澳洲堅(jiān)果抗菌肽分離純化及其肽段鑒定與分析

郭剛軍，胡小靜，馬尚玄，付鎵榕，繆?？?，肖縣田，黃克昌，賀熙勇

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所,云南景洪 666100；2.云南省澳洲堅(jiān)果農(nóng)業(yè)工程研究中心,云南景洪 666100；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院,云南文山 663099；4.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院,云南昆明 650201）

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一種天然低分子量多肽,一般由2～50 個(gè)氨基酸殘基組成,存在賴氨酸、精氨酸等殘基,并含有大于30% 的疏水性氨基酸[1],廣泛存在于細(xì)菌、植物、軟體動(dòng)物等體內(nèi)[2],可阻止外界微生物產(chǎn)生的侵害、清除體內(nèi)突變細(xì)胞[3],具有安全高效、熱穩(wěn)定性好、活性強(qiáng)與殺菌速度快等特點(diǎn)[4-5]。截至2019 年,已有8 000 多種抗菌肽被鑒定發(fā)現(xiàn),其中有2 000 多種是從天然產(chǎn)物中提取得到[6]。抗菌肽由于其天然的抗菌性能和較弱的細(xì)菌耐藥性,可替代化學(xué)防腐劑或抗生素等防腐抗菌藥物,如從洋麻和花椒種子蛋白水解物分離的抗菌肽已成功被用作防腐劑應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域[7-8]。

澳洲堅(jiān)果（Mɑcɑdɑmiɑintegrifoliɑ）又稱夏威夷果[9],其果仁含油高達(dá)65%～80%,蛋白質(zhì)含量8%～20%,還含有碳水化合物、鈣、磷、鐵、B 族維生素、煙酸、多酚、黃酮、生育酚、角鯊烯、甾醇等多種成分[10]。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì),2020 年全國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積為26.61 萬(wàn)hm2,隨著產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展,作為一種木本油料作物,澳洲堅(jiān)果油將成為重要的產(chǎn)品形式[11]。榨油后的副產(chǎn)物澳洲堅(jiān)果粕含有30%左右的蛋白質(zhì),通過(guò)酶法及相關(guān)分離純化技術(shù)制備功能肽是提高其利用率的有效途徑之一[7]。

在功能肽的制備方法中,酶法具有反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短、產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[12],通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)鞍酌?控制一定水解度,水解某些蛋白質(zhì)可得到生物活性多肽,這些活性肽除易被人體消化吸收外,還具有許多獨(dú)特生理功能,如抗菌、抗氧化、抗病毒、降血壓、降血脂、降膽固醇、促進(jìn)鈣吸收、免疫調(diào)節(jié)等,也可以作為藥物或者藥物的前體,是當(dāng)今科技界研究的一個(gè)熱點(diǎn)[13-14]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用酶解法篩選制備了諸多的抗菌肽。Daoud 等[15]用胃蛋白酶在低水解度下酶解牛血色素,經(jīng)純化制備了一個(gè)對(duì)藤黃微球菌、李斯特菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌均具有抗菌活性的多肽。Liu等[16]以牡蠣為原料,用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解,經(jīng)系列純化,得到一個(gè)富含半胱氨酸的抗菌肽Cg-Pep33,其能夠抑制多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)。在有關(guān)澳洲堅(jiān)果抗菌活性多肽研究中,周曉馥等[17]通過(guò)測(cè)定平均疏水性預(yù)測(cè)了澳洲堅(jiān)果多肽具有抗菌活性。馬尚玄等[18]研究發(fā)現(xiàn)采用堿性蛋白酶水解、透析袋分離制備的不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽中,分子量小于300 Da 的多肽對(duì)金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌抑菌活性較好。但有關(guān)澳洲堅(jiān)果抗菌肽分離純化及肽段序列分析鮮有研究。本研究利用堿性蛋白酶水解制備澳洲堅(jiān)果多肽,以抑菌活性為跟蹤指標(biāo),運(yùn)用超濾、大孔吸附樹脂、凝膠色譜分離技術(shù)純化篩選抗菌肽,并對(duì)其進(jìn)行肽段鑒定與氨基酸序列分析,以期為澳洲堅(jiān)果的深度利用和開發(fā)新型抗菌肽提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕:西雙版納云墾澳洲堅(jiān)果科技開發(fā)有限公司。

堿性蛋白酶（10 萬(wàn)U/g）:廣西南寧東恒華道生物科技有限公司；白色念珠菌（ATCC10231）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）:上海魯微科技有限公司；DA201-C型大孔吸附樹脂:廊坊淼陽(yáng)化工有限公司。G-25 型交聯(lián)葡聚糖凝膠:合肥博美生物科技有限公司；乙腈（≥99.9%）、超純水:美國(guó)Fisher Chemical 公司；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、碳酸氫銨、甲酸:美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、乙醇、檸檬酸、鹽酸、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸銅、三氯乙酸、亞硫酸氫鈉（均為分析純）:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 型毛細(xì)管高效液相色譜儀、Q Exactive?Hybrid Quadrupole-Orbitrap?型電噴霧-組合型離子阱、Orbitrap 型質(zhì)譜儀:美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Concentrator plus 型真空離心濃縮儀:德國(guó)艾本德公司；D1008 型掌上離心機(jī)、MX-S 型渦旋儀:美國(guó)Scilogex公司；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:德國(guó)IKA 集團(tuán)；H3-18KR型高速冷凍離心機(jī):湖南可成儀器設(shè)備有限公司；TD5AWS 型離心機(jī):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TUV1810 型紫外可見分光光度計(jì):上海佑科儀器儀表有限公司；CL90MM 型超濾杯:杭州九齡科技有限公司；SHZ-A 型振蕩器、YXQ-LS-50A 型立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSP-400 型生化培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-IG型單人凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司；8 mm×6 mm×10 mm 牛津杯:上海三麝實(shí)業(yè)有限公司；FiveEasy 型酸度計(jì)、ME204 型電子天平:瑞士梅特勒托利多公司；C-MAGHS7 型數(shù)顯加熱磁力攪拌器:艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 澳洲堅(jiān)果粗多肽的制備

按照文獻(xiàn)[7]的方法并略作修改,制備澳洲堅(jiān)果粗多肽。液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕經(jīng)溫度50 ℃烘干,粉碎,過(guò)60 目篩,以底物濃度110 g/L 比例調(diào)漿,加入堿性蛋白酶2 400 U/g（占堅(jiān)果粕質(zhì)量）,調(diào)節(jié)pH11.0,在45 ℃下恒溫水解3.5 h,反應(yīng)結(jié)束后,沸水滅酶10 min,冷卻至室溫,4 000 r/min 離心10 min,取上清液,調(diào)節(jié)pH4.6（蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）,靜置30 min,再于轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,真空濃縮,冷凍干燥,制得澳洲堅(jiān)果粗多肽。

1.3.2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的超濾分離

配制30 mg/mL 的澳洲堅(jiān)果多肽（macadamia nut peptide-0,MNP-0）溶液,然后采用截留分子量分別為10、5、1 kDa 的超濾膜逐級(jí)分離[19],得到分子量（Mr）>10 kDa MNP-1、5 kDa<分子量（Mr）<10 kDa MNP-2、1 kDa<分子量（Mr）<5 kDa MNP-3、分子量（Mr）<1 kDa MNP-4 4 種澳洲堅(jiān)果多肽組分,真空濃縮,冷凍干燥。以MNP-0 為對(duì)照,測(cè)定其多肽含量與抑菌活性。

1.3.3 DA201-C 型大孔吸附樹脂分離純化澳洲堅(jiān)果多肽

1.3.3.1 大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的靜態(tài)吸附與解吸

用無(wú)水乙醇浸泡大孔吸樹脂24 h,在波長(zhǎng)220 nm條件下洗至無(wú)吸收峰,然后采用蒸餾水洗凈。稱取15 g 濕樹脂,然后放置于250 mL 三角瓶中,加入15 mL 30 mg/mL 1.3.2 方法所得抑菌活性最強(qiáng)的超濾多肽組分,在溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min 的搖床中進(jìn)行振蕩吸附,每隔60 min 取樣1 次,測(cè)定其多肽含量,按公式（1）計(jì)算吸附率（W,%）,確定吸附平衡時(shí)間。

式中:ρ0為上樣多肽質(zhì)量濃度,mg/mL；ρ1為吸附后溶液多肽質(zhì)量濃度,mg/mL。

采用不同濃度乙醇對(duì)1.3.3.1 方法中多肽組分吸附平衡的大孔樹脂進(jìn)行洗脫,按公式（2）計(jì)算解吸率（Z,%）,確定乙醇溶液的適宜濃度。

式中:ρ0為上樣多肽質(zhì)量濃度,mg/mL；ρ1為吸附后溶液的多肽質(zhì)量濃度,mg/mL；ρ2為洗脫液的多肽質(zhì)量濃度,mg/mL；v1為吸附液體積,mL；v2為洗脫液體積,mL。

1.3.3.2 大孔樹脂吸附澳洲堅(jiān)果多肽的動(dòng)態(tài)洗脫

配制濃度為30 mg/mL 1.3.2 方法所得抑菌活性最強(qiáng)的超濾分離多肽組分溶液,經(jīng)大孔樹脂充分吸附后,抽濾,棄去未吸附的溶液,然后用去離子水以1 BV/h的流速洗滌層析柱至無(wú)吸收峰,之后用適宜濃度的乙醇洗脫劑以2 BV/h 的流速流經(jīng)層析柱,每6 mL 洗脫液收集一管,加入24 mL 雙縮脲試劑,在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,合并洗脫液,真空濃縮,冷凍干燥,備用。

1.3.4 交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 分離純化澳洲堅(jiān)果多肽

配制30 mg/mL 1.3.3.2 方法所制備的澳洲堅(jiān)果多肽溶液,在交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 柱上繼續(xù)進(jìn)行分離純化,上樣量為15 mL。以去離子水為洗脫液,洗脫流速為0.3 mL/min,采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液,每3 mL 收集一管,加入12 mL 雙縮脲試劑,用紫外可見分光光度計(jì)在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,收集各洗脫峰多肽組分,真空濃縮,冷凍干燥,得到澳洲堅(jiān)果純化多肽組分1（macadamia nut purified peptide-1,MPP-1）、MPP-2、MPP-3,測(cè)定其抑菌活性。

1.3.5 多肽含量與抑菌活性測(cè)定

澳洲堅(jiān)果多肽含量參考文獻(xiàn)[18]中的雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定；澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌抑菌活性參考文獻(xiàn)[20]中的牛津杯法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 澳洲堅(jiān)果抗菌肽LC-MS/MS 肽序列鑒定

將澳洲堅(jiān)果抗菌肽溶液加入二硫蘇糖醇溶液使其濃度為10 mmol/L,于37 ℃水浴中還原4 h,然后加入碘乙酰胺溶液使其濃度為50 mmol/L,避光反應(yīng)40 min,然后采用自填脫鹽柱脫鹽,45 ℃真空離心濃縮,揮干溶劑。將上述樣品溶解在200μL 2%乙腈（加0.1%甲酸）溶液中,通過(guò)Nano 液相系統(tǒng)和Orbitrap 質(zhì)譜系統(tǒng),使用分析柱（RP C18,75μm×150 mm）分析,流動(dòng)相A:2% 乙腈（加0.1%甲酸）,流動(dòng)相B:80% 乙腈（加0.1%甲酸）組成,以300 nL/min 的流速分離,分析時(shí)間為78 min。采用正離子檢測(cè)法,離子傳輸毛細(xì)管溫度為325 ℃,母離子掃描范圍為m/z 350～1 800,選擇母離子top 20 進(jìn)行二級(jí)碎裂,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間18 s。使用Maxquant（1.6.2.10）檢索uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù),檢索參數(shù)如下。固定修飾:Carbamidomethyl（C）；可變修飾:Oxidation（M）；酶:non-specific；遺漏酶切位點(diǎn):2；一級(jí)質(zhì)譜誤差:20 ppm；二級(jí)質(zhì)譜誤差:0.6 Da；肽段/碎片離子質(zhì)量數(shù):Monoisotopic（單同位素）；顯著性閾值:0.01[8,21]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 軟件處理,應(yīng)用鄧肯氏法進(jìn)行顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著。用Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理。試驗(yàn)均重復(fù)3 次,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離的不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽質(zhì)量分布

不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽在所有多肽中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖1。

圖1 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽在所有多肽中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Mass fraction of macadamia nut polypeptides with different molecular weight in all peptides by ultrafiltration

由圖1 可知,通過(guò)超濾分離,不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽在所有多肽中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,其中MNP-4 多肽占比最高,達(dá)到29.55%,與其他分子量多肽存在顯著性差異（P<0.05）,其次是MNP-3 與MNP-1 多肽,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.11% 與24.44%,兩者之間也存在顯著性差異（P<0.05）,MNP-2 多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,僅為18.90%。

2.2 超濾分離的不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽抑菌活性

不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抑菌活性見圖2。

圖2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of macadamia nut polypeptides with different molecular weight by ultrafiltration

由圖2 可知,MNP-0 與超濾分離的不同分子量多肽對(duì)受試細(xì)菌（金黃色葡萄球菌）與真菌（白色念珠菌）呈現(xiàn)出不同的抑菌活性。其中多肽MNP-4 對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最好,抑菌圈直徑達(dá)到10.01 mm,與多肽MNP-0 及其他分子量多肽存在顯著性差異（P<0.05）；其次是多肽MNP-0,其抑菌圈直徑為8.26 mm；抑菌活性最低的為多肽MNP-3,其抑菌圈直徑僅為4.29 mm。多肽MNP-4 對(duì)白色念珠菌抑菌活性也最好,抑菌圈直徑達(dá)到9.41 mm,與多肽MNP-0 及其他分子量多肽存在顯著性差異（P<0.05）；其次是多肽MNP-0,其抑菌圈直徑為7.64 mm；抑菌活性最差的為多肽MNP-1,抑菌圈直徑僅為5.15 mm。由上述分析可知,對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌抑菌活性最好的均為多肽MNP-4,選擇對(duì)其進(jìn)一步分離純化。Chang 等[22]研究發(fā)現(xiàn),多肽的分子量是影響蛋白肽生物活性的關(guān)鍵因素,分子量越小抗菌活性越高,這與本研究結(jié)果整體一致。

2.3 DA201-C 型大孔吸附樹脂分離純化澳洲堅(jiān)果多肽

2.3.1 大孔吸附樹脂對(duì)多肽的靜態(tài)吸附

大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的靜態(tài)吸附曲線見圖3。

圖3 大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Curves for static adsorption of macadamia nut polypeptides on DA201-C macroporous resin adsorption

由圖3 可知,隨著靜態(tài)吸附平衡時(shí)間的延長(zhǎng),大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 的吸附率在前1 h 大幅增加,1～3 h 緩慢增加,3 h 以后達(dá)到吸附平衡狀態(tài),在吸附3 h 時(shí)的吸附率達(dá)到68.00%。由此可知DA201-C 型大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 的吸附屬于快速平衡型,其不僅是利用多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及高比表面積形成的分子篩作用,而且是通過(guò)范德華力或氫鍵相互作用結(jié)合的[23]。因此,大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 的吸附平衡時(shí)間選擇為3 h。

2.3.2 洗脫劑濃度對(duì)多肽解吸率的影響

乙醇溶液濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽解吸率的影響見圖4。

圖4 乙醇溶液濃度對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽解吸率的影響Fig.4 Effect of ethanol solution concentration on macadamia nut polypeptides desorption rate

洗脫劑選擇醇類物質(zhì)較佳,因其具有解吸效率高、易于蒸餾回收、節(jié)能、價(jià)廉和毒性小等優(yōu)點(diǎn)[24]。由圖4可知,隨著洗脫劑乙醇溶液濃度的增加,澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 的解吸率呈先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)乙醇溶液濃度為75%時(shí),解吸率達(dá)到最大值,為88.65%。這是因?yàn)楫?dāng)多肽MNP-4 溶于水時(shí),大孔樹脂對(duì)其吸附作用大于多肽與水之間的作用,多肽被吸附在樹脂上；當(dāng)用乙醇溶液洗脫時(shí),多肽與乙醇溶液間的作用大于其與大孔樹脂間的吸附作用,多肽被洗脫下來(lái)。乙醇溶液濃度越高,多肽與大孔樹脂之間范德華力越小,解吸率越高,當(dāng)乙醇溶液濃度過(guò)高時(shí),解吸劑中的含水量較少,多肽難以溶出,解吸率反而降低[23]。因此,選擇濃度為75% 的乙醇溶液為澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 的洗脫劑。

2.3.3 大孔吸附樹脂對(duì)多肽的動(dòng)態(tài)洗脫

大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的動(dòng)態(tài)洗脫曲線見圖5。

圖5 大孔吸附樹脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.5 Curves for dynamic elution of macadamia nut polypeptides on DA201-C macroporous resin adsorption

由圖5 可知,隨著洗脫液流出體積的增大,洗脫液的多肽含量吸光值呈現(xiàn)先迅速增大后迅速減小,最后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)流出液體積為6 mL 時(shí)即有少量多肽被洗出,隨后洗脫液中的多肽含量吸光度急劇上升,在24 mL 左右時(shí)達(dá)到最大值,之后的洗脫液中,多肽吸光度又出現(xiàn)急劇下降,當(dāng)洗脫液達(dá)到60 mL 時(shí),多肽基本被洗脫完全,故吸光度較低。因此,選擇的洗脫體積為60 mL。

2.4 交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 分離純化澳洲堅(jiān)果多肽

澳洲堅(jiān)果多肽交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 洗脫曲線見圖6。

圖6 澳洲堅(jiān)果多肽交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 洗脫曲線Fig.6 Elution profile of macadamia nut polypeptides by crosslinked dextran gel Sephadex G-25

凝膠過(guò)濾可用于分離水溶性的物質(zhì),如多糖、蛋白、多肽等化合物,還可用于脫鹽。由圖6 可知,從交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 中主要洗脫出3 個(gè)多肽峰組分,分別記為MPP-1、MPP-2 和MPP-3,各個(gè)峰的洗脫體積分別為0～21、21～66 mL 與66～168 mL,分別收集3 個(gè)多肽組分的洗脫液,真空濃縮,冷凍干燥,待進(jìn)一步測(cè)定分析。

2.5 交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 分離純化的澳洲堅(jiān)果多肽組分抑菌活性

澳洲堅(jiān)果多肽Sephadex G-25 純化后各組分的抑菌活性見圖7。

圖7 澳洲堅(jiān)果多肽Sephadex G-25 純化后各組分的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of different macadamia nut polypeptide fractions purified by cross-linked dextran gel Sephadex G-25

由圖7 可知,交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 分離純化的3 個(gè)澳洲堅(jiān)果多肽組分中,多肽組分MPP-2 對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均具有最強(qiáng)的抑菌活性,其抑菌圈直徑分別達(dá)到18.67 mm 與16.83 mm,與多肽組分MPP-1 與MPP-3 存在顯著性差異（P<0.05）,優(yōu)于多肽MNP-0 與超濾分離多肽組分,其次是多肽組分MPP-1,其抑菌圈直徑分別為12.33 mm 與10.52 mm,最差的為多肽組分MPP-3,其對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均無(wú)抑菌活性。因此,選擇對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽組分MPP-2 進(jìn)一步進(jìn)行肽段鑒定與氨基酸序列分析。

2.6 澳洲堅(jiān)果抗菌肽肽段鑒定與氨基酸序列分析

澳洲堅(jiān)果抗菌肽MPP-2 的總離子流色譜圖見圖8,澳洲堅(jiān)果抗菌肽MPP-2 肽段組成與氨基酸序列見表1,WDL、FDW 的質(zhì)譜圖見圖9。N 端帶電片段離子分類為a、b 或c,C 端帶電片段離子分類為x、y 或z。

表1 澳洲堅(jiān)果抗菌肽MPP-2 肽段組成與氨基酸序列Table 1 Composition and amino acid sequence of antimicrobial peptide MPP-2 from macadamia nuts

圖8 澳洲堅(jiān)果抗菌肽MPP-2 的總離子流色譜圖Fig.8 Total ions chromatography of antimicrobial peptide MPP-2 from macadamia nuts

圖9 WDL、FDW 的質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectra of WDL and FDW

一般來(lái)說(shuō),具有抗菌活性的多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)具有共有的特點(diǎn),N 端富含賴氨酸、組氨酸和精氨酸等陽(yáng)離子型氨基酸,相對(duì)來(lái)說(shuō)其含有的陽(yáng)離子型氨基酸越多,抗菌活性越大；C 端富含丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸等非極性氨基酸,中間部分則富含脯氨酸,在β 折疊型結(jié)構(gòu)類與伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類中的抗菌肽均富含脯氨酸[18,25]。由圖8、圖9、表1 可知,經(jīng)液相色譜分離,一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜鑒定,澳洲堅(jiān)果多肽組分MPP-2 含有DDLTDPAPA、VLL、WDY、VPV、WDL、LLW、LWL、FDW 8 個(gè)肽段,其均含有具有抗菌作用的氨基酸,其中,DDLTDPAPA 含有亮氨酸（L）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）,VLL 含有纈氨酸（V）、亮氨酸（L）,WDY 含有色氨酸（W）,VPV 含有脯氨酸（P）、纈氨酸（V）,WDL、LLW、LWL 均含有亮氨酸（L）、色氨酸（W）,FDW 含有苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）。疏水性和凈電荷是影響抗菌肽活性的重要因素[26],通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophilicity.php 檢索查詢,肽段DDLTDPAPA、VLL、VPV、WDL、LLW、LWL、FDW 的疏水率均大于50%[8],符合抗菌肽的疏水性特征。盡管諸多的陽(yáng)離子抗菌肽的研究被報(bào)道[1,5],但陰離子抗菌肽也具有很強(qiáng)的抗菌活性,Song 等[27]從半鰭鳳尾魚水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中分離得到2 個(gè)陰離子抗菌肽RVAPEEHPTL 與FFTQATDLLSR,其對(duì)細(xì)菌具有很強(qiáng)的抗菌活性。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.innovagen.com/proteomics-tools 檢索查詢,肽段DDLTDPAPA、WDY、WDL、FDW 均帶有不同程度的負(fù)電荷,其中,肽段DDLTDPAPA 帶有3 個(gè)負(fù)電荷,WDY、WDL、FDW 均帶有1 個(gè)負(fù)電荷,符合陰離子抗菌肽的凈電荷特征。綜合肽段的抗菌氨基酸、疏水性與凈電荷分析來(lái)看,分離純化的澳洲堅(jiān)果抗菌活性多肽中屬于抗菌肽的肽段可能為DDLTDPAPA、WDL、FDW。通過(guò)抗菌肽的收集數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.camp.bicnirrh.res.in/predict/）,采用支持向量機(jī)（support vector machines,SVM）算法進(jìn)一步預(yù)測(cè)分析,DDLTDPAPA、WDL、FDW 屬于抗菌肽的概率得分a（1.00≥a≥0.50）分別為0.27、1.00 與1.00,表明肽段WDL 與FDW 屬于抗菌肽,其一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖（圖9）顯示疏水率均為66.67%,均帶有1 個(gè)負(fù)電荷,等電點(diǎn)分別為0.69 與0.67,并具有較好的溶解性。

3 結(jié)論

采用超濾技術(shù)將堿性蛋白酶水解制備澳洲堅(jiān)果多肽分離為4 種不同分子量的多肽組分,其在所有多肽中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同,抑菌活性也有所差異。其中,澳洲堅(jiān)果多肽MNP-4 質(zhì)量占比最高,對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的抑菌活性最強(qiáng)。經(jīng)大孔樹脂、交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 對(duì)其進(jìn)行分離純化后,獲得的3 個(gè)多肽組分中,多肽組分MPP-2 對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的抑菌活性最強(qiáng),優(yōu)于多肽MNP-0 與超濾分離的多肽組分。通過(guò)Nano 液相色譜系統(tǒng)分離、Orbitra 質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定及抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析,分離純化的澳洲堅(jiān)果抗菌活性多肽MPP-2 由DDLTDPAPA、VLL、WDY、VPV、WDL、LLW、LWL、FDW 8 個(gè)肽段組成,經(jīng)分析預(yù)測(cè),屬于抗菌肽的肽段為WDL 與FDW,其擁有較高的疏水率,帶有一定的負(fù)電荷,等電點(diǎn)較低,具有較好的溶解性,下一步可進(jìn)行肽段生物合成,評(píng)價(jià)驗(yàn)證其抗細(xì)菌、真菌等活性,進(jìn)一步篩選獲得活性更強(qiáng)的抗菌肽,為澳洲堅(jiān)果功能肽產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。