精確度,185例)。同時(shí)下載driver、Suppressor和Marker三類與鐵死亡相關(guān)的基因,合并為鐵死亡相關(guān)基因集合。將銅死亡基因和鐵死亡基因與mRNA結(jié)合,獲得這些基因相關(guān)的表達(dá)矩陣。使用R Studio軟件中的limma包,過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)系數(shù)corFilter=0.3,并設(shè)置p值過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為pvalueFilter=0.05,篩選與銅死亡相關(guān)基因具有相關(guān)性的鐵死亡基因。

1.2模型的構(gòu)建 使用R Studio軟件中的limma包將與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因與肝癌患者的臨床數(shù)據(jù)合并?；谥形伙L(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,建立低風(fēng)險(xiǎn)組、高風(fēng)險(xiǎn)組2個(gè)亞組。利用Lasso Cox回歸方法,在TCGA數(shù)據(jù)集中尋找與肝癌患者生存期顯著相關(guān)的銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因。通過(guò)多因素Cox回歸分析銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因,建立銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因的風(fēng)險(xiǎn)模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算公式:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因1×coef+銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因2×coef+……+銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因n×coef,其中coef代表鐵死亡基因與生存期相關(guān)的系數(shù)。

1.3模型的驗(yàn)證 繪制風(fēng)險(xiǎn)曲線,觀察高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的差異。采用單因素和多因素的Cox回歸分析,驗(yàn)證預(yù)后模型是否能夠獨(dú)立于肝癌患者的其他臨床特征(如性別、年齡、腫瘤分級(jí)和腫瘤分期)來(lái)區(qū)分預(yù)后。繪制ROC曲線和C-index曲線,評(píng)估和驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)肝癌患者生存期的準(zhǔn)確性。

1.4基因的功能和免疫相關(guān)性分析 選取高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的具有差異表達(dá)的基因進(jìn)行與免疫功能相關(guān)性分析,探索2組中表達(dá)顯著差異的免疫功能指標(biāo),繪制瀑布圖,比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中基因突變頻率的情況。通過(guò)將腫瘤突變負(fù)荷與肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)合進(jìn)行分析,獲得聯(lián)合的生存曲線。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 26.0和R 4.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行高低風(fēng)險(xiǎn)組間的生存期比較,運(yùn)用單因素和多因素Cox回顧分析預(yù)測(cè)模型對(duì)肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值,繪制ROC曲線評(píng)估模型預(yù)測(cè)肝癌患者生存期的價(jià)值,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建 肝癌患者的生存數(shù)據(jù)和與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因(見圖1)合并后獲得13個(gè)與銅死亡相關(guān)的基因,提取13個(gè)基因在肝癌患者中的表達(dá)量。運(yùn)用Lasso回歸分析與銅死亡相關(guān)的預(yù)后基因,并構(gòu)建Cox模型。在多變量Cox回歸數(shù)據(jù)中選擇EIF2S1、G6PD和NRAS這3個(gè)與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示訓(xùn)練組中EIF2S1、G6PD、NRAS與生存期獨(dú)立相關(guān)(P均<0.05),可構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型以評(píng)估肝癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)多變量Cox回歸分析得出的預(yù)后模型公式如下:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=(0.594 652 370 045 789×EIF2S1表達(dá))+(0.205 764 004 842 305×G6PD表達(dá))+(0.369 015 871 232 048×NRAS表達(dá))。

圖1 肝癌與銅死亡基因相關(guān)的鐵死亡基因的表達(dá)情況

2.2模型的驗(yàn)證 Kaplan-Meier分析顯示,與低風(fēng)險(xiǎn)組比較,高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存期較短(P<0.05),生存率較低(P<0.05),見圖2。單因素Cox回歸分析顯示,銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型HR為1.734,95% CI為1.494～2.034,P<0.001,見圖3。多因素Cox回歸分析顯示,銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型HR為1.661,95% CI為1.397～1.976,P<0.001,見圖4。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)肝癌患者第1,3,5年生存期的曲線下面積(AUC)分別為0.760,0.663和0.636,AUC均大于0.5,說(shuō)明該模型對(duì)預(yù)測(cè)肝癌患者的生存期具有較高的準(zhǔn)確性,見圖5。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,與早期肝癌患者相比,晚期肝癌患者生存期更短(P<0.05),生存率更低(P<0.05),見圖6。

圖2 高低風(fēng)險(xiǎn)肝癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

圖3 單因素Cox回歸分析銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)肝癌生存期的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖4 多因素Cox回歸分析銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)肝癌生存期的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖5 ROC曲線分析銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)肝癌生存期的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖6 早期和晚期肝癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

2.3基因功能和免疫相關(guān)性 在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中,Type Ⅱ IFN Response、Parainflammation、APC co-stimulation、CCR、Check-point和MHC class Ⅰ這6個(gè)免疫功能的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05),見圖7。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,高腫瘤突變負(fù)荷的肝癌患者生存期明顯短于低腫瘤突變負(fù)荷的患者(P<0.05)。見圖8。

圖7 高低風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫功能分析

圖8 高腫瘤突變負(fù)荷與低腫瘤突變負(fù)荷肝癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

隨著對(duì)肝癌細(xì)胞學(xué)和腫瘤生物學(xué)的深入研究,發(fā)現(xiàn)銅死亡和鐵死亡途徑在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,為選擇與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因作為預(yù)后模型的關(guān)鍵基因集奠定了理論基礎(chǔ)[8]。本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的RNA序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因的表達(dá)與肝癌患者的生存期密切相關(guān);通過(guò)Lasso回歸分析和Cox模型的構(gòu)建,確定了3個(gè)銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因(EIF2S1、G6PD和NRAS)作為預(yù)后模型的關(guān)鍵基因,在訓(xùn)練組中被證實(shí)與生存期獨(dú)立相關(guān),其表達(dá)水平與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)。根據(jù)多變量Cox回歸分析得出的預(yù)后模型公式,計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明構(gòu)建的模型能對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)肝癌患者的生存期具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值;單因素和多因素Cox回歸分析驗(yàn)證結(jié)果表明銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型具有肝癌的獨(dú)立預(yù)后特征,可以作為評(píng)估患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo);ROC曲線分析表明,風(fēng)險(xiǎn)模型能夠有效預(yù)測(cè)肝癌患者的生存期,為臨床決策提供了重要的參考依據(jù);Kaplan-Meier生存曲線分析顯示晚期肝癌患者生存期明顯短于早期肝癌患者,表明風(fēng)險(xiǎn)模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝癌患者不同臨床階段的生存期,有助于為不同階段患者的治療提供參考。

免疫功能與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān),其中Type Ⅱ IFN Response反應(yīng)與抗病毒免疫有關(guān), Parainflammation反應(yīng)與慢性炎癥相關(guān),APC co-stimulation參與T細(xì)胞的活化和抗原遞呈,CCR與細(xì)胞趨化和炎癥反應(yīng)有關(guān),Check-point影響T細(xì)胞調(diào)節(jié),MHC class Ⅰ在腫瘤免疫監(jiān)視中起到重要作用[9-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中,Type Ⅱ IFN Response、Parainflammation、APC co-stimulation、CCR、Check-point和MHC class Ⅰ這6個(gè)免疫功能指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因可能參與肝癌的免疫功能調(diào)節(jié),與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。

腫瘤突變負(fù)荷被認(rèn)為是一個(gè)重要的腫瘤特征,與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),高腫瘤突變負(fù)荷患者的生存期明顯低于低腫瘤突變負(fù)荷的患者,驗(yàn)證了腫瘤突變負(fù)荷對(duì)肝癌患者生存期的影響,并為評(píng)估患者預(yù)后提供了重要的補(bǔ)充信息。

綜上所述,與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因在肝癌患者預(yù)后、免疫功能和腫瘤突變負(fù)荷中有重要作用。本研究為肝癌預(yù)后評(píng)估提供了一個(gè)可靠和準(zhǔn)確的模型,該模型基于與銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因能夠區(qū)分不同預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的患者,可以用于指導(dǎo)患者的治療選擇和監(jiān)測(cè),評(píng)估不同預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)患者對(duì)特定治療方案的反應(yīng)以及個(gè)體化治療策略的有效性,且為進(jìn)一步研究銅死亡相關(guān)的鐵死亡基因與肝癌免疫治療的關(guān)系提供了新的線索,為個(gè)體化治療策略的開發(fā)提供了新的方向和目標(biāo)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。