馬鼻疽診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀

彭明媛,王 楠,李巧玲,張曉茜,李俊平,牛瑞燕,徐 磊*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西晉中 030801;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 102600)

馬鼻疽(Glanders)病原菌為鼻疽伯克霍爾德氏菌,我國稱為鼻疽桿菌。該病潛伏期從數(shù)天到數(shù)月不等,臨床上分為急性和慢性兩種類型,主要侵害成年馬匹的呼吸系統(tǒng)(鼻型、肺型)、淋巴系統(tǒng)及皮膚,以鼻腔、喉頭、氣管黏膜或皮膚形成鼻疽結(jié)節(jié)、潰瘍和瘢痕,在肺、淋巴結(jié)或其他實(shí)質(zhì)器官發(fā)生鼻疽性結(jié)節(jié)為特征[2]。該病無季節(jié)性,一年四季都可發(fā)生,使役過度、廄舍擁擠、營養(yǎng)不良、感冒和創(chuàng)傷均可誘發(fā)本病[3]。 鼻疽桿菌可通過食物、氣溶膠或皮膚傳播給易感宿主,并能在動(dòng)物間、動(dòng)物和人之間傳染,但人與人之間的傳播較為罕見[4]。因其具有較高的氣溶膠感染風(fēng)險(xiǎn),曾被濫用于生物戰(zhàn)爭[5]。有報(bào)道美國、日本曾有實(shí)驗(yàn)室人員感染馬鼻疽的病例[6],2021年也發(fā)生了一起人類感染病例[7]。目前沒有針對(duì)馬鼻疽的商業(yè)化疫苗,患病動(dòng)物若不接受抗生素治療,其病死率很高[8]。

通過血液檢測(cè)、全面撲殺陽性動(dòng)物和貿(mào)易限制,西歐、北美洲、日本等大多數(shù)地區(qū)已宣布消滅了馬鼻疽,亞洲、中東、非洲和南美洲部分地區(qū)依然存在[9-10]。我國已基本消滅了馬鼻疽,但在2018年8月,重慶市沙坪壩區(qū)發(fā)生馬鼻疽疫情[11]。該病流行的原因主要與邊境貿(mào)易檢疫不當(dāng)有關(guān),應(yīng)加大邊境口岸對(duì)馬鼻疽的檢疫力度。本文就馬鼻疽的診斷方法進(jìn)行歸納總結(jié),為該病的診斷提供參考。

1 病原分離鑒定

該菌是一種不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌,顯微鏡下呈兩端鈍圓、無芽孢、無莢膜的桿狀[12],在4%甘油瓊脂中形成乳白色黏性、小圓形的光滑菌落。鼻疽桿菌可從患病動(dòng)物未破損或未受污染的淋巴結(jié)、皮膚結(jié)節(jié)和血液中分離,含3%甘油的腦心浸潤瓊脂可用來大量培養(yǎng)鼻疽桿菌[13]。該菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長緩慢。BM選擇性瓊脂培養(yǎng)基可以鑒別伯克霍爾德氏菌屬與其他屬細(xì)菌[14],鼻疽桿菌大多能在48 h內(nèi)生長良好,形成圓形、紫色、光滑、大于1 mm的菌落,可用于臨床復(fù)雜環(huán)境中分離病原。

2 分子診斷技術(shù)

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

鼻疽假單胞菌屬具有較近親緣關(guān)系,鼻疽桿菌和類鼻疽伯克菌臨床交叉反應(yīng)較高,普通檢測(cè)方法無法區(qū)分,通過分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行鑒別,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是目前運(yùn)用較多的方法之一。用鼻疽桿菌趨化性motB蛋白的移碼突變?cè)O(shè)計(jì)一種用熒光標(biāo)記引物的傳統(tǒng)雙鏈PCR方法[15],具有100%的特異性,能明確區(qū)分鼻疽桿菌和類鼻疽伯克菌。一種基于2種β內(nèi)酰胺酶基因設(shè)計(jì)混合引物,能鑒別類鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼻疽桿菌和泰國芽孢桿菌的多重PCR[16],可檢測(cè)6023～9561個(gè)基因組當(dāng)量,具有較高特異性和敏感性。

馬鼻疽的分子診斷研究結(jié)合生物信息學(xué),不僅具有高特異性,還有利于馬鼻疽流行病學(xué)的調(diào)查。將補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)為陽性的馬,分離培養(yǎng)得到菌株,基于aroA基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增,結(jié)果顯示陽性,并結(jié)合多位點(diǎn)序列分型和單核苷酸多態(tài)性方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,確定該菌株與中東地區(qū)分離的鼻疽桿菌具有較高親緣關(guān)系。基于 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行馬鼻疽分子診斷對(duì)于該病原的遺傳進(jìn)化關(guān)系具有重要意義,特別是在馬鼻疽流行但尚未確定基因型的地區(qū)[17]。比較3種qPCR方法,通過基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)一段鼻疽桿菌特有序列,并以此設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)[18]。3種qPCR均具有良好特異性和重復(fù)性,但不同方法對(duì)結(jié)果的評(píng)判Cq值標(biāo)準(zhǔn)不一,還需臨床標(biāo)準(zhǔn)樣本對(duì)可疑結(jié)果進(jìn)一步評(píng)估。

PCR方法具有很強(qiáng)的特異性,與基因組學(xué)相結(jié)合不僅可以作為有力的確診手段,還能分析菌株的家族關(guān)系及流行特點(diǎn),有利于對(duì)馬鼻疽的進(jìn)一步防控。但PCR反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性,試驗(yàn)環(huán)境要求較高,不適合臨床快速診斷,可作為臨床樣本輔助診斷技術(shù)。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)易操作、成本低、檢測(cè)迅速,可作為PCR的替代方法。LAMP技術(shù)具有高特異性和靈敏度,可檢測(cè)出≥250 fg的鼻疽桿菌基因組DNA和≥100個(gè)含有目標(biāo)DNA序列的重組質(zhì)粒[19]。該方法有望成為偏遠(yuǎn)地區(qū)代替PCR的更便捷的檢測(cè)技術(shù)。LAMP 技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)相比,由于鼻疽桿菌基因組中存在豐富的G-C區(qū)域,并且在等溫條件下的二級(jí)結(jié)構(gòu),其重復(fù)性不如實(shí)時(shí)熒光定量 PCR[20]。

3 鼻疽菌素試驗(yàn)

鼻疽菌素利用變態(tài)反應(yīng),通過鼻疽桿菌提純鼻疽菌素進(jìn)行點(diǎn)眼反應(yīng),在受感染的動(dòng)物中,眼瞼在1～2 d內(nèi)明顯腫脹,以此診斷是否感染鼻疽桿菌。點(diǎn)眼試驗(yàn)是我國《馬鼻疽診斷技術(shù)》檢測(cè)規(guī)程中指定的檢測(cè)技術(shù)之一,該方法不僅操作簡便,而且特異性及檢出率高,適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)大批次的集中檢疫。對(duì)于急性、開放性及慢性的鼻疽馬均具有很高的診斷價(jià)值,尤其是進(jìn)行5～6 d的間斷反復(fù)點(diǎn)眼檢疫[21]。鼻疽菌素試驗(yàn)對(duì)急性和慢性病例陽性準(zhǔn)確率達(dá)92%,對(duì)年邁病例診斷為陰性結(jié)果的準(zhǔn)確率為96%。在臨床老年病例中,假陽性反應(yīng)可能與鏈球菌等感染有關(guān)[13]。對(duì)沒有臨床癥狀的慢性馬鼻疽以鼻疽菌素點(diǎn)眼作為主要檢查方法,血清學(xué)為輔助檢查方法[22]。近年來,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)已經(jīng)不建議進(jìn)行馬匹的點(diǎn)眼試驗(yàn),但其在臨床上的應(yīng)用并未減少,其實(shí)用性目前無可取代。

4 血清學(xué)診斷

4.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

馬鼻疽是WOAH規(guī)定的必須通報(bào)的人獸共患傳染病,早期發(fā)現(xiàn)和控制該病,對(duì)國際貿(mào)易和當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)至關(guān)重要。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)被列為國際貿(mào)易指定的最準(zhǔn)確和可靠的血清學(xué)試驗(yàn)之一[23]。雖然在老年、妊娠或疲憊動(dòng)物的血清中偶爾會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果,其假陽性率大約占1%(可能由于使用全細(xì)胞的粗制抗原),但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)具有極好的敏感性,能夠檢測(cè)臨床上隱性感染、慢性感染和早期階段,減少疾病的傳播和暴發(fā)[24-25]。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)被WOAH 推薦用于國際貿(mào)易中的馬鼻疽檢疫,不同的包被抗原表現(xiàn)出不同的敏感性和特異性,主要包括全菌、蛋白質(zhì)和膜脂多糖等,以重組蛋白居多,表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性?；谥亟M截?cái)啾蔷覘U菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)A蛋白的間接ELISA[26],其靈敏度和特異性分別可達(dá)100%和98.88%。該方法操作簡單,耗間短,結(jié)果準(zhǔn)確,受人為因素干擾少,適用于大規(guī)模檢測(cè)。通過將BCAL2737a基因表達(dá)的3種蛋白進(jìn)行o-糖基化系統(tǒng)合成保守三糖聚糖,并選其中一種糖蛋白作為包被抗原,結(jié)果顯示出100%的特異性和至少88%的敏感性[27]?；谶@些保守的糖基化蛋白,表現(xiàn)出高度的特異性,為馬鼻疽的診斷提供了新的方向。對(duì)比雙抗原夾心 ELISA 方法和CFT 發(fā)現(xiàn),因其特有的雙抗原,其特異性為99.8%,高于 CFT 97.0%的特異性,并且具有很好的敏感性,可作為馬匹貿(mào)易中血清學(xué)檢測(cè)可行的替代方法[28]。

針對(duì)鼻疽桿菌脂多糖的單克隆抗體被開發(fā)用于馬鼻疽 C-ELISA 抗體檢測(cè)方法的建立[29],該方法具有高特異性和敏感性,能鑒別鼻疽桿菌屬和其他屬別的細(xì)菌,但不能區(qū)分鼻疽桿菌和類鼻疽伯克霍爾德氏菌,二者具有相似的臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)和等位基因圖譜。目前的ELISA檢測(cè)方法不能區(qū)分二者,該方面的探索還需不斷完善。

4.3 虎紅平板凝集試驗(yàn)

虎紅平板凝集試驗(yàn)(rose bengal test,RBT)是一種快速簡單的方法,需要從鼻疽桿菌培養(yǎng)物中純化抗原[30]。RBT具有和鼻疽菌素試驗(yàn)同等的特異性,但敏感性高于鼻疽菌素試驗(yàn),RBT的敏感性約為90%,鼻疽菌素試驗(yàn)的敏感性為75%。鑒于RBT操作簡單、快速和準(zhǔn)確,可作為野外條件馬鼻疽病診斷的一種補(bǔ)充試驗(yàn)[31]。由于在以往的研究中都用了粗抗原,因此需要用純化的抗原(囊狀抗原或脂多糖)進(jìn)一步評(píng)估,盡量減少試驗(yàn)中出現(xiàn)假陽性[32]。

5 小結(jié)與展望

臨床上用于檢測(cè)馬鼻疽的方法主要有分子生物學(xué)和血清學(xué)方法。對(duì)于根除馬鼻疽,臨床上以鼻疽菌素試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為主。鼻疽菌素試驗(yàn)操作簡單,成本低,雖適用于基層大規(guī)模檢疫,但檢測(cè)過程中花費(fèi)時(shí)間較長并需要專業(yè)人員進(jìn)行操作。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的檢測(cè)方法,具有高度敏感性,雖然操作繁瑣,但具有較高的靈敏度,對(duì)于馬鼻疽的凈化具有一定意義。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作簡單,具有高特異性和靈敏度,檢測(cè)樣本容量大,適用于臨床大規(guī)模檢測(cè),提升靈敏度并通過大量臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證,有望成為一種更適用于臨床的血清學(xué)診斷技術(shù)。

沒有兼具高特異性、高敏感性、低成本、又操作簡單快速的適用于臨床的診斷方法,新的抗體診斷方法不斷出現(xiàn),且顯示出良好的應(yīng)用前景?；谖㈥嚵蟹椒êY選到10種特異蛋白抗原,用間接ELISA原理和其中3種抗原建立了一種快速診斷試紙條,可在15 min內(nèi)讀取結(jié)果,具有與CFT同等的敏感性和特異性,適用于臨床快速診斷,需大量臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證和推廣[33]。全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展并結(jié)合納米孔測(cè)序技術(shù)為馬鼻疽的診斷提供了新思路,不僅有助于精細(xì)地闡明病原體的基因組結(jié)構(gòu),而且獲得的序列比PCR方法提供了更高的信息價(jià)值,對(duì)全基因組變異具有高度敏感性和準(zhǔn)確性。為了避免與細(xì)菌分離有關(guān)的問題,采用宏基因組學(xué)方法直接從樣本材料中獲得測(cè)序數(shù)據(jù)為未來提供新的可能性[34]。該方法需在全球數(shù)據(jù)庫的建立和共享為前提下實(shí)現(xiàn)。在無疫苗與合適治療方案的情況下,需改良已有方法建立新的診斷技術(shù),以分子生物學(xué)和血清學(xué)方法為主,研發(fā)成本低、適用性廣、準(zhǔn)確性高的診斷方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)馬鼻疽的精準(zhǔn)檢疫監(jiān)測(cè),減少經(jīng)濟(jì)損失,防止疫情擴(kuò)散,保障人類和動(dòng)物的健康。