同時(shí)快速檢測(cè)蔬菜中百菌清和多菌靈的膠體金免疫層析法

許奐源，梁植雯，許景皓，黃葦，尹青春，李斌，江林峰，郭美媛，徐振林*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642；2.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全）,海南海口 570314；3.廣州萬(wàn)聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510670；4.廣東康輝集團(tuán)有限公司,廣東潮州 515638）

百菌清（chlorothalonil,CTN）是一種高效、低毒、廣譜的非內(nèi)吸性有機(jī)氯殺菌劑,是全球第二大常用殺菌劑,也是我國(guó)常用的殺菌劑之一[1-2],由于其在植物表面有良好的黏著性,具有較長(zhǎng)的藥效期,被廣泛應(yīng)用于果蔬病害的防治。研究表明,百菌清具有蓄積毒性,人體長(zhǎng)期暴露并接觸百菌清會(huì)引起職業(yè)性哮喘、皮膚病等疾病,百菌清對(duì)魚(yú)類(lèi)及水生脊椎動(dòng)物也存在毒害作用,此外,百菌清的高毒性和持久性也會(huì)對(duì)環(huán)境和食品安全造成嚴(yán)重的影響[3-4]。多菌靈（carbendazim,CBZ）是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性苯并咪唑類(lèi)殺菌劑,能夠?qū)σ呀?jīng)受到真菌病害的植物進(jìn)行內(nèi)吸治療[5]。除此之外,多菌靈還被廣泛用于造林、園藝等行業(yè)。研究表明,多菌靈對(duì)水生動(dòng)物及哺乳動(dòng)物具有生殖毒性、致突變性、致癌性,還會(huì)引起人體的肝病和染色體畸變[6]。在殺菌劑的使用方面,因?yàn)閱我恢苿┑拈L(zhǎng)期連續(xù)使用,會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性,因此,一般會(huì)采用百菌清對(duì)植物進(jìn)行病害防治、采用多菌靈進(jìn)行病害治療,交替使用,以達(dá)到最佳的防治效果,導(dǎo)致存在百菌清、多菌靈含量超標(biāo)現(xiàn)象[7-9]。

由于百菌清和多菌靈存在毒性,世界衛(wèi)生組織在2017 年已將百菌清列為2B 類(lèi)致癌物。歐盟禁止百菌清和多菌靈使用,GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定大部分蔬菜中百菌清和多菌靈的最大殘留限量分別為0.2～5.0 mg/kg 和0.5～5.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定百菌清為水源水和飲用水的必檢項(xiàng)。許多國(guó)家均制定了相應(yīng)的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。百菌清、多菌靈毒性雖低,短時(shí)間內(nèi)無(wú)不良反應(yīng),但是長(zhǎng)時(shí)間的蓄積以及其毒性的協(xié)同作用,會(huì)對(duì)人體造成加倍的傷害。因此在蔬菜和其他食品的安全監(jiān)測(cè)中,同時(shí)針對(duì)百菌清和多菌靈的殘留檢測(cè)非常重要。

目前,百菌清、多菌靈殘留的檢測(cè)方法主要為儀器分析法,包括氣相色譜（gas chromatography,GC）法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[12-13]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）法[14-15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法[16-17]等。這些方法均具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,但由于昂貴的使用成本、復(fù)雜的操作等局限了其應(yīng)用。對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)而言,基于抗原-抗體特異性結(jié)合的膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immuno-chromatography assay,GICA）因其具有靈敏、易操作、高通量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[18]。目前,針對(duì)百菌清、多菌靈的快速檢測(cè)方法均為單一對(duì)象的檢測(cè)方法,例如郭乃菲等[19]利用兔多抗建立了百菌清間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA）法,萬(wàn)積成等[20]建立了百菌清膠體金免疫層析檢測(cè)法,蔣文慧等[21]通過(guò)制備的單克隆抗體建立的多菌靈酶聯(lián)免疫吸附法,陳美蓮等[22]建立了多菌靈膠體金免疫層析檢測(cè)法,同時(shí)檢測(cè)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究制備識(shí)別百菌清和多菌靈的特異性單克隆抗體,并建立一種快速同時(shí)檢測(cè)百菌清和多菌靈的雙信號(hào)膠體金免疫層析方法,系統(tǒng)優(yōu)化影響性能與穩(wěn)定性的各種檢測(cè)條件,最后用于番茄、黃瓜、包菜等蔬菜樣品的實(shí)際檢測(cè),以期滿(mǎn)足快速檢測(cè)蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的現(xiàn)場(chǎng)大批量篩查的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本墊、硝酸纖維（nitrocellulose filter,NC）膜、吸水墊和聚氯乙烯底板:上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；氯金酸、檸檬酸三鈉、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）、百菌清標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%）:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；金標(biāo)復(fù)溶液:廣州萬(wàn)聯(lián)生物科技有限公司；羊抗鼠二抗:北京全式金生物技術(shù)有限公司；6-氨基己酸、氫氧化鈉、N,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）:上海麥克林生化科技有限公司；鑰孔血藍(lán)蛋白、乳鐵蛋白、牛血清白蛋白、蔗糖、吐溫-20:默克化工技術(shù)（上海）有限公司；Balb/c 小鼠:珠海百事通生物技術(shù)有限公司；黃瓜、番茄、包菜:市售；以上試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

劃膜儀（HGS510）、裁條機(jī)（HGS201）、金標(biāo)讀數(shù)儀（GIC-Q）:杭州峰航科技有限公司；烘箱（SKFG-01）:湖北恒豐醫(yī)療制藥設(shè)備有限公司；低溫高速離心機(jī)（CR22N）:德國(guó)Eppendorf 公司；MS 漩渦振蕩器（MS3 basic）:德國(guó)IKA 公司；高效液相色譜儀（2695）:美國(guó)Waters 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 百菌清、多菌靈半抗原的合成

百菌清半抗原H1 合成路線如圖1（a）所示。稱(chēng)取2.65 g 百菌清固體、0.3 g 6-氨基己酸、0.3 g 氫氧化鈉溶于40 mL DMF,80 ℃加熱攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后,用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至8 左右,用二氯甲烷萃取除去未反應(yīng)完全的原料和雜質(zhì)后,用正丁醇萃取水相后,有機(jī)層減壓蒸發(fā),干燥后得到百菌清半抗原H1。

圖1 百菌清、多菌靈半抗原合成路線Fig.1 Synthetic routes of chlorothalonil and carbendazim hapten

百菌清半抗原H2合成路線如圖1（b）所示。稱(chēng)取2.65 g百菌清固體、0.25 g 甘氨酸和0.23 g 氫氧化鈉溶于40 mL DMF,合成方法與上述流程一致,得到百菌清半抗原H2。

多菌靈半抗原H1 合成路線如圖1（c）所示。在低溫下,將1.92 g 多菌靈固體緩慢加入到5 mL 的氯磺酸中,升溫至40 ℃反應(yīng)2.5 h,制得多菌靈-氯磺酸溶液。冰浴攪拌下,將上述制得的多菌靈-氯磺酸溶液滴入50 mL 95% 乙醇中,形成乳白色懸濁液,將反應(yīng)液過(guò)濾,濾液用冷乙醇洗滌后,干燥,得到白色中間產(chǎn)物1。

在室溫下,將8 mL 甲酸、12 mL 蒸餾水和5 mL 48% 氫溴酸加進(jìn)100 mL 圓底燒瓶中,再依次加入3 g白色中間產(chǎn)物1 和1 g 鋁粉,升溫至65 ℃反應(yīng)1.5 h,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液過(guò)濾,用50%氫氧化鈉溶液將濾液pH 值調(diào)節(jié)至3 左右,室溫反應(yīng)12 h。將反應(yīng)液過(guò)濾,濾渣依次用蒸餾水和甲醇洗滌,抽干后于室溫晾干,得到中間產(chǎn)物2。

在室溫下,將0.5 g 氫氧化鈉、10 mL 蒸餾水,0.56 g 中間產(chǎn)物2 和0.46 g 溴丁酸依次加入100 mL干凈圓底燒瓶中,40 ℃攪拌反應(yīng)1.5 h 后將反應(yīng)液過(guò)濾,濾液用6 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7 左右,生成白色固體,持續(xù)室溫?cái)嚢?2 h 后將反應(yīng)液過(guò)濾,濾渣用蒸餾水洗滌,抽干并干燥,得到多菌靈半抗原H1。

多菌靈半抗原H2 合成路線如圖1（d）所示。將1.0 g 多菌靈固體溶解于5 mL 濃硫酸中,在冰浴攪拌下滴加5 mL 濃硝酸,低溫下持續(xù)攪拌30 min,升溫至室溫,繼續(xù)反應(yīng)2 h。在冰浴下用20% 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至8 左右,有黃色固體生成,65 ℃下減壓濃縮部分溶劑,繼續(xù)低溫?cái)嚢?0 min,過(guò)濾,濾渣用蒸餾水洗滌,抽干并干燥,得到棕黃色中間產(chǎn)物1。

將棕黃色中間產(chǎn)物1、鋅粉和濃鹽酸按照摩爾比為1∶1.2∶1 依次加入30 mL 甲醇溶液中。在70 ℃下回流4 h,反應(yīng)完成后將反應(yīng)液減壓蒸發(fā)除去甲醇溶液后,用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值調(diào)節(jié)至8 左右,用二氯甲烷萃取,有機(jī)層減壓蒸發(fā),干燥后得到多菌靈半抗原H2。

1.3.2 百菌清、多菌靈單克隆抗體的制備

將百菌清半抗原H1、多菌靈半抗原H1 作為免疫半抗原,分別采用活潑酯法偶聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）和乳鐵蛋白（lactoferrin,LF）形成免疫原CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF,百菌清半抗原H2、多菌靈半抗原H2 作為包被半抗原,分別采用活潑酯法和戊二醛法偶聯(lián)牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和形成包被原CTN-H2-BSA 和CBZ-H2-BSA。

用CTN-H1-KLH 和CBZ-H1-LF 免疫Balb/c 小鼠,通過(guò)采用ic-ELISA 法測(cè)定小鼠血清的效價(jià)以及對(duì)目標(biāo)分析物的抑制率,根據(jù)結(jié)果選擇免疫效果最好的小鼠進(jìn)行聚乙二醇介導(dǎo)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),將其脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞按5∶1 的比例融合形成雜交瘤細(xì)胞,采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng),選擇能夠穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并制備抗體。通過(guò)ic-ELISA 的方法分析比較抗體對(duì)百菌清、多菌靈及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的特異性。交叉反應(yīng)率（Y,%）按下式計(jì)算。

式中:X0為目標(biāo)待測(cè)物ic-ELISA 方法IC50值；Z0為結(jié)構(gòu)類(lèi)似物ic-ELISA 方法IC50值。

1.3.3 GICA 方法的建立

1.3.3.1 膠體金探針的制備

采用檸檬酸三鈉還原法合成膠體金探針[23-24],準(zhǔn)確量取100 mL 超純水?dāng)嚢杓訜嶂练序v后加入4 mL 的10.0 g/L氯金酸溶液,待再次沸騰時(shí)加入4 mL 的10.0 g/L 檸檬酸三鈉溶液,保持溶液在沸騰溫度下加熱10 min 直至顏色變成酒紅色后停止加熱,繼續(xù)攪拌到其冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移到潔凈的玻璃瓶中置于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 金標(biāo)抗體的制備

分別用方法1.3.2 所制備的抗百菌清單克隆抗體、抗多菌靈單克隆抗體對(duì)方法1.3.3.1 所制備的膠體金探針進(jìn)行標(biāo)記,具體標(biāo)記方法:用0.1 mol/L K2CO3溶液將膠體金溶液調(diào)節(jié)至合適的pH 值,加入一定量的抗體振蕩混勻后,室溫反應(yīng)10 min。加入40μL 100.0 g/L BSA 溶液振蕩混勻后,室溫反應(yīng)30 min 封閉未結(jié)合抗體的位點(diǎn)。在4 ℃、9 500 r/min 的條件下離心10 min,棄上清液,加入金標(biāo)復(fù)溶液復(fù)溶,分別獲得金標(biāo)百菌清抗體以及金標(biāo)多菌靈抗體。將制備好的兩種金標(biāo)抗體按照1∶1（體積比）混勻后,分裝包被在96 孔酶標(biāo)板中,37 ℃過(guò)夜烘干,于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 試紙條的組裝

將不同質(zhì)量濃度的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 和羊抗鼠IgG 固定于NC 膜上,形成兩條檢測(cè)T 線和一條質(zhì)控C 線,并于37 ℃干燥箱中干燥12 h。樣品墊經(jīng)樣品墊處理液均勻浸泡處理后于37 ℃干燥箱中干燥12 h。免疫層析試紙條由聚氯乙烯底板、吸水墊、NC膜和樣品墊組成。將其從上往下依次將吸水墊、NC膜、樣品墊組裝于聚氯乙烯底板上,用切條機(jī)切成4 mm 寬的試紙條,于干燥環(huán)境下避光儲(chǔ)藏。

1.3.3.4 檢測(cè)步驟及結(jié)果判定

取80μL 待測(cè)溶液加至含有金標(biāo)抗體的酶標(biāo)微孔中吹打復(fù)溶金標(biāo)抗體,室溫反應(yīng)3 min 后滴加至試紙條樣品墊孔中,室溫反應(yīng)5 min,金標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)定并進(jìn)行定量計(jì)算。如圖2 所示,對(duì)于無(wú)待測(cè)物的陰性樣本,檢測(cè)線T1、T2上的CTN-H2-BSA、CBZ-H2-BSA 會(huì)捕獲金標(biāo)抗體,形成兩條紅色的檢測(cè)T 線,C 線的羊抗鼠IgG 會(huì)捕獲剩余的金標(biāo)抗體,形成紅色的C 線。對(duì)于含有待測(cè)物的陽(yáng)性樣本,金標(biāo)抗體會(huì)優(yōu)先與待測(cè)物結(jié)合,導(dǎo)致T 線的顯色強(qiáng)度隨著待測(cè)物濃度的增加而變淺。當(dāng)試紙條的C 線無(wú)色,結(jié)果無(wú)效。

圖2 GICA 檢測(cè)示意圖Fig.2 Schematic diagram of GICA

1.3.4 GICA 檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)最佳的檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性與顯色效果,分別優(yōu)化標(biāo)記體系pH 值、抗體添加量、金標(biāo)抗體用量、T 線抗原包被濃度、樣品墊處理液中離子濃度、BSA濃度、吐溫-20 濃度、蔗糖濃度及樣品前處理?xiàng)l件。在優(yōu)化過(guò)程中,采用金標(biāo)讀數(shù)儀讀取試紙條T 線和C 線的信號(hào)值并進(jìn)行計(jì)算,對(duì)比試紙條的T/C 值以及抑制率進(jìn)行優(yōu)化選擇。抑制率（Y,%）按下式計(jì)算。

式中:B0為陰性樣品T 線和C 線信號(hào)強(qiáng)度比值；BX為陽(yáng)性樣品T 線和C 線信號(hào)強(qiáng)度比值。

1.3.5 試紙條的性能評(píng)價(jià)

1.3.5.1 靈敏度

用上述GICA 檢測(cè)條件優(yōu)化所得的藥物稀釋液配制一系列不同濃度的百菌清（0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/kg）和多菌靈（0、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250μg/kg）標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別取80 μL 用于試紙條檢測(cè),根據(jù)金標(biāo)讀數(shù)儀讀取試紙條的T/C 值,以縱坐標(biāo)為B/B0,橫坐標(biāo)為藥物濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 準(zhǔn)確性

選擇黃瓜、番茄、包菜3 種蔬菜樣品,分別添加百菌清和多菌靈（0、125、250、500 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依照優(yōu)化的樣品前處理方法和GICA 方法進(jìn)行提取檢測(cè),通過(guò)藥物加標(biāo)回收率以及變異系數(shù)對(duì)該法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。加標(biāo)回收率（Y,%）和變異系數(shù)（CV,%）計(jì)算公式如下。

式中:CX為藥物實(shí)測(cè)濃度,μg/kg；C0為藥物添加濃度,μg/kg；σ為加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)差；μ為加標(biāo)回收率的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2021 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析,使用Origin 2022 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗百菌清、抗多菌靈單克隆抗體性能鑒定

選擇保留百菌清的兩個(gè)氰基,從氰基鄰位的鹵素原子氯引入含羧基的間隔臂,合成免疫半抗原,采用縮短間隔臂長(zhǎng)度的策略合成了異源包被原。選擇保留多菌靈的苯并咪唑環(huán)和氨基甲酸酯基團(tuán)的完整性,從苯環(huán)的另一端引入含羧基的間隔臂,合成免疫半抗原,同樣地,引入氨基基團(tuán)合成了異源包被原。通過(guò)細(xì)胞融合、篩選、腹水制備純化抗體,所得到的兩株單克隆抗體性能見(jiàn)圖3。

圖3 ic-ELISA 曲線Fig.3 ic-ELISA curve

由圖3a 可知,抗百菌清抗體ic-ELISA 的IC50為0.12 ng/mL,檢測(cè)限（IC10）為0.02 ng/mL,檢測(cè)線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.04～0.35 ng/mL。由圖3b 可知,抗多菌靈抗體ic-ELISA 的IC50為1.93 ng/mL,檢測(cè)限（IC10）為0.29 ng/mL,檢測(cè)線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.58～6.44 ng/mL。

所得到的兩株單克隆抗體的亞型見(jiàn)圖4。

圖4 單克隆抗體亞型Fig.4 Monoclonal antibody subtype

由圖4 可知兩株單克隆抗體亞型均為IgG1。

單克隆抗體特異性見(jiàn)圖5。

圖5 單克隆抗體特異性Fig.5 Monoclonal antibody specificity

由圖5 可知,抗多菌靈單克隆抗體特異性對(duì)比其他選擇從氨基甲酸酯基團(tuán)端引入間隔臂的策略所制備的單克隆抗體,Yan 等[25]制備的單克隆抗體IC50值為0.45 ng/mL,本研究所得到的抗體特異性方面優(yōu)于其他抗體?？拱倬鍐慰寺】贵w識(shí)別的關(guān)鍵表位為氰基部分。Liu 等[26]所制備的單克隆抗體IC50值為0.36 ng/mL,其半抗原合成策略與本文相似,但本研究采用了異源包被原提升了檢測(cè)的靈敏度。而Okazaki 等[27]采用從無(wú)氰基的五氯苯酚引入間隔臂制得的單克隆抗體IC50值為0.4 ng/mL,但其對(duì)取代苯類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)率很高。這些數(shù)據(jù)提供了針對(duì)取代苯類(lèi)殺菌劑的半抗原設(shè)計(jì)思路,廣譜性抗體可從無(wú)氰基、保留鹵素原子氯的原料去進(jìn)行間隔臂的引入,單特異性抗體可從保留氰基的原料去進(jìn)行間隔臂的引入。

2.2 試紙條檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 標(biāo)記pH 值與抗體添加量

膠體金標(biāo)記抗體是通過(guò)靜電吸附作用將抗體結(jié)合包裹在膠體金顆粒表面,標(biāo)記體系的pH 值會(huì)影響抗體與膠體金顆粒的吸附效率以及抗體的生物活性[28]。因此通過(guò)添加不同量的0.1 mol/L K2CO3溶液來(lái)調(diào)節(jié)標(biāo)記體系的pH 值,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同0.1 mol/L K2CO3 溶液添加量的試紙條效果及探針顏色Fig.6 Effects of test strips and probe color with different 0.1 mol/L K2CO3 solution addition amount

由圖6 可知,當(dāng)標(biāo)記抗體為百菌清單克隆抗體時(shí),隨著K2CO3溶液添加量從10 μL 增加為14 μL,試紙條的T/C 值逐漸上升,而隨著K2CO3溶液添加量大于14 μL 時(shí),試紙條T/C 值驟降且靈敏度無(wú)明顯變化。當(dāng)標(biāo)記抗體為多菌靈單克隆抗體時(shí),隨著K2CO3溶液添加量從10 μL 增加到18 μL,試紙條的T/C 值逐漸下降,在K2CO3溶液添加量為10μL 時(shí),膠體金溶液發(fā)生了明顯的聚沉現(xiàn)象,而試紙條靈敏度在K2CO3溶液添加量為14μL 時(shí)表現(xiàn)為最佳。因此,在K2CO3溶液添加量為14μL 時(shí),兩個(gè)抗體都表現(xiàn)出了最佳的標(biāo)記效率。

在最適的pH 值條件下,不同抗體添加量對(duì)試紙條檢測(cè)性能的影響見(jiàn)圖7。

圖7 不同抗體添加量的試紙條效果Fig.7 Effects of test strips with different antibody addition amount

由圖7a 可知,當(dāng)標(biāo)記抗體為百菌清單克隆抗體時(shí),隨著抗體添加量從4μL 增加到6μL,試紙條的靈敏度逐漸上升,而抗體添加量大于6μL 時(shí)試紙條靈敏度驟降?？贵w添加量為4～8μL 時(shí),T/C 值上升,因此,選擇靈敏度最佳時(shí)的抗體添加量6μL 為最佳抗體添加量。由圖7b 可知,當(dāng)標(biāo)記抗體為多菌靈單克隆抗體時(shí),隨著抗體添加量的增加,試紙條的靈敏度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),試紙條的T/C 值整體平穩(wěn),當(dāng)抗體添加量分別為7 μL 和8 μL,試紙條的靈敏度與T/C 值均滿(mǎn)足要求且無(wú)明顯變化,考慮到加入太多抗體容易造成探針聚沉的影響[29-30],因此,選擇7μL 為最佳抗體添加量。

2.2.2 金標(biāo)抗體用量與T 線抗原包被濃度

對(duì)于試紙條的顯色效果及靈敏度,T 線抗原包被濃度以及金標(biāo)抗體用量也是兩個(gè)重要的影響因素。固定試紙條質(zhì)控C 線包被濃度為0.08 mg/mL,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金標(biāo)抗體用量與T 線抗原包被濃度優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization of gold-labeled antibody dosage and T-line antigen coating concentration

由表1 中T/C 值與抑制率可知,最佳組合為金標(biāo)抗體用量為15 μL/微孔、百菌清抗原包被濃度0.21 mg/mL、多菌靈抗原包被濃度1.50 mg/mL。在優(yōu)化的最佳參數(shù)下,試紙條整體的陰性顯色效果最佳,同時(shí)靈敏度最高,20 ng/mL 百菌清陽(yáng)性樣品抑制率為82.3%,125 ng/mL 多菌靈的陽(yáng)性樣品抑制率為69.3%。

2.2.3 試紙條樣品墊處理液優(yōu)化

在試紙條中樣品墊的主要作用為平衡待測(cè)樣品液的pH 值、鹽離子強(qiáng)度及保持層析的均一性和可控性,對(duì)試紙條的顯色效果、靈敏度有一定的影響[31-32]。

樣品墊緩沖液對(duì)試紙條檢測(cè)的影響見(jiàn)圖8。

圖8 樣品墊處理液對(duì)試紙條效果的影響Fig.8 Effect of sample pad treatment solution on the GICA performance

由圖8 可知,在離子濃度為0～0.2 mol/L 范圍內(nèi),試紙條T/C 值無(wú)明顯變化,但當(dāng)離子濃度為0.4 mol/L 時(shí),百菌清的靈敏度驟降,表明較高的離子濃度破壞了金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性。隨著B(niǎo)SA 濃度的增加,試紙條T/C 值無(wú)明顯變化,BSA 濃度為0.5%時(shí)試紙條抑制率最佳。隨著吐溫-20 濃度的增加,試紙條的T/C 值與靈敏度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),不含吐溫-20 時(shí)效果最佳。隨著蔗糖濃度的增加,試紙條T/C 值變深后無(wú)明顯變化,當(dāng)蔗糖濃度為0.5%時(shí),相比更高添加濃度,試紙條抑制率已達(dá)到最高。綜合試紙條顯色強(qiáng)度與靈敏度,樣品墊處理液最適配方為含有0.5%BSA 和0.5%蔗糖的0.1 mol/L 磷酸緩沖液。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

不同的樣品前處理?xiàng)l件將決定藥物的提取效率以及樣品基質(zhì)干擾的去除,對(duì)試紙條的靈敏度、前處理方法的可行性有著一定的影響,不同樣品前處理?xiàng)l件的影響見(jiàn)圖9。

圖9 不同前處理?xiàng)l件對(duì)試紙條效果的影響Fig.9 Effect of preprocessing conditions on GICA performance

2.3.1 提取溶劑選擇

為了達(dá)到較高的樣品中的藥物提取效率及降低樣品基質(zhì)所帶來(lái)的影響,探究了不同的樣品提取溶劑所帶來(lái)的影響。由圖9a 可知,當(dāng)選用正己烷、1% 乙酸-乙腈為提取溶劑時(shí),多菌靈的加標(biāo)回收率低于40%,百菌清的加標(biāo)回收率高于160%。選用乙腈和丙酮為提取溶劑時(shí),百菌清和多菌靈的加標(biāo)回收率為60%～120%,相比之下,丙酮為提取劑時(shí)的加標(biāo)回收率較高于乙腈為提取劑時(shí)的加標(biāo)回收率,因此,選擇丙酮為最佳樣品提取溶劑。

2.3.2 吸附劑的影響

在樣品前處理的過(guò)程中,有機(jī)溶劑在提取過(guò)程中會(huì)提取出除目標(biāo)藥物外的其他雜質(zhì),需要在后續(xù)處理中利用吸附劑吸附和消除樣品基質(zhì)中的糖類(lèi)、色素以及脂肪酸,以減少雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。由圖9b 可知,樣品提取液經(jīng)過(guò)N-丙基乙二胺（primary secondary amine,PSA）和石墨化碳黑（graphitized carbon black,GCB）處理后,百菌清的加標(biāo)回收率低于10%,多菌靈的加標(biāo)回收率也略有下降。說(shuō)明PSA 和GCB 對(duì)百菌清和多菌靈都有不同程度的吸附作用,未經(jīng)吸附劑處理的樣品提取液所測(cè)得的加標(biāo)回收率為60%～100%,因此,選擇不使用吸附劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行處理。

2.3.3 氮吹溫度的影響

在樣品前處理的過(guò)程中,氮吹溫度會(huì)對(duì)藥物提取效率有明顯的影響。由圖9c 可知,30 ℃的氮吹溫度下加標(biāo)回收率為80%～100%,而40 ℃和50 ℃的氮吹溫度下,百菌清的加標(biāo)回收率明顯下降,多菌靈的加標(biāo)回收率則幾乎沒(méi)有變化,因此,選擇氮吹最佳溫度條件為30 ℃。

2.4 試紙條性能評(píng)價(jià)

2.4.1 靈敏度

按照上述所優(yōu)化的最優(yōu)條件下,試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖10。

圖10 GICA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線及試紙條效果圖Fig.10 Standard curve and test strip effect diagram of GICA

由圖10 可知,本研究所建立的方法百菌清的檢測(cè)限為0.08 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.08～10.00 ng/mL；多菌靈的檢測(cè)限為1.95 ng/mL,檢測(cè)范圍為1.95～250.00 ng/mL。

2.4.2 實(shí)際樣品檢測(cè)

選擇黃瓜、番茄和包菜3 種樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),百菌清、多菌靈的添加濃度分別為125、250、500μg/kg,采用上述所優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品添加回收結(jié)果（n=3）Table 2 Recoveries of spiked samples（n=3）

由表2 可知,3 種樣品中百菌清的加標(biāo)回收率為79.2%～112.1%,變異系數(shù)為2.5%～18.9%；多菌靈的加標(biāo)回收率為63.3%～97.5%,變異系數(shù)為1.7%～17.5%。

3 結(jié)論

本文基于所制備得到的兩種能夠特異性識(shí)別百菌清、多菌靈的單克隆抗體,成功建立了可以同時(shí)快速、簡(jiǎn)便、靈敏檢測(cè)蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的雙信號(hào)膠體免疫層析法。該法對(duì)百菌清、多菌靈的檢測(cè)限分別為0.08 ng/mL 和1.95 ng/mL,線性范圍分別為0.08～10.00 ng/mL 和1.95～250.00 ng/mL。在黃瓜、番茄、包菜3 種樣品添加回收試驗(yàn)中百菌清的加標(biāo)回收率為79.2%～112.1%,多菌靈的加標(biāo)回收率為63.3%～97.5%,變異系數(shù)均低于18.9%,所需總檢測(cè)時(shí)間為20 min,表明本研究建立的膠體金免疫層析法具有靈敏、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于蔬菜中百菌清、多菌靈殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查中。