植物乳桿菌發(fā)酵核桃粕制備多肽及其抗氧化活性分析

何彩玲，顏玲，劉長虹*，馬愛進(jìn)，鄭磊

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽合肥 230031；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院,北京 100048）

核桃又名胡桃,是胡桃科胡桃屬的落葉喬木植物,世界四大堅(jiān)果之一[1]。核桃仁含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分,具有健腦益智、抗氧化、潤腸通便等功效[2]。核桃粕是核桃仁脫脂后的副產(chǎn)物,優(yōu)質(zhì)蛋白含量達(dá)到50%以上[3]。目前對(duì)核桃粕的利用大多停留在加工動(dòng)物飼料和肥料上[4],只有少量的核桃粕用于生產(chǎn)核桃蛋白粉、蛋白乳[5]等初級(jí)產(chǎn)品,對(duì)于核桃粕中的優(yōu)質(zhì)蛋白利用尚不夠充分。

通過酶解[6]或微生物發(fā)酵[7]核桃粕制備出的生物活性肽具有抗炎[8-9]、改善記憶損傷[10]、抗疲勞[11]等多種生理功能,可實(shí)現(xiàn)對(duì)核桃粕優(yōu)質(zhì)蛋白資源的充分利用。與單一的酶水解相比,微生物產(chǎn)生的蛋白酶多種多樣,在多種酶的共同作用下,效率更高[12],發(fā)酵法制備的多肽種類更多,生物活性潛力也更大。目前的研究中對(duì)于核桃活性多肽的制備大多利用酶解法,微生物發(fā)酵法制備核桃活性肽的研究相對(duì)較少。因此,本文以核桃仁低溫榨油脫脂后的核桃粕為原料,以植物乳桿菌為發(fā)酵菌株,利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵核桃粕制備核桃多肽的工藝條件,并通過超濾法將核桃多肽分為不同分子量多肽,對(duì)核桃多肽進(jìn)行體外抗氧化活性和氨基酸組成測(cè)定,以期為微生物發(fā)酵制備核桃多肽及其功能性開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌CICC20242:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

生核桃仁（蛋白質(zhì)含量20.40%）:市售,原產(chǎn)地新疆阿克蘇地區(qū)；MRS 培養(yǎng)基:合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；無水三氯化鐵:上海麥克林生化科技有限公司；過二硫酸鉀、鐵氰化鉀:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；還原型谷胱甘肽:生工生物工程（上海）股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）:梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）,ABTS]:上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷:北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。

BSC-400 培養(yǎng)箱:上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HGZF-11 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；GENESYS 10S 紫外可見分光光度計(jì)、VarioSkan Flash 酶標(biāo)儀:美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-12N 真空冷凍干燥機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司；URT210-C 氨基酸自動(dòng)分析儀:上海紫越網(wǎng)絡(luò)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 核桃粕制備

1.2.2.1 核桃仁榨油制備核桃粕核桃仁低溫（65 ℃）榨取油脂,再用正己烷浸泡脫脂后烘干。脫脂核桃粕粉碎過60 目篩[13]備用。

1.2.2.2 發(fā)酵菌懸液制備

植物乳桿菌活化三代,菌懸液在8 000×g、25 ℃離心10 min 后棄去上清液,使用無菌生理鹽水稀釋菌液至1×109CFU/mL。

1.2.2.3 核桃粕接菌液態(tài)發(fā)酵

將核桃粕與超純水混勻,滅菌冷卻后,取發(fā)酵菌種接入核桃粕溶液中,混勻后置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 多肽得率測(cè)定

參考王魯黔[14]的方法并稍作修改,以還原型谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品,采用雙縮脲法進(jìn)行多肽得率的測(cè)定。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用5%三氯乙酸配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品。配制為不同濃度（0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 mg/mL）標(biāo)品溶液,與雙縮脲反應(yīng)30 min 后,在540 nm 波長下測(cè)定吸光度,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.084x+0.008 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 多肽得率計(jì)算

取發(fā)酵后的核桃粕溶液,6 000×g、25 ℃離心5 min取上清液,加入等體積10% 的三氯乙酸,混勻后靜置10 min。8 000×g、25 ℃離心5 min 后取1 mL 上清液,加入1 mL 5% 的三氯乙酸混勻,取1 mL 混合液于10 mL 容量瓶中,用5% 三氯乙酸稀釋定容。取上述稀釋定容后的發(fā)酵液6 mL 與4 mL 雙縮脲試劑暗處反應(yīng)30 min,在540 nm 條件下測(cè)定吸光度。多肽得率（R,g/g）計(jì)算公式如下。

式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多肽濃度,mg/mL；V為核桃粕發(fā)酵液總體積,mL；N為稀釋倍數(shù)；M為發(fā)酵所用核桃粕的質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)核桃多肽得率的影響

在底物濃度5%、接種量8% 的條件下,分別考察不同發(fā)酵時(shí)間（24、48、72、96、120 h）對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵制備核桃粕多肽得率的影響。

1.2.4.2 接種量對(duì)核桃多肽得率的影響

在底物濃度5%、發(fā)酵時(shí)間72 h 的條件下,分別考察不同接種量（2%、5%、8%、11%、14%）對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵制備核桃粕多肽得率的影響。

1.2.4.3 底物濃度對(duì)核桃多肽得率的影響

在接種量8%、發(fā)酵時(shí)間72 h 的條件下,分別考察不同底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%）對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵制備核桃粕多肽得率的影響。

以上發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度根據(jù)菌種培養(yǎng)說明書選擇植物乳桿菌最適生長溫度為30 ℃。

1.2.4.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以發(fā)酵時(shí)間、接種量、底物濃度為試驗(yàn)因素,以多肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行核桃肽制備工藝的優(yōu)化,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 發(fā)酵核桃多肽及其低分子量多肽的制備

取發(fā)酵核桃粕8 000×g、25 ℃離心10 min 后的上清液,依次通過截留分子質(zhì)量為3 kDa 和10 kDa 的超濾管進(jìn)行分級(jí)分離得到分子質(zhì)量分別為<3 kDa、3～10 kDa 和>10 kDa 的發(fā)酵多肽液。發(fā)酵多肽液用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥[15],于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 核桃多肽體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參考羌宇等[16]的方法并稍作修改,準(zhǔn)確稱取未超濾的全組分、分子量<3 kDa、3～10 kDa 和>10 kDa 的多肽凍干粉,分別配制成不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）的多肽溶液,對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

取不同濃度的多肽溶液100 μL,加入100 μL DPPH 溶液,暗處靜置反應(yīng)30 min,使用酶標(biāo)儀在517 nm 處測(cè)定吸光度。DPPH 自由基清除率（H,%）計(jì)算公式如下。

式中:A1為樣品吸光度；A2為95% 乙醇溶液代替DPPH 溶液的吸光度；A0為超純水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

取180μL ABTS 工作液,加入20μL 多肽溶液,暗處反應(yīng)6 min,734 nm 波長處測(cè)定吸光度。ABTS+自由基清除率（B,%）計(jì)算公式如下。

式中:A1為樣品組吸光度；A2為超純水代替ABTS工作液的吸光度；A0為超純水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

參考倪慶圓[17]的方法,稍作修改。取0.05 mol/mL的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride,Tris-HCl]溶液225μL 于25 ℃預(yù)熱20 min,再加入50 μL 多肽溶液和20 μL 25 mmol/mL 的鄰苯三酚,25 ℃反應(yīng)5 min,迅速加入20 μL 濃鹽酸終止反應(yīng),在320 nm 波長處測(cè)定吸光度。超氧陰離子自由基清除率（O,%）計(jì)算公式如下。

式中:A1為樣品溶液的吸光度；A2為超純水代替鄰苯三酚的吸光度；A0為超純水代替多肽溶液的吸光度。

1.2.6.4 總還原能力測(cè)定

參考張會(huì)翠等[18]的方法,稍加改進(jìn)。向試管中加入2.5 mL pH6.8 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline,PBS）、1 mL 多肽溶液和2.5 mL 1% 的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min,冷卻后加入2 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng),8 000×g、25 ℃離心10 min 后取50μL 上清液,加入50 μL 超純水和50 μL 0.1% 的氯化鐵溶液,靜置反應(yīng)10 min,在700 nm 波長處測(cè)定吸光度?？傔€原能力（F,%）計(jì)算公式如下。

F=（A1-A0）× 100

式中:A1為樣品組的吸光度；A0為超純水代替上清液的吸光度。

1.2.7 氨基酸含量測(cè)定

氨基酸含量測(cè)定參考GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》[19],稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g 多肽粉末于蛋白水解管中,加入1.5 mL 6 mol/mL 鹽酸,反復(fù)抽真空、充高純氮?dú)夂竺芊?置于110 ℃數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中水解22 h。水解結(jié)束后過濾至5 mL 水解管中,用超純水定容至刻度線。吸取濾液于旋蒸燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),再加超純水旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥,最后用pH2.2 的檸檬酸鈉緩沖溶液溶解,過0.22μm 水相濾膜過濾,稀釋15 倍后用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Excel 2019 和SPSS 軟件進(jìn)行處理分析,用Origin 2022 作圖。每組樣品做3 次平行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽得率的影響如圖1 所示。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽得率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the yield of polypeptides

由圖1 可知,在底物濃度為5%、接種量8%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率在發(fā)酵的前48 h 明顯升高,超過48 h 后,多肽得率隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸下降,造成這種現(xiàn)象的原因可能是產(chǎn)生的多肽被植物乳桿菌產(chǎn)生的酶分解為更小片段的肽或者氨基酸[20]。因此,選取發(fā)酵時(shí)間24、48、72 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

接種量對(duì)多肽得率的影響如圖2 所示。

圖2 接種量對(duì)多肽得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of polypeptides

由圖2 可知,在底物濃度5%、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率隨接種量的增加而逐漸增加,接種量為8% 時(shí)多肽得率最高,接種量大于8%時(shí)多肽得率開始下降。接種量過小會(huì)造成菌種生長緩慢,不能充分利用核桃蛋白產(chǎn)生多肽,延長發(fā)酵時(shí)間導(dǎo)致發(fā)酵效率較低；較高的接種量雖可以縮短發(fā)酵時(shí)間,但菌體的大量增加會(huì)引起供氧不足,影響發(fā)酵菌種產(chǎn)生蛋白酶,而且會(huì)產(chǎn)生過多代謝物不利于發(fā)酵過程。因此,選取接種量為5%、8%、11%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

底物濃度對(duì)多肽得率的影響如圖3 所示。

圖3 底物濃度對(duì)多肽得率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of polypeptides

由圖3 可知,在接種量8%、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下,多肽得率隨著底物濃度的升高整體呈升高趨勢(shì),底物濃度增加表明植物乳桿菌可利用的原料更多,因此多肽得率也隨之上升。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到5%以上時(shí),隨著底物濃度的升高,多肽得率增加緩慢,考慮到底物濃度為9% 時(shí),離心工作難度較大,也從節(jié)約原料的角度出發(fā),選取底物濃度3%、5%、7%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以發(fā)酵時(shí)間（A）、接種量（B）、底物濃度（C）為試驗(yàn)因素,以多肽得率為指標(biāo),采用L9（34）正交試驗(yàn)探討不同因素對(duì)核桃肽發(fā)酵制備工藝的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示,方差分析結(jié)果如表3 所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

由表2 和表3 可知,核桃肽發(fā)酵制備工藝中對(duì)多肽得率產(chǎn)生影響的各因素順序?yàn)锳>C>B,發(fā)酵時(shí)間為極顯著性影響因素（P<0.01）。核桃肽發(fā)酵制備的最佳工藝為A2B3C3,即發(fā)酵制備核桃肽的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間48 h、植物乳桿菌接種量11%、底物濃度7%。進(jìn)行4 次驗(yàn)證試驗(yàn),平均多肽得率為0.263 0 g/g,略高于正交試驗(yàn)表中最高得率（0.252 3 g/g）。因此,在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí),最佳的發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間48 h、植物乳桿菌接種量11%和底物濃度7%。

2.3 體外抗氧化活性結(jié)果

不同分子量核桃多肽的抗氧化活性見圖4。

圖4 不同分子量核桃多肽的抗氧化活性比較Fig.4 Comparison of antioxidant activities of walnut polypeptides with different molecular weights

由圖4 可知,在核桃多肽濃度大于0.5 mg/mL 時(shí),多肽的抗氧化活性均隨著分子量的降低而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3.0 mg/mL 時(shí),4 種分子量多肽的DPPH 自由基清除能力都很強(qiáng),分子量<3 kDa、3～10 kDa 和全組分多肽的DPPH 自由基清除率分別達(dá)到了94.79%、91.90% 和91.25%。分子量<3 kDa 的多肽的ABTS+自由基清除能力在不同濃度下均顯著高于其他3 種分子量的多肽（P<0.05）,在濃度為2.0、3.0 mg/mL 時(shí),ABTS+自由基清除率分別達(dá)到94.75%和97.42%。在濃度為0.5 mg/mL 時(shí),4 種分子量多肽的超氧陰離子自由基清除能力無顯著性差異,全組分與分子量<3 kDa 多肽的總還原能力差異不顯著,但是它們與3～10 kDa、>10 kDa 多肽的總還原能力存在顯著性差異（P<0.05）。當(dāng)多肽濃度>1.0 mg/mL 時(shí),分子量<3 kDa 多肽的超氧陰離子自由基清除能力和總還原能力顯著升高,遠(yuǎn)超其他3 種分子量的多肽,在核桃多肽濃度為3.0 mg/mL 時(shí),總還原能力和超氧陰離子自由基清除率分別為23.45% 和20.74%。結(jié)果表明,低分子量多肽具備更強(qiáng)的抗氧化活性。

2.4 多肽氨基酸組成及含量

不同分子量多肽的氨基酸組成和含量結(jié)果見表4。

表4 不同分子量多肽的氨基酸組成和含量Table 4 Amino acid composition and content of polypeptides with different molecular weights mg/g

由表4 可知,經(jīng)過超濾分離的3 種不同分子量多肽和全組分多肽氨基酸種類齊全,氨基酸的組成、序列和結(jié)構(gòu)與多肽的抗氧化活性密切相關(guān)[21],疏水性氨基酸可能通過增加肽在脂質(zhì)中的溶解度而在脂質(zhì)氧化抑制中發(fā)揮重要作用[22]。芳香族氨基酸如苯丙氨酸的存在允許電子直接轉(zhuǎn)移至活性氧（reactive oxygen species,ROS）,進(jìn)而體現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化活性[23]。酸性氨基酸能夠螯合金屬離子,組氨酸的供氫能力、誘捕超氧化物自由基及其咪唑基團(tuán)的金屬離子螯合能力對(duì)多肽抗氧化活性有很大貢獻(xiàn)。<3 kDa 的多肽的抗氧化活性明顯高于其他3 種分子量的多肽,一方面可能是<3 kDa的多肽含有的抗氧化氨基酸在4 種多肽組分中含量相對(duì)較高,另一方面可能是低分子量多肽的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)較少,其中的抗氧化氨基酸基團(tuán)充分暴露出來,從而增強(qiáng)其抗氧化活性[24]。

3 結(jié)論

以核桃粕為原料,植物乳桿菌為發(fā)酵菌種,采用液態(tài)發(fā)酵方式,以多肽得率為指標(biāo),通過單因素和正交試驗(yàn),確定植物乳桿菌發(fā)酵核桃粕制備多肽的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量11%和底物濃度7%,在此條件下多肽得率為0.263 0 g/g?？寡趸钚詼y(cè)定結(jié)果表明,隨著多肽分子量的降低其抗氧化活性逐漸增強(qiáng)。在核桃多肽濃度大于0.5 mg/mL 時(shí),分子量<3 kDa 的多肽的DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基清除率和總還原能力均顯著高于其他3 種。氨基酸分析結(jié)果表明,4 種多肽組分的氨基酸種類齊全,<3 kDa 多肽的疏水性、酸性和堿性氨基酸含量均最高。植物乳桿菌發(fā)酵核桃粕制備抗氧化多肽具有很大的潛力。本研究可為核桃粕的充分利用和深入研究提供一定的參考,也為微生物發(fā)酵制備其他功能性多肽提供參考。