染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子對乳腺癌預(yù)后的預(yù)測價值

凌鏗 金麗琴

乳腺癌在2020 年的全球發(fā)病例數(shù)高達226 萬例，已超越肺癌的220 萬例，成為全球發(fā)病率第一的癌癥[1-2]。盡管醫(yī)學技術(shù)不斷進步，如靶向治療和免疫治療等在臨床的廣泛應(yīng)用，但乳腺癌患者的總體生存率仍不盡如人意[3-4]。近年研究顯示，多基因標記有助于乳腺癌的風險分層和預(yù)后預(yù)測[5]。染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子（chromatin regulators，CRs）在腫瘤中的表觀遺傳學改變被視為關(guān)鍵標志[6-7]，其失調(diào)可能導致癌癥等多種疾病的發(fā)生。然而，關(guān)于CRs 與乳腺癌之間關(guān)系的系統(tǒng)研究仍然較少。本研究通過生物信息學方法，探討CRs 在乳腺癌中的表達模式及其預(yù)測預(yù)后的潛在價值，旨在了解CRs 的作用機制并尋找新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 差異表達CRs 的數(shù)據(jù)收集和識別 從公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov）獲取111 個正常乳腺組織和1 057 個乳腺癌組織的mRNA 表達和相關(guān)臨床信息，以及從前期專題研究中檢索到870 個CRs[8]。這些mRNA 采用R 軟件preprocess Core 軟件中的normalize.quantiles 函數(shù)進行數(shù)據(jù)標準化處理，根據(jù)相應(yīng)平臺注釋信息，統(tǒng)計將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為gene symbol。根據(jù)|logFC|＞1 和假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 的標準，使用基于R軟件的limma軟件識別差異表達的CRs。

1.2 基于CRs 的預(yù)測模型的構(gòu)建與驗證 采用單因素Cox 回歸分析對所有候選CRs進行初步篩選，從而確定與乳腺癌患者總體生存率顯著相關(guān)的CRs。隨后，采用最小絕對值收斂和選擇算子算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）-Cox 回歸分析法中的交叉驗證方法確定最佳的懲罰參數(shù)λ值，以最終確定包含在預(yù)后風險模型中的CRs。LASSO-Cox 回歸不僅能夠處理變量選擇問題，還能有效地控制模型的復(fù)雜度，減少過擬合的風險，為乳腺癌患者提供一個可靠的預(yù)后評估工具。然后計算每例乳腺癌患者的風險分數(shù)（Risk score），Risk score=（Coef 1×expression mRNA 1）+（Coef 2×expression mRNA 2）+…+（Coef n×expression mRNA n），其中Coef 是相應(yīng)mRNA 的LASSO-Cox 回歸模型系數(shù)。以所有患者Risk score 的中位數(shù)將乳腺癌患者分為高風險組和低風險組。采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，評估兩組患者的預(yù)后。使用survival ROC 軟件繪制時間依賴性ROC 曲線評估風險模型的預(yù)測效能，計算AUC，數(shù)值越接近1，表示模型的預(yù)測效能越強。

1.3 基于Risk score 和臨床變量構(gòu)建列線圖 將模型與乳腺癌患者其他臨床變量相結(jié)合以提高預(yù)測準確性，其中臨床變量包括患者的年齡、癌癥分期（StageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）、腫瘤大?。═ 分類）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N 分類）、遠處轉(zhuǎn)移情況（M 分類）。采用單因素Cox 回歸分析以評估Risk score 以及上述臨床變量對乳腺癌患者預(yù)后的影響，隨后采用多因素Cox 回歸分析確定Risk score 對乳腺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測價值。應(yīng)用上述臨床變量和基于CRs 的特征Risk score 構(gòu)建列線圖，以評估乳腺癌患者1、3、5 年總生存期（overall survival，OS）。采用校準曲線來評估列線圖的預(yù)測效能。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用R 4.2.1 統(tǒng)計軟件。組間CRs表達水平的比較采用Wilcoxon 秩和檢驗，高風險組和低風險組生存時間的比較采用log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基于CRs 的模型建立和驗證 與正常乳腺組織相比，TCGA-乳腺癌數(shù)據(jù)庫中有127 個差異表達的CRs，見圖1（插頁）。根據(jù)P值排序，前20 個具有預(yù)后價值的基因見圖2。然后，使用LASSO-Cox 回歸分析篩選出16 個差異CRs 并構(gòu)建乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測能力的特征（ACTL6B+ASCL1+CHEK1+FBXL19+FOXA1+HMGB3+IDH2+MAZ+MECOM+RAD54B+SMYD3+SP140+TDRD12+TDRKH+TONSL+UBE2T），成功構(gòu)建了風險模型。根據(jù)16 個CRs 的相關(guān)系數(shù)計算Risk score，Risk score=（0.023 5×ACTL6B 表達）+（0.003 0×ASCL1 表達）+（0.003 4×CHEK1 表達）+（0.019 3×FBXL19 表達）+（0.001 5×FOXA1 表達）+（0.002 0×HMGB3 表達）+（0.001 1×IDH2 表達）+（-0.010 3×MAZ 表達）+（0.059 8×MECOM 表達）+（0.075 0×RAD54B 表達）+（0.007 1×SMYD3 表達）+（-0.097 8×SP140 表達）+（0.018 4×TDRD12 表達）+（0.012 2×TDRKH 表達）+（0.008 3×TONSL 表達）+（0.002 3×UBE2T 表達）。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，高風險組死亡率明顯高于低風險組（P＜0.001）；時間依賴性ROC 曲線分析顯示，TCGA 數(shù)據(jù)庫中基于CRs 的特征在5 年時的AUC 為0.778，見圖3（插頁）。利用熱圖顯示高風險組和低風險組之間16 種CRs 的差異，見圖4（插頁）。

圖1 乳腺癌前50 個差異表達CRs 的熱圖

圖2 前20 個預(yù)后基因的森林圖

圖3 TCGA-乳腺癌數(shù)據(jù)集基于預(yù)后CRs 的模型分析（A：Kaplan-Meier 高風險與低風險組乳腺癌患者生存分析；B：基于中位Risk score 的生存狀態(tài)分布；C：總生存期Risk score 的時間依賴性ROC 曲線）

圖4 高風險組和低風險組之間16 種CRs 差異的熱圖

2.2 基于CRs 特征構(gòu)建的風險模型與乳腺癌患者臨床特征之間的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，該風險模型在預(yù)測高風險組和低風險組乳腺癌患者不同臨床特征中的預(yù)后方面具有明顯差異，相關(guān)性熱圖見圖5（插頁）。Kaplan-Meier 生存曲線分析得出，低風險組患者中年齡≤65 歲、StageⅠ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期、T0～T1、T2～T3、N0～N1、N2～N3者OS 均高于高風險組患者（均P＜0.05），但兩組患者中年齡＞65 歲者OS 比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.170），見圖6。

圖5 基于CRs 構(gòu)建的預(yù)后Risk score 與乳腺癌患者的不同臨床特征之間相關(guān)性分析的熱圖

圖6 不同臨床特征高風險組和低風險組患者的Kaplan-Meier 生存曲線（A：年齡≤65 歲；B：年齡＞65 歲；C：N0～N1期；D：N2～N3期；E：Stage Ⅰ～Ⅱ期；F：Stage Ⅲ～Ⅳ期；G：T0～T1期；H：T2～T3期）

2.3 預(yù)測乳腺癌患者生存率的列線圖 結(jié)合Risk score 以及其他臨床變量（患者年齡、癌癥分期、T 分類和N 分類）構(gòu)建的列線圖見圖7A。為驗證該預(yù)測模型的可行性和準確性，進一步采用校準曲線，結(jié)果表明預(yù)測模型在1、3 和5 年生存率的預(yù)測上與實際觀察到的生存率高度一致，見圖7B。

圖7 預(yù)測乳腺癌患者生存率的列線圖與校準曲線（A：基于多因素的乳腺癌患者1、3 和5 年的生存率預(yù)測的列線圖；***表示這兩個變量在Cox 比例風險模型中對于預(yù)測結(jié)果有非常顯著的影響；B：列線圖的校準曲線圖）

2.4 相關(guān)基因在腫瘤組織與正常乳腺組織中的基因表達差異采用limma 軟件統(tǒng)計分析乳腺癌組織與正常乳腺組織之間的基因表達差異，識別在疾病進程中顯著上調(diào)或下調(diào)的關(guān)鍵CRs，其中ACTL6B、ASCL1、CHEK1、FBXL19、FOXA1、HMGB3、IDH2、MAZ、RAD54B、SMYD3、TDRD12、TDRKH、TONSL、UBE2T 在腫瘤組中顯著高表達，而MECOM 在腫瘤組中顯著低表達。

3 討論

乳腺癌是全球最常見的女性惡性腫瘤，其復(fù)雜性和對其發(fā)生及進展的有限了解使得其預(yù)后和治療具有挑戰(zhàn)性。盡管CRs 在乳腺癌的發(fā)生中已被證明具有多種功能，但對其在乳腺癌中的臨床意義的綜合分析仍然很少。

本研究通過利用生物信息學工具，從TCGA 數(shù)據(jù)庫中篩選出了127 個在乳腺癌組織和正常乳腺組織之間差異表達的CRs。這些CRs 的差異表達可能與乳腺癌的發(fā)病機制、預(yù)后和治療有關(guān)。隨后，進一步分析確定了16 個與乳腺癌預(yù)后顯著相關(guān)的CRs，并基于這些CRs 構(gòu)建了風險模型。該模型的生存率和ROC 曲線分析均顯示出良好的預(yù)測效能，為臨床醫(yī)師提供了一個新的工具來評估乳腺癌患者的預(yù)后。

對于這些關(guān)鍵的CRs，如ACTL6B、ASCL1、CHEK1和FBXL19 等，它們在腫瘤中的作用已被廣泛研究[8-11]。例如，ACTL6B 在染色質(zhì)重塑和組蛋白乙?；衅鸬疥P(guān)鍵作用[12]，而CHEK1 則被認為是乳腺癌的潛在預(yù)后和治療靶點[13]。這些發(fā)現(xiàn)不僅增強了對乳腺癌發(fā)病機制的了解，還為未來的治療策略提供了新的方向。

然而，本研究也存在一些局限性，如CRs 如何調(diào)控乳腺癌細胞的生物學行為仍需要進一步的實驗驗證。此外，為了驗證預(yù)后模型的實用性，還需要在多中心臨床隊列中進行進一步的研究。

綜上所述，本研究為了解乳腺癌的發(fā)病機制、預(yù)測預(yù)后以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了重要的線索。但為了將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床實踐，還需要進一步的研究和驗證。希望未來的研究能夠基于這些初步發(fā)現(xiàn)，進一步深化對乳腺癌的理解，為患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量。